Summary

Rapida In Vivo valutazione della funzionalità di generazione i linfociti T citotossici di adiuvante per lo sviluppo di vaccini

Published: June 19, 2018
doi:

Summary

Qui presentiamo un’applicazione per una tecnica immunologica standard (CFSE macchiato OT-ho proliferazione) destinato a monitorare rapidamente adiuvante-mediata di linfociti T citotossici (CTL) generazione in vivo. Questa veloce stima delle capacità CTL è utile per lo sviluppo di vaccini profilattici contro patogeni intracellulari, come pure i vaccini terapeutici del cancro.

Abstract

La valutazione dei vaccini moderni sottounità rivela che la generazione di anticorpi neutralizzanti è importante ma non sufficiente per la selezione di adiuvante. Di conseguenza, adiuvanti con capacità immuno-stimolante sia umorali e cellulari che sono in grado di promuovere le risposte citotossiche (CTL) di linfociti di T sono urgentemente necessari. Quindi, monitoraggio fedele dei candidati adiuvante che inducono cross-priming e successivamente migliorano CTL generazione rappresenta un passo cruciale nello sviluppo del vaccino. Qui vi presentiamo un’applicazione per un metodo che utilizza SIINFEKL specifici (OT-ho) cellule di T per monitorare la cross-presentazione del modello antigene ovoalbumina (uova) in vivo in presenza di candidati diversi adiuvante. Questo metodo rappresenta un test rapido per selezionare adiuvanti con le migliori funzionalità di cross-priming. La proliferazione di CD8+ T cellule è l’indicazione più preziosa di cross-priming ed è anche considerato come un correlato di indotta da adiuvante cross-presentazione. Questa funzionalità può essere valutata in differenti organi immuni come i linfonodi e la milza. Nella misura della generazione CTL possa anche essere monitorata, dando intuizioni sulla natura di un locale (svuotamento linfonodale principalmente) o una risposta sistemica (linfonodi a distanza e/o milza). Ulteriormente questa tecnica permette modifiche multiple per testare i farmaci che possono inibire specifiche vie di cross-presentazione e offre anche la possibilità di essere utilizzato in diversi ceppi di topi convenzionali e geneticamente modificati. In sintesi, l’applicazione che vi presentiamo qui sarà utile per i laboratori di vaccino nell’industria o academia che sviluppano o modificare coadiuvanti chimici per vaccino ricerca e sviluppo.

Introduction

Linfociti T citotossici (CTL) che inducono i vaccini sono fondamentali interventi terapeutici che sono stati sviluppati per combattere alcuni tipi di cancro1. CTL sono anche importanti per vaccini profilattici contro patogeni intracellulari2. Inoltre, CTL sono uno dei meccanismi di difesa immunitario pochi funzionalmente attivi in popolazioni a rischio come neonati3,4 quali dipendono anche CTL per combattere infezioni di vita iniziali5. A questo proposito, i vaccini contro il Virus respiratorio sinciziale (RSV) che sono stati sviluppati con un adiuvante che non suscitare le risposte CTL (allume) ha provocato un completo fallimento del vaccino che porta a gravi complicazioni su infezioni in infanti6. Questi effetti negativi della vaccinazione possono essere invertiti da un CD8+ di risposta delle cellule T7. Precedentemente abbiamo dimostrato che le principali citochine (interferoni di tipo I) suscitate da alcuni stimolatore di agonisti di geni (STING) di interferone sono essenziali per le risposte CTL generate da questi adiuvanti8, in parte misurando la proliferazione delle OT-I T cellule dopo vaccinazione e utilizzando questi risultati come una misura di CTL inducendo capacità osservata in esteso vaccinazione orari9. La misurazione della proliferazione di OT-ho CD8+ T cells in un mouse di destinatario C57BL/6 wild type (WT) di tintura di carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) diluizione è una stima robusta della capacità dell’adiuvante di un vaccino per generare cross-priming di SIINFEKL, (il peptide di immuno-dominante di ovoalbumina, uova). Variazioni di questa tecnica sono ampiamente utilizzati per la valutazione della proliferazione di OT-ho CD8+ e OT-II CD4+ T cellule. Ad esempio, esso è stato utilizzato in assenza delle citochine selezionate (topi KO) o per misurare l’efficacia del vaccino dopo il richiamo dell’antigene negli animali WT. Abbiamo messo a punto un protocollo breve (4 giorni esperimento) in cui dopo il trasferimento passivo di CFSE-macchiato OT-ho CD8+ T cells, una sottocutanea immunizzazione (s.c.) che consiste di una dose di 50 µ g di ovuli privo di endotossina completati con adiuvanti di prova viene somministrata (Figura 1). Il follow-up dei risultati 48 h dopo la vaccinazione fornisce una prova affidabile della capacità dell’adiuvante per generare risposte CTL. Da questa strategia, è possibile valutare la potenza della risposta immunitaria locale nel linfonodo drenante dopo immunizzazione, nonché l’entità della risposta misurando l’attività CTL nella milza (o linfonodi a distanza).

