Summary
В этой статье мы предоставляем подробный протокол для предоставления видов из рода дрозофилы загрязнителей с целью изучения последствий воздействия на спектр фенотипические выходов на разных этапах своего развития и для более чем одного поколения.
Abstract
Возникающим свойств и внешние факторы (в частности, население уровне и уровне экосистем взаимодействий) играют важную роль в посредничестве экологически важные конечные точки, хотя они редко рассматриваются в токсикологических исследованиях. D. melanogaster становится токсикологии модель для поведенческих, неврологические и генетических последствий токсикантов, чтобы назвать несколько. Что еще более важно виды в роде дрозофилы может использоваться как модель системы для комплексного рамочного подхода к возникающим свойства включить и экологически соответствующие вопросы в токсикологических исследованиях. Цель настоящего документа-обеспечить протокол для разоблачения виды в роде дрозофилы загрязнителей, для использования в качестве модельной системы для ряда фенотипические выходы и экологически актуальные вопросы. Говоря более конкретно, этот протокол может использоваться для 1) связать несколько биологического уровня Организации и понять влияние токсикантов на оба уровня населения и индивидуальные Фитнес; 2) Проверьте влияние токсикантов на разных стадиях развития воздействия; 3) тест между поколениями и эволюционной последствия загрязнителей; и 4) одновременно проверить несколько загрязнителей и стресс.
Introduction
Каждый год, примерно 1000 новых химических веществ будут введены1,химической промышленности2; Однако воздействие лишь небольшой процент этих химических веществ на окружающую среду тестируются перед распределением2,3. Хотя крупномасштабные катастрофы являются редкостью, Сублетальное и хронического воздействия большое разнообразие загрязняющих веществ широко распространены в людей и дикой природы4,5. Исторические экологической токсикологии и экотоксикологии ориентирован для тестирования летальность, одного химического воздействия, острого воздействия и физиологические эффекты воздействия, как средства измерения воздействия загрязнителей на выживание6, 7 , 8 , 9 , 10. Хотя существует сдвиг в сторону этические и неинвазивные подходы к животных испытаний, текущие подходы ограничивают ввиду роли этого развития, возникающим свойств и внешние факторы (например, уровень населения и экосистема уровень взаимодействия) играть в посредничестве экологически важные конечные точки8. Таким образом существует необходимость для методов, которые включают более целостный подход, без ущерба для дикой природы и/или позвоночных в лаборатории.
Беспозвоночных модель системы, такие как Drosophila melanogaster, являются привлекательной альтернативой признается необходимость более целостного подхода к тестированию токсичности. D. melanogaster, первоначально была разработана как система беспозвоночных модель для человека генетических исследований около века назад11. D. melanogaster теперь широко используется как альтернатива позвоночных модель по нескольким причинам: 1) сохранению генов и пути между D. melanogaster и людьми; 2) время коротких поколения по сравнению с позвоночных модели; 3) недорогая стоимость технического обслуживания; 4) легкость в генерации большой выборки; и 5) множество Фенотипические - и экологически соответствующих конечных точек, доступных для тестирования11,12,13,14,,1516,17 .
Несколько лабораторий11,,1516,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 теперь используют D. melanogaster как альтернатива позвоночных модели для тестирования токсичность для понимания воздействия загрязнения на людей. Местных диких видов дрозофилы может использоваться, как хорошо, как модели токсичности для дикой природы (и людей) ответить экологически-, функционально-и эволюционно соответствующие вопросы на разных уровнях биологической организации. С помощью видов в пределах дрозофилы род как модель, несколько измеримые конечные точки являются возможные11,,1516,18,19,20 ,21,,2223,24,25. In addition, с использованием модели дрозофилы , токсикологи может: 1) этически ссылка эффекты на разных уровнях биологической организации; 2) включить роли возникающих факторов и развития; 3) исследование экологически важные конечные точки (помимо медицински важных конечных точек); 4) проверить несколько раздражители одновременно; 5) и долгосрочные испытания между поколениями (например эволюционной и следующим) последствия стресса. Таким образом использование дрозофилы как система модель позволяет множество подходов, не ограничиваясь изучения механистический подходы с инбредных штаммов D. melanogaster в лаборатории.
В этой статье мы представляем методы выращивания и сбора дрозофилы ответить на различные вопросы токсикологические. Говоря более конкретно, мы описываем методологии 1) воспитания дрозофила в среде laced с одного или более загрязнителей; 2) сбор дрозофилы на протяжении развития (например блуждающих третьего возраста личинки, куколки случаев, недавно eclosed взрослых и взрослые); и 3) воспитания дрозофила в загрязненной среде тест между поколениями и следующих передачи, а также эволюционной последствия длительного воздействия токсиканта. Используя этот протокол, предыдущие авторы18,19,20,21,22,23,24,25 сообщили различные генетические, физиологические и поведенческие последствия развития привести (Pb2 +) воздействия. Этот протокол позволяет токсикологи использовать токсикологические более целостный подход, который необходим для понимания, как загрязнители являются факторами риска для людей и дикой природы в все более загрязненной окружающей среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол является экспериментальный протокол, используемый для заднего виды в роде дрозофилы на загрязненной среде когда пероральный прием токсин является целесообразным; другие виды воздействия возможно с использованием дрозофилы модель11,,1516,26. Методы, описанные в настоящем Протоколе ранее были описаны Хирш и др. 19 и Петерсон и др. 23 , 24 , 25.
