Summary
In deze paper bieden wij een gedetailleerd protocol voor het blootstellen van de soort van het geslacht Drosophila aan verontreinigende stoffen, met het doel van het bestuderen van de impact van blootstelling over een scala van fenotypische resultaten op verschillende ontwikkelingsstadia en voor meer dan één generatie.
Abstract
Emergente eigenschappen en externe factoren (populatieniveau en ecosysteem-niveau interacties, in het bijzonder) een belangrijke rol spelen in het bemiddelen van ecologisch belangrijke eindpunten, hoewel ze zijn zelden beschouwd als in het toxicologisch onderzoek. D. melanogaster ontpopt zich als een model van de toxicologie voor de gedrags, neurologische en genetische effecten van toxische stoffen, om enkelen te noemen. Wat nog belangrijker is, kunnen soort van het geslacht Drosophila worden gebruikt als een modelsysteem voor een integratieve kaderbenadering ecologisch relevante vragen in de toxicologie onderzoek te nemen emergente eigenschappen. Het doel van dit document is bedoeld als een protocol voor het blootstellen van de soort van het geslacht Drosophila aan verontreinigende stoffen moet worden gebruikt als een modelsysteem voor een scala aan fenotypische uitgangen en ecologisch relevante vragen. Meer in het bijzonder, dit protocol kan worden gebruikt om 1) koppeling van meerdere biologische niveaus van organisatie en begrijpen van de invloed van toxische stoffen op zowel individueel - en bevolking-level fitness; 2) test de invloed van toxische stoffen in verschillende stadia van ontwikkelingsstoornissen blootstelling; 3) test multigeneratie en evolutionaire implicaties van verontreinigende stoffen; en 4) test meerdere contaminanten en stressoren gelijktijdig.
Introduction
Elk jaar worden ongeveer 1.000 nieuwe chemicaliën ingevoerd door de chemische industrie1,2; echter, de milieueffecten van slechts een klein percentage van deze chemische stoffen zijn getest voordat de distributie2,3. Hoewel grootschalige rampen zijn ongewoon, subletale and chronische blootstelling aan een grote verscheidenheid van verontreinigende stoffen zijn wijdverspreid in zowel mensen als dieren in het wild4,5. De historische focus van ecotoxicologie en milieutoxicologie moest testen letaliteit, enkele blootstelling aan chemische stoffen, acute blootstelling en de fysiologische effecten van blootstelling, als een middel van het meten van de impact van verontreinigende stoffen op overleving6, 7 , 8 , 9 , 10. Hoewel er een verschuiving naar ethische en niet-invasieve benaderingen voor dierproeven bevorderen, huidige benaderingen zijn beperking vanwege de rol die ontwikkeling, emergente eigenschappen en externe factoren (zoals populatieniveau en ecosysteem-niveau interacties) spelen in het bemiddelen van ecologisch belangrijke eindpunten8. Daarom is er behoefte aan een methoden die een meer holistische benadering te nemen zonder in te boeten, wild en/of gewervelde dieren in het laboratorium.
Ongewervelde modelsystemen, zoals Drosophila melanogaster, zijn een aantrekkelijk alternatief inspelen op de behoefte aan een meer holistische benadering van toxiciteit. D. melanogaster, werd oorspronkelijk ontwikkeld als een ongewervelde modelsysteem voor mens-gerelateerde genetisch onderzoek ongeveer een eeuw geleden11. D. melanogaster is nu prominent gebruikt als een alternatief gewervelde model om verschillende redenen: 1) de instandhouding van genen en trajecten tussen D. melanogaster en mensen; 2) korte generatietijd in vergelijking met gewervelde modellen; 3) goedkope kosten van onderhoud; 4) gemak bij het genereren van grote steekproeven; en 5) overvloed van fenotypische en ecologisch-relevante eindpunten beschikbaar voor het testen van11,12,13,14,15,16,17 .