Protocol

Tutti i topi utilizzati in questo studio erano dallo sfondo C57BL/6. Tutti gli animali erano tenuti in condizioni esenti da patogeni. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo la normativa della legge tedesca di protezione animale (TierSchG BGBl. I S 1105; 25.05.1998) e sono stati approvati dal Comitato Bassa Sassonia l’etica di esperimenti di animale e l’ufficio statale (Bassa Sassonia stato ufficio della protezione dei consumatori e la sicurezza alimentare), sotto il numero di permesso 33,4-42502-04-13/1281 e 1…

Representative Results

Al fine di testare i trattamenti utilizzando una diversa combinazione di adiuvanti (ADJ1 e ADJ2), abbiamo valutato la capacità di generazione di CTL misurando la proliferazione di passivamente trasferiti OT-ho CD8+ T cellule mediante citometria a flusso (Figura 2). Per questo, abbiamo precedentemente macchiato le cellule isolate dal drenante nei linfonodi e milza (tabella 1). Misurando la proliferazione di CD8+ T cellul…

Discussion

Moderni vaccini sono idealmente ospita l’antigene purificato e adiuvanti, con l’eventuale aggiunta di un sistema di consegna come liposomi, particelle virus-like, nanoparticelle o vettori dal vivo. Un aspetto fondamentale durante la progettazione di un vaccino è quello di scegliere il giusto adiuvante secondo le necessità cliniche. Parte dell’ambito potrebbe coinvolgere favorendo un umorale vs risposta immunitaria cellulare (o entrambi), l’elezione di un locale vs una risposta immunitaria sistemica (o entrambi) e il ti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati ai nostri assistenti tecnici: U. Bröder e H. Shkarlet, che ci hanno aiutato durante le procedure sperimentali. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla UE sussidi (UniVax, contratto n. 601738 e TRANSVAC2, contratto n. 730964) e una sovvenzione di Associazione Helmholtz (know-IDR). Le fonti di finanziamento non hanno influenzato la ricerca di design, generazione del manoscritto o decisione di inviarla per la pubblicazione.

Materials

BD LSR Fortessa Cell Analyzer BD Special Order Flow Cytometer
CFSE Molecular Probes C34554 Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit Biolegend 480007 Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Molecular Probes L23105 Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 eBioscience 25-0900-82 antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100712 antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 BD 740007 antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer Beckman Coulter 9914591DA Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) Hyglos(Germany) 321000 Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon Corning 352360 Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials Beckman Coulter 899366014 Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2) Harlan (Rossdorf, Germany) Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) Harlan (Rossdorf, Germany) Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes Fischer (Corning) 14-959-5 Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes Fischer (Corning) 05-527-90 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL) Fischer (Gibco) 20-012-027 Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp) Dirk Rossmann GmbH (Germany) 405096 Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane) Abbott Laboratories (USA) 5260.04-05. Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber Parkland Scientific V3000PK Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium Gibco (distributed by ThermoFischer) 11-875-093 Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 15-140-148 Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 10082147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml) Gibco (distributed by ThermoFischer) A1049201 Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes Nunc (distributed by ThermoFischer) 150340 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter CellTrics (Sysmex) 04-004-2317 CellTrics® 50 μm, sterile

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Cite This Article
Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant’s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).

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