1. Настройка запасов популяций Drosophila в научно-исследовательской лаборатории
- Настройка экологически контролируемой инкубатора (или маленькой комнате) дом запасов популяций Drosophila , установив инкубаторы для постоянной температуры, света: темные цикла и влажности, в зависимости от предпочтений видов испытаний.
Примечание: Предпочтительным условий окружающей среды будет зависеть родной экологии видов, выбранных для исследования. Например D. melanogaster обитает в субсахарской Африке27 и обычно поддерживается на 25 ° C, 12:12 света: темные цикл и приблизительно 60% влажности16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. с другой стороны, D. Монтана диапазон простирается на протяжении большей части Канады и среднем западе США, намного холоднее региона; Таким образом D. Монтана обычно поддерживается на 19 – 20 ° C, а иногда и 24 h светового режима для имитации условий во время брачного сезона31. Более подробное описание географических квот различных видов дрозофилысм. дрозофила видообразования шаблоны сайта32. -
Получения предпочтительного дрозофилы видов и/или инбредные линии от либо фондовый центр (см. таблицу материалы), еще одна научно-исследовательская лаборатория по запросу, или собирать дикий, генетически переменной населения из поля.
Примечание: Следующие шаги объяснить методы для сбора диких, генетически переменной популяций Drosophila поддерживать в научно-исследовательской лаборатории. Эти методы были изменены Markow и о ' Грейди33 и34 Вернер и Jaenike для сбора широкое разнообразие видов сразу, вместо того, чтобы цели отдельных видов с одним источником приманки.- Заморозить полдюжины спелые бананы в морозильную камеру на ночь и размораживать перед установкой приманка ловушки.
- Подготовьте несколько 1 – 2 Л пластиковых бутылок, резка u образный разрез передней бутылку, чтобы позволить мух быть захвачен в бутылке приманки и не бежать. Крышки пластиковые бутылки с их бутылочных крышек так мухи не бежать через крышки.
- Добавьте размороженные банан в нижней части бутылки, так что в нижней части бутылки содержит примерно один дюйм банана. Поместите кусочек спелый помидор в бутылке. Добавьте дрожжи пульпы (остатки дрожжей от процесса приготовления пива) в банан в нижней части бутылки, чтобы банан получает замочить в дрожжевой суспензии.
- Добавьте деревянные палочки (в вертикальном положении вертикального) к бутылке, чтобы мух имеют чистой подложки уйти дрожжевой суспензии и банан.
Рисунок 1 иллюстрирует конечный продукт этих методов. - Hang приманку бутылки в деревья на ночь и проверьте, что каждые 24 ч. рот аспирата вылетает из бутылки и индивидуально место женщины в флаконах с среднего для создания iso девушки линий.
Примечание: Мульти женской линии могут создаваться, однако, только если самки каждого вида могут быть четко определены. Кроме того мух в род дрозофилы занимают различные экологические ниши и будут иметь различные диетические требования, зависящ на эти ниши (Вернер и Jaenike34); Смотрите Вернер и Jaenike34 диетические рекомендации и рецепты пищи. - Изучить взрослых F1 потомство под микроскопом диссекции для идентификации видов, собранных дрозофилы (см. Markow и о ' Грейди33 и34 Вернер и Jaenike для помощи в определении различных видов ).
Рисунок 1 : Живописные представительства ловушки и приманки используются для сбора диких популяций Drosophila в поле. (A) Fly ловушки набор на местах сайте в Колорадо. (B) ближе зрения летать ловушки набор на этом сайте поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Сохранить iso самка или линии нескольких женщин в экологически контролируемой инкубатора или номер с постоянной температуры, света: темные цикла и влажности. Чтобы сделать это, дом мухи во флаконах или бутылки в предпочитает среднего и позволяют беременных самок откладывают яйца в среде. Контролировать флаконов на наличие личинок и куколок.
Примечание: Мух в род дрозофилы занимают различные экологические ниши и будут иметь различные диетические требования и экологических абиотических предпочтения, зависящ на эти ниши33,34. Окружающей среды предпочтения и диетических рекомендаций (и дальнейшего обучения на лету животноводства) можно найти в Элгине и Миллер28, Шаффер и др. 29,30галантного и Стокер, Markow и о ' Грейди33и Вернер и Jaenike34. Если поймали дикого вида, местные экологические условия можно смоделировать в инкубаторы до тех пор, пока вида могут быть определены. - Передачу запасов часто свежие средний, отбрасывая старые флаконов, чтобы поддерживать здоровый линии и избежать инфекции от клещей.
Примечание: Частоту передачи будет зависеть от жизненного цикла видов. Например передача Drosophila melanogaster каждые 2 недели до свежие среднего. Для получения дополнительной информации о поддержании линий в лаборатории, смотрите Rand и др. 16, Элгин и Миллер28, Шаффер и др. 29,30галантного и Стокер, Гринспен35и науки образования базы36.
2. Задние дрозофила в загрязненной среде
Примечание: Если тестирование дрозофила в лаборатории в первый раз или с новым contaminant(s), определение летальной дозы (см. Кастанеда и др. 37 и Мэсси и др. 38 для методов) и ЛД50 (см. Кастанеда и др. 37 и Акинс и др. 39 для методов) первый. Затем запустите кривой доза ответ для выявления биологически отношение концентрации для требуемого фенотипические; Просмотреть Хирш и др. 19 и Чжоу и др. 40 для методов.