Verschillende laboratoria11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 nu gebruikt D. melanogaster als een alternatief gewervelde model voor toxiciteitstests te begrijpen van de effecten van verontreiniging op de mens. Plaatselijke wilde soorten van Drosophila kan worden gebruikt, zo goed, als toxiciteit modellen voor wilde dieren (en mensen) te beantwoorden ecologisch-, gedragsgestoorde-, en evolutionair relevante vragen op meerdere biologische niveaus van de organisatie. Met behulp van soorten binnen het geslacht Drosophila als een model, zijn verschillende meetbare eindpunten mogelijk11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. In addition, met behulp van het model van de Drosophila , toxicologen kunnen: 1) ethisch koppelen effecten op meerdere biologische niveaus van de organisatie; 2) nemen de rol van de opkomende factoren en ontwikkeling; 3) studie ecologisch belangrijke eindpunten (naast medisch belangrijke eindpunten); 4) test meerdere stressoren tegelijkertijd; 5) en test op lange termijn multigeneratie (bijvoorbeeld evolutionaire en transgenerationele) gevolgen van stressoren. Daarom kunt gebruik van Drosophila als een modelsysteem een veelheid aan benaderingen, niet beperkt tot het bestuderen van mechanistische benaderingen met ingeteelde stammen van D. melanogaster in het laboratorium.
In deze paper presenteren we de methoden voor het fokken en het verzamelen van Drosophila om verschillende toxicologische vragen te beantwoorden. Meer in het bijzonder, beschrijven we de methodologie voor 1) kippen Drosophila in medium doorweven met een of meer verontreinigende stoffen; 2) verzamelen Drosophila in de gehele ontwikkeling (bijvoorbeeld zwerven derde-instar-larven, pop gevallen, nieuw-eclosed volwassenen en volwassen volwassenen); en 3) Drosophila fokken in de besmette middellange tot test tussen de generaties en transgenerationele overdracht, alsmede de evolutionaire gevolgen van langdurige blootstelling van de toxische. Met behulp van dit protocol, de vorige auteurs18,19,20,21,22,23,24hebben,25 gemeld verschillende fysiologische, genetische en gedragsmatige gevolgen van ontwikkelingsstoornissen leiden (Pb2 +) blootstelling. Dit protocol maakt toxicologen te gebruiken van een meer holistische benadering van toxicologische, die essentieel is om te begrijpen hoe verontreinigende stoffen zijn risicofactoren voor zowel mens en dier in een steeds meer en meer vervuilde omgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol is een experimenteel protocol gebruikt om de soort van het geslacht van de Drosophila op de drager van de verontreinigde aan de achterkant bij orale inname van een toxine passend is; andere vormen van blootstelling zijn mogelijk met behulp van de Drosophila model11,15,16,26. De in dit protocol omschreven methoden zijn eerder beschreven door Hirsch et al. 19 en Peterson et al. 23 , 24 , 25.
1. instellen van Drosophila voorraad populaties in het onderzoekslaboratorium
- Instellen een ecologisch-gecontroleerde incubator (of kleine kamer) aan huis voorraad bevolking van Drosophila door het instellen van de incubators voor een constante temperatuur, licht: donker cyclus en vochtigheid, afhankelijk van de voorkeuren van de geteste soort.
Opmerking: Voorkeur milieuomstandigheden zal variëren afhankelijk van de inheemse ecologie van de soorten die zijn gekozen voor de studie. Bijvoorbeeld, D. melanogaster is inheems in sub-Saharisch Afrika27 en meestal blijft behouden bij 25 ° C, 12:12 licht: donker cyclus, en ongeveer 60% vochtigheid16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. aan de andere kant, D. montana formatie strekt zich uit gedurende het grootste deel van Canada en de VS van de midwest, een veel koudere regio; D. montana is daarom meestal op 19-20 ° C en soms een licht regime van 24u te simuleren voorwaarden tijdens de paring seizoen31gehouden. Zie voor een meer gedetailleerde beschrijving van de geografische grenzen van verschillende soorten Drosophila, de Drosophila soortvorming patronen website32. -
Verkrijgen van een voorkeur Drosophila soorten en/of de ingeteelde stam uit ofwel een voorraad center (zie tabel of Materials), een ander onderzoekslaboratorium op verzoek of verzamelen wild, genetisch variabele populaties uit het veld.