- Подготовка запасов решения загрязненной среды на желаемый concentration(s), в зависимости от химического загрязнения.
Примечание: К примеру, для подготовки запасов решений ККПБ: подготовка запасов решения свинца ацетата (ККПБ) среды, добавив загрязнителем в дистиллированной воде (dH20) до среднего, с загрязняющими вода достигает желаемой концентрации. Например, Стоковый раствор 1000 мкм ККПБ, может быть подготовлен путем добавления ККПБ dH20 до тех пор, пока он достигает 1000 мкм ККПБ. Кроме того, разбавляют запасов раствор (например 1000 мкм ККПБ) до нужной концентрации (например, 500 мкм ККПБ) и поддерживать эти решения как запас также. - Подготовка среднего, следующие производителя руководящих принципов в качестве средства управления. Подготовить дополнительные средства, следующие производителя руководящих принципов; Однако дополнение подготовлено загрязнений раствор для dH20.
Примечание: например, при использовании мгновение дрозофилы среднего, добавьте примерно одна чайная ложка мгновенного среднего в пластиковом флаконе. Добавьте примерно 5 – 5,5 мл dH20 на носитель. Посыпьте несколько зерен живых дрожжей хлебопекарных подготовить среды управления. Подготовить экспериментальный среднего, дополнение Стоковый раствор (например, 500 мкм ККПБ) для dH20. -
Перевести репродуктивно жизнеспособные Зрелые самцы и самки из запасов популяций в управления и экспериментальной среде.
Примечание: После eclosion время до репродуктивного погашения отличается между дрозофилы видов41.- Аккуратно нажмите флакон запасов мух вниз с доминирующей рукой. Убедитесь, что мухи автоматически перейти к нижней части флакона. С другой стороны снять крышку с флакона при касании флакона и место свежие флакон контроля или загрязненной среды на верхней части флакона с мух. Сплачивают флаконы и перевернуть их, мягко разговоров, так что мух автоматически передаются свежие флакона контроля или загрязненной среды. Хотя по-прежнему выстукивать флакона с мух, Крышка флакона.
- Повторите с более флаконов, убедившись в том стандартизировать количество мух в каждом флаконе.
Примечание: Общее количество взрослых переданы через единый передачи или анестезии будет зависеть от размера флаконы используются во избежание переполненности. - Инкубировать взрослых в стандартные условия окружающей среды (т.е. инкубатор) и позволяют взрослых спариваются и откладывают яйца в средстве для 24-96 ч.
- После 24-96 h, отказаться от взрослых в МОРГ (колбу заполнены с минеральным маслом и ограничен с воронкой облегающие) оставив оплодотворенные яйца (которые позже станет экспериментальной субъектов) чтобы созреть для тестирования. Место флаконов в инкубаторе разрешить яйца, чтобы развиваться.
- Отслеживать флаконы для блуждающих instar личинки, ищет личинки, которые выходят из среды.
3. сбор экспериментальных субъектов на различных этапах своего развития
Примечание: Экспериментальная предметы могут быть собраны на любой стадии развития, помещенные в слепой закодированных 15 мл конические трубы и испытаны для накопления. Методы для тестирования накопления загрязнителей будет зависеть от загрязнения изучаются. Например накопление ККПБ может испытываться с использованием Inductively-Coupled плазменной масс-спектрометрии (ИСП-МС)42. Кроме того экспериментальные предметы могут быть собраны на любой стадии развития для проверки на различных Фенотипическая воздействию загрязняющих веществ. Рисунок 2 иллюстрирует жизненный цикл дрозофилы 43. На рисунке 3 показана экспериментальный протокол для экспозиции и различные этапы развития для коллекции.
Рисунок 2 : Концептуальный обзор жизненного цикла D. melanogaster (наиболее часто используемые модели системы дрозофилы ). На этапах цикла жизни дрозофилы являются: 1) яйцо, личинка 2) первой instar, 3) второй instar личинка, 4) третьего instar личинка, 5) бродил третьего возраста личинки, куколки 6) белоглазка, 7) красных куколки, 8) недавно eclosed взрослых и 9) зрелого взрослого. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Концептуальный обзор методов устно подвергая дрозофилы загрязненной среды в родительский (F0) и последующих поколений (F1 и более поздние версии). (A) методы для перорального воздействия во время разработки в открытые поколения. (B) методы для тестирования передачи загрязнителей потомство (F1 до желаемого поколения). Эта цифра была изменена с Петерсон и др. 24 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
-
Собирать блуждающих третьего возраста личинок
- Начните мониторинг флаконов, когда загорается в инкубаторе, как личинки выходят из среды и двигаться вверх на стороне флакона в течение часов после того, как светятся в инкубаторе. В этой h удалите блуждающих третьего возраста личинок из сторон флакона тщательно с помощью деревянной палочкой или пинцетом.
Примечание: Количество личинок для коллекции будет зависеть количество яиц в «2.3.4». - Чтобы удалить избыток среднего из личинки, место личинки в небольшой стакан с dH2O. Pour dH2O из стакан и место личинки на деликатную задачу стеклоочистителя. Используя деликатную задачу стеклоочистителя, осторожно удалите избыток dH2O из личинки.
- Поддерживать экспериментальные популяции в инкубаторе экологически контролируемой.
- Начните мониторинг флаконов, когда загорается в инкубаторе, как личинки выходят из среды и двигаться вверх на стороне флакона в течение часов после того, как светятся в инкубаторе. В этой h удалите блуждающих третьего возраста личинок из сторон флакона тщательно с помощью деревянной палочкой или пинцетом.
-
Собирать взрослых недавно eclosed
- Флаконов монитор для eclosion, наблюдая окраску куколок по бокам флаконов.
Примечание: Куколок будет темнее во время разработки. Развития времени, особенно до eclosion, зависит от видов испытания. - Когда первый взрослые начинают Эклоз, дамп и отбросить эти взрослые в морге, содержащих минеральные масла.
- Когда огни в инкубаторе включите следующее утро, дамп и отменить любые взрослых неизвестного возраста (или девственности), которые могут иметь eclosed на ночь или во время morningbefore огни на.
- Приблизительно 4 ч позже, анестезировать взрослых, которые появились как недавно eclosed взрослых с CO2 пушки во флаконах. Место взрослых на CO2 пластины под микроскопом рассечение. Секс взрослых ищет секс расчески на передние конечности мужчин и ovipositors женщин.
Примечание: D. melanogaster должны быть собраны в течение 6 ч eclosion избежание спаривания, но другие виды могут иметь больше развития раз (и, следовательно, не нужно быть собраны в течение этого периода времени). - Отдельных взрослых на CO2 пластины с помощью деревянной палочкой. Аккуратно передачи взрослых секс специфических групп с помощью деревянной палочкой для средних сопоставления существующей истории.
- Флаконов монитор для eclosion, наблюдая окраску куколок по бокам флаконов.
-
Сбор зрелых взрослых после eclosion
- Позволяют взрослым оставаться на средних подходящих предварительно eclosion воздействия от стадии яйца желаемый возраст после eclosion в инкубаторе экологически контролируемой.
- Поодиночке передачи взрослых в средство контроля за 24 часа до начала испытаний чтобы позволить взрослых жениха избыток загрязненной среды их тела.
4. задняя экспериментальной предметы для тестирования эффекты поколениями или Transgenerational воздействия.
- Сзади родительского поколения (ака P0 или F0 поколений), передачи взрослых от запасов населению управления и экспериментальной среды следующих шагов в «2.1» «2.3» и «3.1» до «3.3».
- Когда взрослые репродуктивно Зрелые (см. Pitnick и др. 41), поодиночке один флакон самцов к свежим флакон контроля или экспериментальной среды передачи (как указано в разделе 2.3.1). Поодиночке передать один флакон самок свежие пузырек, который теперь содержит мужчины. Разрешить взрослых мате и откладывают яйца в среде для 24-96 h. дампа и отказаться от взрослых в морге, содержащих минеральные масла и повторно инкубировать флаконов разрешить потомство развивать.
- Повторите шаги 4.1 через 4.2 в зависимости от желаемого количества поколений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Устно подвергая дрозофилы до contaminant(s) на протяжении всего развития, различные токсикологические вопросы может быть проверена подвергая дрозофилы на разных уровнях биологической организации. В этом разделе представлены представителем результаты, полученные с помощью этого протокола в ранее опубликованных работ23,24. В частности этот протокол ранее использовался для оценки накопления, ликвидации и поглощения свинца (Pb) в пределах одного поколения облучения и через первого поколения потомков23; и изучить последствия накопления на Мате выбор24.
В таблице 1 и на рисунке 4 показать представителя результаты, полученные с помощью этого протокола для определения накопления и ликвидации Pb в F0 и поколения1 F.
Таблица 1 показывает представитель результаты свидетельствует о накопления Pb при воздействии в течение поколения (при различных дозах: 0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 и 500 мкм ККПБ) в образцах, тестирование на нескольких этапах своего развития (блуждающих третьего возраста личинок, куколки случаев, недавно eclosed взрослых и зрелых женщин и мужчин) в Петерсон и др. 23 . на различных этапах своего развития, Замороженные при температуре-20 ° C, относились с азотной кислоты и перекиси водорода и испытаны для Pb, с помощью ICP-MS23,42были собраны пробы.