Opmerking: De volgende stappen wordt uitgelegd de methoden voor het verzamelen van wilde, genetisch variabele populaties van Drosophila te handhaven in het onderzoekslaboratorium. Deze methoden zijn gewijzigd van Markow en O'Grady33 en Werner en Jaenike34 voor het verzamelen van de breedste diversiteit van de soorten tegelijk, in plaats van bepaalde doelsoorten, met een aas bron.- 'S nachts een half dozijn rijpe bananen in de vriezer bevriezen en ontdooien voordat u aas vallen.
- Bereiden meerdere 1 – 2 L plastic flessen door het snijden van een u-vormige gleuf aan de voorkant van de fles te laten vliegen worden vastgelegd in de aas fles en niet ontsnappen. Kap het plastic flessen met hun doppen zodat de vliegen niet via de deksels ontsnappen doen.
- De ontdooide banaan toevoegen naar de onderkant van de flessen, zodat de onderkant van de flessen ongeveer één-duim van banaan bevat. Plaats een plakje rijpe tomaat in de fles. Een gist drijfmest (de overgebleven gist van het proces voor het maken van bier) aan de banaan op de bodem van de fles toevoegen, zodat de banaan krijgt om te genieten in de gist drijfmest.
- Houten stokken (in verticale rechtop) toevoegen aan de fles, zodat de vliegen een schoon substraat hebben op om weg te lopen de gist drijfmest en banaan.
Figuur 1 illustreert het eindproduct van deze methoden. - Hang lokaas flessen in bomen 's nachts en controleren dat elke 24 h. mond aspirate vliegt uit flessen en individueel plaatsen vrouwtjes in flesjes met medium iso-vrouwelijke lijnen te maken.
Opmerking: Multi vrouwelijke lijnen kunnen worden gemaakt, echter alleen als de vrouwtjes van elke soort kunnen duidelijk worden geïdentificeerd. Bovendien vliegen binnen het geslacht Drosophila bezetten verschillende ecologische niches en zal hebben verschillende dieetwensen afhankelijk van deze niches (Werner en Jaenike,34); Zie Werner en Jaenike34 voor dieet aanbevelingen en recepten. - De volwassen F1 nakomelingen onder de Microscoop dissectie ter identificatie van de soorten de verzamelde Drosophila onderzoeken (Zie Markow en O'Grady33 en Werner en Jaenike34 voor hulp bij het identificeren van de verschillende soorten ).
Figuur 1 : Pictorial vertegenwoordiging van vallen en aas gebruikt voor het verzamelen van wilde populaties van Drosophila in het veld. (A) Fly overlapt set op de site van een lokale veld in Colorado. (B) een nauwere weergave van de vlieg overlapt op deze site van het veld ingesteld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Het handhaven van de iso-vrouw of de multi vrouwelijke lijnen in een ecologisch-gecontroleerde incubator of kamer met constante temperatuur, licht: donker cyclus en vochtigheid. Om dit te doen, huis vliegt in flacons of flessen in de voorkeur van de drager en laat de gravid vrouwtjes om eieren te leggen op de middellange. Toezicht op de flesjes voor de aanwezigheid van larven en poppen.
Opmerking: Vliegen binnen het geslacht Drosophila bezetten verschillende ecologische niches en zal hebben verschillende dieetwensen en milieu abiotische voorkeuren afhankelijk van die nissen33,34. Milieu voorkeuren en voedingsaanbevelingen (en verdere instructies over vliegen veehouderij) kunnen worden gevonden in Elgin en Miller28, Shaffer et al. 29, stocker en Gallant30, Markow en O'Grady33en Werner en Jaenike34. Als wild gevangen soorten, kunnen plaatselijke milieuomstandigheden worden gesimuleerd in de incubators totdat de soorten kunnen worden geïdentificeerd. - Overdracht van voorraden regelmatig op vers medium, oude flesjes, teruggooi te handhaven van gezonde lijnen en te voorkomen dat infectie van mijten.