| Доза (ККПБ мкм) | Личинка | Куколки случаи | Недавно Eclosed взрослых | Зрелые самки | Взрослых самцов |
| 0 | 0,009 ± 0.001 | 0,099 ± 0,02 | 0,04 ± 0,005 | 0.069 ± 0,031 | 0,0015 ± 0,003 |
| 10 | 0,42 ± 0,025 | 0.46 ± 0,03 | ± 0,12 0.009 | 0.12 ± 0,012 | 0,056 ± 0,008 |
| 40 | 7.5 ± 0.67 | ||||
| 50 | 5.2 ± 0.71 | 2.77 ± 0.30 | 1.11 ± 0,14 | ||
| 75 | 14 ± 1.06 | ||||
| 100 | 12 ± 0,95 | 4.7 ± 0,38 | 3.36 ± 0,58 | 1.20 ± 0,63 | 1.24 ± 0.46 |
| 250 | 89 ± 8.49 | 25.06 ± 4.72 | 5.46 ± 0,75 | ||
| 500 | 271 ± 41.01 | 334.30 ± 39,43 | 8.44 ± 0,84 | 46,50 ± 14.72 | 14.43 ± 1,83 |
Таблица 1: означает Pb нагрузок (нг/индивидуальные) испытания в D. melanogaster во время разработки после перорального воздействия от стадии яйцо этап испытаний для Pb. Средства (нг/Муха) показано среднее ± стандартная ошибка (n = 8 личинок, n = 3 взрослых управления воспитал, n = 3 взрослых, Pb выращивают). Дикого типа D. melanogaster воспитывались на элемент управления или этилированного среднего (0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 или 500 мкм ККПБ) от стадии яйца на различных этапах развития. Образцы были собраны и протестированы для накопления Pb, с помощью ICP-г-жа42 , которую эта таблица была изменена с Петерсон и др. 23
На рисунке 4родительского поколения (F0) подвергался Pb из яйцеклетки этапов до совершеннолетия, вязка в среде управления, и первое поколение потомства (F1) были выращены в среде управления до совершеннолетия24. Методы обнаружения накопления Pb и ликвидации были аналогичны Петерсон и др. 23. Результаты этого эксперимента указывают, что родительский экспозиции не передается для первого поколения взрослых потомство24. Таким образом используя этот протокол, можно протестировать адаптационного реагирования на различные эволюционные весы, а также следующих последствий воздействия F0 . Аналогичные результаты были найдены в Петерсон и др. 23
Рисунок 4: Накопления Pb в D. melanogaster (A) родители (F0) и (B) неэкспонированные потомство (F1). Бары в (A) и (B) показывают среднее (нг/взрослый) ±SEM. размеры выборки показано выше баров в (A) и (B). = p < 0,001. (A) F0 взрослых устно подвергаются 250 мкм ККПБ, используя этот протокол от стадии яйца до возраста 5 d после eclosion и собранных возраст 6 дней после eclosion (после 24 ч очищение) проверяется для накопления Pb, с помощью ICP-г-жа42(B) F0 взрослых были вязка в течение лечения в среде управления. Неэкспонированные F1 потомства были выращены в среде управления от стадии яйца до совершеннолетия (используя этот протокол) и протестированы для накопления Pb, с помощью ICP-MS. В (Б): «CF + см»= F1 взрослых с родителями воспитал в среде управления, «CF + PbM» = F1 взрослых с отцами, выращенные в этилированном среде, «PbF + см» = F1 взрослых с матерями, выращенные в этилированном среде, «PbF + PbM» = F1 взрослых с родителями выращенные в этилированном среде. Эта цифра была изменена с Петерсон и др. 24 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Результаты представлены в таблице 1 и на рисунке 4 , указывают, что дрозофилы легко накапливается Pb в разных дозах, этапы развития и эволюционной весы, используя этот протокол. Таким образом это указывает на эффективность протокола подвергая D. melanogaster устные загрязнителем.
На рисунке 5протокол, описанные здесь использовалось Петерсон et al. 24 для проверки последствий воздействия развития Pb на Мате предпочтения. Экспериментальная предметы воспитывались от стадии яйца до совершеннолетия по контролю или этилированного среднего яйцо стадии взросления и испытаны для мат предпочтения после 24 ч очищение. Петерсон и др. 24 найдено, что Pb подвергаются женщины преференциально повязана с Pb подвергаются мужчины, когда предоставляется возможность управления или Pb подвергаются мужчины. Эти результаты являются одним из представителем примеров осуществления протокола для изучения фенотипические вывода.
Рисунок 5: Мат предпочтения у самцов и самок, подвергается 250 мкм ККПБ из яйца этап взросления. Бары в (A), (B) и (C) показывают среднее (%) спаривания успеха (в 60 минут) ± SEM. *** = p < 0,001. * = p < 0,05. Экспериментальная предметов в (A), (B) и (C) подвергаются контролю или этилированного среднего (250 мкм ККПБ) от яйцо этапов становления зрелого возраста и испытаны на различия в выборе мат. (A) женский предпочтение либо управления или Pb выращенные мужчины (т.е. двух выбор тест). Размеры выборки были: N = 126 самок управления воспитал и 137 Pb выращенные самок. (B) мужской предпочтение для управления и Pb воспитал самок (т.е. двух выбор тест). Размеры образцов были: N = 59 управления выращенные мужчины и N = 64 Pb выращенные мужчины. (C) мат предпочтения у самцов и самок, когда поодиночке в паре с одним партнером или воздействия (т.е. нет выбор тестов). В (C): «CF + см» = один воспитал управления девушки в паре с одного управления выращенные мужчины (N = 85 пар), «CF + PbM» = один воспитал управления девушки в паре с одним Pb выращенные мужчины (N = 79 пар), «PbF + см» = один Pb выращенные девушки в паре с одного управления выращенные мужчины (N = 91 пар), «PbF + PbM» = Pb воспитанная женщина + один мужчина, Pb выращенные (N = 98 пар). Эта цифра была изменена с Петерсон и др. 24. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila melanogaster был создан как мощная модель для целого ряда биологических процессов из-за обширной сохранению генов и пути между людей и D. melanogaster 13,14. По тем же причинам, что это мощная модель для медицинской науки дрозофила стала систему подходящую модель для изучения последствий антропогенного загрязнения на ряд токсикологических. Некоторые лаборатории успешно используют D. melanogaster как модель системы для изучения ряда соединений, в том числе тяжелых металлов11,16,18–25,37 ,,3839,40,,4445, этанол46, наночастицы26,47, пестицидов48 и растворителей49. Несмотря на недавние усилия по использованию дрозофилы как модель токсикологии ее использование в качестве модельной системы для ответа на бесчисленных токсикологические вопросы находится еще в зачаточном состоянии. Однако учитывая ее широкое использование как модель для конечных точек, связанных с медицинской точки зрения, а также его использование в экологически50 и эволюционные исследования17, ее потенциал как токсикологические модель системы огромен.
Здесь мы представляем методы для выращивания различных видов в пределах рода дрозофилы на загрязненной среды для тестирования различных токсикологических. Хотя возможны и другие формы воздействия с помощью дрозофилы как модель (например ингаляции и трансдермальном воздействии), этот протокол фокусируется на устные потребление загрязнителей, необходимый для загрязняющих веществ, которые, естественно, будет попадает ( такие как через пищевую цепь). Эти методы могут разместиться использование нескольких видов дрозофилы и загрязнений. Дикий, генетически переменной популяций Drosophila может быть собрана в поле и в научно-исследовательской лаборатории. Существует множество вариантов ловушки и приманки, которые могут использоваться, в зависимости от видов пищевых предпочтениях; Путеводители по коллекции полей см Markow и о ' Грейди33 и34Вернер и Jaenike. Кроме того методы могут быть изменены для определения последствий развития воздействия на различные критические периоды развития и позволяет для долгосрочного поколений тестирования воздействия загрязняющих веществ.
Важнейшие шаги эти методы включают в себя: (1) поддержание летать запасов в экологически контролируемых условиях, (2) во избежание переполненности летать населения, (3) разбавления тест загрязнителем согласно его химических свойств и (4) выбор биологически отношение концентрации загрязнений тест. Сохранение запасов в экологически регулируемых инкубаторы (или маленькой комнате) гарантирует, что дополнительные различия в экологических условиях не смешивать результаты. Кроме того сезонные изменения в поведении ранее были найдены51 и несколько видов дрозофилы введите диапауза над зимой52. Во-вторых, личинок переполненность может иметь долгосрочные последствия для развития30, размер взрослого организма30и долговечность53. Кроме того разбавления загрязнения является важным шагом для обеспечения что загрязнения биологически доступен для дрозофилы для накопления загрязнения. К примеру ККПБ растворяется в dH2O23,24,25, тогда как другие химические вещества, возможно, потребуется быть растворены в соленой воды или этанола. Выбор биологически соответствующих концентраций загрязнителя может повлиять на направление результатов; например низкие дозы ККПБ увеличить среднее число женщин, спаривания самцов (в течение 20 мин.), тогда как более высокие дозы показывают значительное сокращение среднее количество женщин спаривания19. Для выявления биологически-концентрация загрязнителя тест, читатели следует рассмотреть возможность запуска предварительные исследования для определения и смертельная доза LD50 для определения соответствующей дозы для выполнения кривой доза реакция. Выполняя кривой доза ответ для проверки диапазона концентраций на определенной конечной точки, читатели могли определить доз, которые являются «полезными» или «опасные» для отдельных лиц или групп населения для дальнейшего тестирования.
Этот протокол предоставляет возможность определить: 1) взаимодействие нескольких биологического уровня Организации на фитнес и токсикологических; 2) роль развития и возникающих факторов; 3) экологически важные конечные точки; 4) медицински важные конечные точки; 5) как несколько стресса взаимодействуют для достижения результатов; и 6) последствий долгосрочного воздействия, которое выходит за рамки поколений. Чтобы проиллюстрировать эффективность этого протокола, было представлено доказательств, указав, что лиц, подвергающихся на протяжении развития накопления Pb (Таблица 1)23,24. Кроме того, представитель результаты показывают, что этот протокол может использоваться для проверки последствий воздействия на экологически важных конечных точек (например., последствий развития Pb воздействия на выбор Мате24). Кроме того, другие проверили воздействие загрязнителей на нескольких уровнях биологической организации (включая физиологических18,21, генетических20,22 и фенотипические уровни19 , 23 , 24 , 25), медицински важных конечные точки18,20,21,22,23и долгосрочные эффекты между поколениями23,24 25, ,54. Кроме того предварительные данные показывают, что развития Pb экспозиции индуцирует следующим эпигенетические последствия на плодовитость в D. melanogaster54. Важное ограничение этого протокола является, что использование этого протокола с дрозофилы находится в зачаточном состоянии. Таким образом существуют ограниченные издания18,19,20,21,,2223,24,25 адрес протокола возможность ответить на Дополнительные токсикологические вопросы, как роль развития и возникающих факторов, дополнительные экологически важные конечные точки, несколько стресс и эволюционной последствия воздействия.
Используя этот протокол, читатели можно проверить загрязняющих веществ, которые естественно попадает с помощью биологически соответствующих методов. Непрерывная жидкого кормления, разработанный Соареш и др. 55 -это альтернативный подход для перорального приема, особенно для воздействия пестицидов. Однако непрерывная жидкого кормления для взрослых заглатывания жидких загрязнений и не применимо к загрязнениям где лица могут быть подвергается предварительной eclosion. Это особенно важно, учитывая потенциал для критических периодов развития для экспозиции. Предыдущие исследования показали критический период для Pb экспозиции23. Таким образом дрозофилы должны подвергаться на протяжении развития во избежание потенциальных активных ликвидации загрязнений дрозофилы до испытания до критических периодов может быть определено.