Opmerking: De frequentie van de overdracht zal afhangen van de levenscyclus van de soort. Bijvoorbeeld, overbrengen Drosophila melanogaster elke 2 weken op vers medium. Zie voor meer informatie over de handhaving van de regels in het laboratorium, Rand et al. 16, Elgin en Miller28, Shaffer et al. 29, stocker en Gallant30, Greenspan35en Science Education Database36.
2. achterzijde Drosophila in het verontreinigde Medium
Opmerking: Als Drosophila wilt testen in het laboratorium voor de eerste keer of met een nieuwe contaminant(s), identificeren de dodelijke dosis (Zie Castaneda et al. 37 en Massie et al. 38 voor methoden) en de LD50 (Zie Castaneda et al.. 37 en Akins et al. 39 voor methoden) eerste. Voer vervolgens een dosis-responscurve ter identificatie van biologisch relevante concentraties voor de gewenste fenotypische output; Zie Hirsch et al. 19 en Zhou et al. 40 voor methoden.
- Bereiden van stamoplossingen van de verontreinigde medium op de gewenste concentration, afhankelijk van de chemie van de verontreiniging.
Opmerking: om bijvoorbeeld te bereiden van stamoplossingen van PbAc: bereiden van stamoplossingen van loodacetaat (PbAc) medium door toevoeging van verontreinigingen aan gedestilleerd water (dH2van 0) tot drager dan ook gemaakt met de gewenste concentratie van verontreinigingen water bereikt. Bijvoorbeeld, een stockoplossing van 1.000 µM PbAc, kan worden voorbereid door het toevoegen van PbAc aan dH20 tot 1.000 µM bereikt PbAc. Verder, Verdun de stockoplossing (bijvoorbeeld de 1.000 µM PbAc oplossing) tot de gewenste concentratie (zoals 500 µM PbAc) en deze oplossingen als voorraad zo goed onderhouden. - Medium, volgende fabrikant richtsnoeren om te dienen als de controle medium voor te bereiden. Bereiden van extra medium, volgende fabrikant richtsnoeren; echter bereid supplement verontreinigingen oplossing voor dH20.
Opmerking: bijvoorbeeld, als een instant Drosophila medium gebruikt, ongeveer een theelepel instant medium aan toevoegen een plastic flesje. Ongeveer 5-5,5 mL dH20 aan het medium toevoegen. Strooi een paar korrels van levende bakkersgist te bereiden controle medium. Ter voorbereiding van experimentele medium, aanvulling van de stockoplossing (zoals 500 µM PbAc) voor de dH20. -
Pipetteer reproductief levensvatbare volwassen mannetjes en vrouwtjes uit voorraad populaties in het besturingselement en het experimentele medium.
Opmerking: De tijd na eclosion naar reproductieve volwassenheid is verschillend tussen de Drosophila soorten41.- Zachtjes tikt u op de flacon van voorraad vliegen naar beneden met de dominante hand. Ervoor zorgen dat de vliegen automatisch naar de onderkant van de flacon verplaatst. Met de andere hand, verwijder de dop van het flesje tijdens het tikken van de flacon en een verse Injectieflacon van controle of verontreinigde normaal plaats op de top van de flacon met het vliegen. De flesjes bij elkaar te houden en hen flip-over, zachtjes te tikken, zodat de vliegen automatisch zijn overgedragen aan de verse flacon van controle of verontreinigde medium. Terwijl het nog steeds te tikken op de flacon met het vliegen, cap de flacon.
- Herhaal met meer flesjes, ervoor zorgend om het aantal vliegen in elk flesje standaardiseren.
Opmerking: Het totale aantal volwassenen overgedragen via interne overdracht of narcose zal afhangen van de grootte van de flesjes gebruikt om te voorkomen dat overbevolking. - Incubeer volwassenen in een standaard milieu staat (dat wil zeggen een incubator) en laat de volwassenen om te paren en eieren leggen in het medium voor 24-96 h.
- Na 24-96 h, het negeren van volwassenen in een lijkenhuis (een kolf gevuld met minerale olie en afgetopt met een strakke trechter) achterlaat bevruchte eieren (die zal later worden de experimentele onderwerpen) om te rijpen voor het testen. Plaats de flesjes in de incubator om de eieren te ontwikkelen.
- De flesjes voor zwerven-instar-larven door op zoek naar de larven die uit het medium te controleren.
3. het verzamelen van experimentele onderwerpen op verschillende ontwikkelingsstadia
Opmerking: Experimentele onderwerpen kunnen worden verzameld in elke ontwikkelings fase, in de blind gecodeerde 15 mL conische buisjes geplaatst en getest voor accumulatie. Methoden voor het testen van de accumulatie van verontreinigende stoffen zal afhangen van de verontreiniging wordt bestudeerd. Bijvoorbeeld, kan ophoping van PbAc worden getest met behulp van Inductively-Coupled Plasma massaspectrometrie (ICP-MS)42. Experimentele onderwerpen kunnen bovendien worden verzameld in elke ontwikkelings fase die wordt getest voor een verscheidenheid van fenotypische effecten van verontreinigingen. Figuur 2 illustreert de Drosophila levenscyclus43. Figuur 3 toont de experimentele protocol voor blootstelling en de verschillende ontwikkelingsstadia voor collectie.
Figuur 2 : Overzicht van de hele levenscyclus van D. melanogaster (de meest gebruikte Drosophila modelsysteem). De stadia van de levenscyclus van Drosophila zijn: 1) ei 2) eerste-instar larve, 3) tweede-instar larve, 4) derde-instar larve, 5) dwalen derde-instar larve, 6) brilvogels verpopping, 7) rode ogen verpopping, 8) nieuw-eclosed volwassene en 9) volwassen volwassene. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Overzicht van de methoden voor het mondeling bloot Drosophila aan verontreinigde medium in zowel de ouderlijke (F0) en de volgende generaties (F1 en verder). (A) methoden voor orale blootstelling tijdens de ontwikkeling in de blootgestelde generatie. (B) methoden voor het testen van de overdracht van contaminanten aan nakomelingen (F1 tot de gewenste generatie). Dit cijfer is gewijzigd van Peterson et al. 24 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
-
Zwerven-derde instar-larven verzamelen
- Beginnen met de monitoring van flesjes wanneer lichten in de incubator, schakelen als larven zullen uit het medium voortkomen en naar boven aan de zijkant van de flacon binnen een uur verplaatsen nadat lichten hebt ingeschakeld in de incubator. Binnen dit uur, door de zwerven-derde instar-larven uit de zijkanten van de ampul voorzichtig met een houten stok of pincet te verwijderen.
Opmerking: Het aantal larven beschikbaar voor collectie zal afhangen van het aantal eieren gelegd in "2.3.4". - Schakel overtollige medium van de larven, plaatst u de larven in een klein bekerglas met dH2O. Pour de dH2O uit het bekerglas en de larven plaats op een delicate taak wisser. Met behulp van een delicate taak wisser, zachtjes verwijderen van de overtollige dH2O van de larven.
- Handhaven van experimentele populaties in een ecologisch-gecontroleerde incubator.
- Beginnen met de monitoring van flesjes wanneer lichten in de incubator, schakelen als larven zullen uit het medium voortkomen en naar boven aan de zijkant van de flacon binnen een uur verplaatsen nadat lichten hebt ingeschakeld in de incubator. Binnen dit uur, door de zwerven-derde instar-larven uit de zijkanten van de ampul voorzichtig met een houten stok of pincet te verwijderen.
-
Nieuw-eclosed volwassenen verzamelen
- Monitor flesjes voor eclosion door het observeren van de kleur van de poppen langs de zijkanten van de flesjes.