В целом мы предоставили протокол подвергать устно дрозофилы загрязнений. Используя этот протокол и модель системы, токсикологи могут сдвиг в сторону этические и неинвазивные подходы животных испытаний, объединяя более целостный подход к пониманию воздействия загрязнителей8одновременно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта публикация была поддержана грантом от Департамента образования (PR-премии #P031C160025-17, название проекта: 84.031 C) университета штата Колорадо-Пуэбло (CSU-Пуэбло) общинам создавать активные стволовые участия (C-BASE). Мы благодарим текущего зоологии и Elsevier за предоставление права на использование представитель результаты опубликованы в предыдущих документах, а также редакторы JoVE за предоставленную нам возможность опубликовать этот протокол. Мы также хотели бы поблагодарить C-BASE программы, д-р Брайан Vanden Хойвель (C-BASE и кафедра биологии, CSU-Пуэбло), кафедра биологии CSU-Пуэбло, Томас Грациано, д-р Бернард Possidente (кафедра биологии, колледж Скидмор) и д-р Клэр Вариан Рамос (Кафедра биологии, Университет штата Колорадо-Пуэбло) за их поддержку и помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24 | Carolina Biological | 173204 | |
| Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit | Genessee Scientific | 32-116SB | Used to store flies |
| Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials | Genessee Scientific | 49-102 | Used to store flies |
| Cardboard trays, trays only, narrow | Genessee Scientific | 32-124 | Used to organize populations of flies |
| Cardboard trays, dividers only, narrow | Genessee Scientific | 32-126 | Used to organize populations of flies |
| Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure | Fischer Scientific | 03-312D | Useful for storage of contaminants |
| Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles | Fischer Scientific | 03-409-17C | Useful for storage of contaminants |
| Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser | Fischer Scientific | 14-287-150 | Used to prepare medium |
| Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips | Fischer Scientific | 13-683-708 | Used to prepare medium |
| Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm) | Genessee Scientific | 59-114 | Used to anesthetize flies |
| Flystuff foot valve | Genessee Scientific | 59-121 | Used to anesthetize flies |
| Tubing, green (1 continguous foot/unit) | Genessee Scientific | 59-124G | Used to anesthetize flies |
| Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle | VWR | 97064-130 | Used to make a morgue |
| Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2 | Walmart | Not applicable | Used to make a morgue |
| BGSET5 Glass Beaker Set Of 5 | Walmart | ||
| Inbred or wildtype line of Drosophila | Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University | https://bdsc.indiana.edu | |
| Wild popultions of Drosophila | UC San Diego Drosophila Stock Center | https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php |
References
- Postel, S. Defusing the Toxics Threat: Controlling Pesticides and Industrial Waste. , Worldwatch Institute. Washington, DC. (1987).
- Vitousek, P. M., Mooney, H. A., Lubchenco, J., Melillo, J. M. Human domination of earth's ecosystems. Science. 277, 494-499 (1997).
- United Nations Environment Program (UNEP). Saving Our Planet: Challenges and Hopes. , UNEP. Nairobi. (1992).
- Hansen, L. J., Johnson, M. L. Conservation and toxicology: Integrating the disciplines. Conservation Biology. 13, 1225-1227 (1999).
- Johnston, E. L., Mayer-Pinto, M., Crowe, T. P. REVIEW: Chemical contaminant effects on marine ecosystem functioning. Journal of Applied Ecology. 52, 140-149 (2015).
- Dell'Omo, G. Behavioral ecotoxicology. , John Wiley & Sons, LTD. West. Sussex, UK. (2002).
- Clotfelter, E. D., Bell, A. M., Levering, K. R. The role of animal behaviour in the study of endocrine-disrupting chemicals. Animal Behaviour. 68, 665-676 (2004).
- Peterson, E. K., Buchwalter, D. B., Kerby, J. L., LeFauve, M. K., Varian-Ramos, C. W., Swaddle, J. P. Integrative behavioral ecotoxicology: bringing together fields to establish new insight to behavioral ecology, toxicology, and conservation. Current Zoology. 63, 185-194 (2017).
- Scott, G. R., Sloman, K. A. The effects of environmental pollutants on complex fish behaviour: Integrating behavioural and physiological indicators of toxicity. Aquatic Toxicology. 68, 369-392 (2004).
- Zala, S. M., Penn, D. J. Abnormal behaviors induced by chemical pollution: A review of the evidence and new challenges. Animal Behaviour. 68, 649-664 (2004).
- Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic & Applied Medicine. 1, 33-38 (2013).
- Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology and medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacology Reviews. 63, 411-436 (2011).
- Rubin, G. M., et al.
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32, 74 (2010).
- Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1.12.1-1.12.20 (2015).
- Burke, M. K., Rose, M. R. Experimental evolution with Drosophila. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296, R1847-R1854 (2009).
- He, T., Hirsch, H. V. B., Ruden, D. M., Lnenicka, G. A. Chronic lead exposure alters presynaptic calcium regulation and synaptic facilitation in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 30, 777-784 (2009).
- Hirsch, H. V., et al. Behavioral effects of chronic exposure to low levels of lead in Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 24, 435-442 (2003).
- Hirsch, H. V. B., et al. Variations at a quantitative trait locus (QTL) affect development of behavior in lead-exposed Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 30, 305-311 (2009).
- Morley, E. J., Hirsch, H. V. B., Hollocher, K., Lnenicka, G. A. Effects of chronic lead exposure on the neuromuscular junction in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 24, 35-41 (2003).
- Ruden, D. M., et al. Genetical toxicologenomics in Drosophila identifies master- modulatory loci that are regulated by developmental exposure to lead. NeuroToxicology. 30, 898-914 (2009).
- Peterson, E. K., et al. Accumulation, elimination, sequestration, and genetic variation of lead (Pb2+) loads within and between generations of Drosophila melanogaster. Chemosphere. 181, 368-375 (2017).