Opmerking: Poppen zal donkerder tijdens de ontwikkeling. Developmental tijd, met name pre eclosion, hangt af van de geteste soort. - Wanneer de eerste volwassenen te eclose beginnen, dump en gooi deze volwassenen in een lijkenhuis met minerale olie.
- Wanneer de lichten in de incubator de volgende ochtend, dump en gooi alle volwassenen van onbekende leeftijd (of maagdelijkheid) die wellicht eclosed's nachts of tijdens de morningbefore lichten op.
- Ongeveer 4 uur later, anesthetize alle volwassenen die als nieuw eclosed volwassenen met een CO2 pistool in de flesjes te voorschijn gekomen. Plaats volwassenen op een CO-2 plaat onder een Microscoop dissectie. Geslacht volwassenen door op zoek naar seks kammen op de voorpoten van mannetjes en ovipositors bij vrouwtjes.
Opmerking: D. melanogaster moeten worden verzameld binnen 6 uur van eclosion te vermijden paring maar andere soorten wellicht meer developmental tijden (en hoeft dus niet te worden verzameld binnen dit tijdsbestek). - Aparte volwassenen op de CO2 -plaat met behulp van een houten stok. Zachtjes overbrengen volwassenen in geslacht-specifieke groepen met behulp van een houten stokje aan de middellange overeenkomende vooraf bestaande geschiedenis.
- Monitor flesjes voor eclosion door het observeren van de kleur van de poppen langs de zijkanten van de flesjes.
-
Verzamelen van volwassen volwassenen na eclosion
- Meerderjarigen te blijven op de middellange overeenkomende pre eclosion Gasbedwelming met behulp van ei podium de gewenste leeftijd na eclosion in een ecologisch-gecontroleerde incubator.
- Afzonderlijk overbrengen volwassenen naar het medium van de controle voor 24 h vóór de test zodat volwassenen om bruidegom overtollige verontreinigde medium uit hun lichaam.
4. experimentele onderwerpen om de effecten van intergenerationele of transgenerationele blootstelling te testen aan de achterkant.
- Om de achterkant van de ouderlijke generatie (a.k.a de P0 of F0 generaties), overdracht van volwassenen uit voorraad populaties aan controle en de experimentele medium volgens de stappen in "2.1" "2.3" en "3.1" aan "3.3".
- Wanneer de volwassenen zijn reproductief volwassen (Zie Pitnick et al.. 41), afzonderlijk overdracht (zoals in 2.3.1) een flacon van mannetjes om een verse flacon van controle of experimentele medium. Afzonderlijk overbrengen in een flacon van vrouwtjes de verse flacon die nu mannetjes bevat. Meerderjarigen metgezel te leggen eieren in het medium voor 24-96 h. Dump en negeren van volwassenen in een lijkenhuis met minerale olie en opnieuw uit te broeden flesjes om nakomelingen te ontwikkelen.
- Herhaal stap 4.1 via 4.2 afhankelijk van het gewenste aantal generaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door mondeling Drosophila bloot te stellen aan een contaminant(s) in de gehele ontwikkeling, kunnen verschillende toxicologische vragen worden getest door Drosophila op verschillende niveaus van biologische organisatie bloot te leggen. Deze sectie bevat representatieve resultaten verkregen met behulp van dit protocol in eerder gepubliceerde documenten23,24. In het bijzonder werd dit protocol eerder gebruikt om te evalueren van de accumulatie, de eliminatie en de sekwestratie van lood (Pb) binnen dezelfde generatie van blootstelling en over de eerste generatie nakomelingen23; en te bestuderen van de gevolgen van accumulatie op partner keuze24.
Tabel 1 en Figuur 4 Toon representatieve resultaten verkregen met behulp van dit protocol de accumulatie en de afschaffing van het Pb in zowel de F0 en F1 generaties te bepalen.