- Peterson, E. K., et al. Asymmetrical positive assortative mating induced by developmental lead (Pb2+) exposure in a model system, Drosophila melanogaster. Current Zoology. 63, 195-203 (2017).
- Peterson, E. K. Consequences of developmental lead (Pb2+) exposure on reproductive strategies in Drosophila. , University at Albany-State University of New York. Dissertation (2016).
- Chifiriuc, M. C., Ratiu, A. C., Popa, M., Ecovolu, A. A. Drosophotoxicology: An emerging research area for assessing nanoparticles interaction with living organisms. International Journal of Molecular Sciences. 17, 36 (2016).
- Lachaise, D., Cariou, M. L., David, J. R., Lemeunier, F., Tsacas, L., Ashburner, M. Historical biogeography of the Drosophila melanogaster species subgroup. Evolutionary Biology. 22, 159-225 (1988).
- Elgin, C. R., Miller, D. W. Mass rearing of flies and mass production and harvesting of embryos. The Genetics and Biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, 112-121 (1978).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, C. R. Chapter 5: Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods in Cell Biology. 44, 99-108 (1994).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Jennings, J. H., Etges, W. J., Schmitt, T., Hoikkala, A. Cuticular hydrocarbons of Drosophila montana: geographic variation, sexual dimorphism and potential roles as pheromones. Journal of Insect Physiology. 61, 16-24 (2014).
- Drosophila Speciation Patterns. , http://www.drosophila-speciation-patterns.com/rangemaps.html. (2018).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. London. (2005).
- Werner, T., Jaenike, J. Drosopholids of the midwest and northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester NY. (2017).
- Greenspan, R. J. The basics of doing a cross. Fly Pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 3-24 (1997).
- JoVE Science Education Database. . Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Castañeda, P. L., Muñoz, G. L. E., Durán, D. A., Heres, P. M. E., Dueñas, G. I. E. LD50 in Drosophila melanogaster. fed on lead nitrate and lead acetate. Drosophila Information Service. 84, 44-48 (2001).
- Massie, H. R., Aiello, V. R., Whitney, S. J. P. Lead accumulation during aging of Drosophila and effect of dietary lead on life span. Age. 15, 47-49 (1992).
- Akins, J. M., Schroeder, J. A., Brower, D. L., Aposhian, H. V. Evaluation of Drosophila melanogaster as an alternative animal for studying the neurotoxicity of heavy metals. BioMetals. 5, 111-120 (1992).
- Zhou, S., et al. The genetic basis for variation in sensitivity to lead toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Health Perspectives. 124, 1062-1070 (2016).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Delayed male maturity is a cost of producing large sperm in Drosophila. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 92, 10614-10618 (1995).
- Beauchemin, D. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82, 4786-4810 (2010).
- Tyler, M. S. Development of the fruit fly Drosophila melanogaster. Developmental Biology, a Guide for Experimental Study. Tyler, M. S. , 2nd, Sinauer Associates Inc. Sunderland, MA, USA. 8-27 (2000).
- Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107, 416-426 (2009).
- Bonilla, E., Contreras, R., Medina-Leendertz, S., Mora, M., Villalobos, V., Bravo, Y. Minocycline increases the life span and motor activity and decreases lipid peroxidation in manganese treated Drosophila melanogaster. Toxicology. 294, 50-53 (2012).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 199-228 (2003).
- Posgai, R., Cipolla-McCulloch, C. B., Murphy, K. R., Hussain, S. M., Rowe, J. J., Nielsen, M. G. Differential toxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles on Drosophila melanogaster development, reproductive effort, and viability: size, coatings and antioxidants matter. Chemosphere. 85, 34-42 (2011).
- Gupta, S. C., et al. Adverse effect of organophosphate compounds, dichlorvos and chlorpyrifos in the reproductive tissues of transgenic Drosophila melanogaster: 70kDa heat shock protein as a marker of cellular damage. Toxicology. 238, 1-14 (2007).
- Wasserkort, R., Koller, T. Screening toxic effects of volatile organic compounds using Drosophila melanogaster. Journal of Applied Toxicology. 17, 119-125 (1997).
- Markow, T. A., O'Grady, P. O. Reproductive ecology of Drosophila. Functional Ecology. 22, 747-759 (2008).
- Dev, K., Chahal, J., Parkash, R. Seasonal variations in the mating-related traits of Drosophila melanogaster. Journal of Ethology. 31, 165-174 (2013).
- Salminen, T. S., Vesala, L., Laiho, A., Merisalo, M., Hoikkala, A., Kankare, M. Seasonal gene expression kinetics between diapause phases in Drosophila virilus group species and overwintering differences between diapausing and non-diapausing females. Nature Scientific Reports. 5, 11197 (2015).
- Miller, R. S., Thomas, J. L. The effects of larval crowding and body size on the longevity of adult Drosophila melanogaster. Ecology. 39, 118-125 (1958).
- Peterson, E. K., Ghiradella, H., Possidente, B., Hirsch, H. Transgenerational epigenetic effects of lead exposure on behavior in Drosophila melanogaster. Abstracts of the IBANGS Genes, Brain and Behavior Meeting, May 16-19, 2012, Boulder, CO, 11, Genes, Brain & Behavior 492-493 (2012).
- Soares, J. J., et al. Continuous liquid feeding: New method to study pesticides toxicity in Drosophila melanogaster. Analytical Biochemistry. 537, 60-62 (2017).