Tabel 1 toont representatieve resultaten indicatieve van de accumulatie van Pb wanneer blootgesteld binnen generatie (bij verschillende doseringen: 0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 en 500 µM PbAc) in monsters getest op meerdere ontwikkelingsstadia (derde-instar-larven, zwerven pop gevallen, nieuw-eclosed volwassenen, en volwassen vrouwtjes en mannetjes) in Peterson et al. 23 monsters werden verzameld in verschillende ontwikkelingsstadia, bevroren bij-20 ° C, behandeld met salpeterzuur en waterstofperoxide en getest voor Pb met behulp van ICP-MS23,42.
| Dosis (µM PbAc) | Larve | Pop gevallen | Nieuw-Eclosed volwassenen | Volwassen volwassen vrouwtjes | Volwassen volwassen mannetjes |
| 0 | 0.009 ± 0,001 | 0.099 ± 0,02 | 0,04 ± 0.005 | 0.069 ± 0.031 | 0.0015 ± 0.003 |
| 10 | 0.42 ± 0,025 | 0.46 ± 0,03 | 0,12 ± 0.009 | 0,12 ± 0,012 | 0.056 ± 0,008 |
| 40 | 7,5 ± 0.67 | ||||
| 50 | 5,2 ± 0.71 | 2,77 ± 0,30 | 1.11 ± 0.14 | ||
| 75 | 14 ± 1.06 | ||||
| 100 | 12 ± 0.95 | 4.7 ± 0.38 | 3.36 ± 0,58 | 1.20 ± 0.63 | 1.24 ± 0,46 |
| 250 | 89 ± 8,49 | 25.06 ± 4.72 | 5.46 ± 0.75 | ||
| 500 | 271 ± 41.01 | 334.30 ± 39.43 | 8.44 ± 0.84 | 46.50 ± 14.72 | 14.43 ± 1,83 |
Tabel 1: bedoel Pb ladingen (ng/particulier) getest D. melanogaster tijdens de ontwikkeling na orale blootstelling aan Pb van ei fase voor het testen van stadium. Middelen (ng/fly) ± standaardfout van gemiddelde weergegeven (n = 8 larve, n = 3 controle-gefokt volwassenen, n = 3 Pb-gefokt volwassenen). Wild type D. melanogaster zijn gefokt op controle of gelode medium (0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 of 500 µM PbAc) van ei podium aan verschillende stadia van ontwikkeling. Monsters werden verzameld en getest voor Pb accumulatie met behulp van ICP-MS.42 die deze tabel is gewijzigd van Peterson et al. 23
In Figuur 4, de ouderlijke generatie (F0) werd blootgesteld aan Pb van stadia van de ei naar volwassenheid, gekruist in controle medium, en de eerste generatie nakomelingen (F1) zijn gefokt in controle middellange tot volwassenheid24. Methoden voor het detecteren van Pb accumulatie en eliminatie waren gelijk aan Peterson et al. 23. resultaten uit dit experiment blijkt dat de ouderlijke blootstelling niet wordt doorgegeven aan de eerste generatie van volwassen nakomelingen24. Dus, met behulp van dit protocol, het is mogelijk om te testen van adaptieve reacties bij verschillende evolutionaire schalen, evenals transgenerationele effecten van F0 blootstelling. Vergelijkbare resultaten werden gevonden in Peterson et al. 23
Figuur 4: PB accumulatie in D. melanogaster (A) de ouders (F0) en (B) onbelicht nakomelingen (F1). Bars in (A) en (B) Toon gemiddelde (ng/volwassene) ±SEM. omvang van de steekproeven hierboven bars in (A) en (B). p = < 0,001. (A) F0 volwassenen mondeling werden blootgesteld aan 250 µM PbAc met behulp van dit protocol van ei podium leeftijd 5 d na eclosion en verzamelde leeftijd 6 dagen na eclosion (na 24 h gedurende de depuratiefase) te beproeven voor Pb accumulatie met behulp van ICP-MS.42(B) F0 volwassenen werden gekruist binnen behandeling in controle medium. Onbelichte F1 nakomelingen werden gekweekt in medium van de controle uit ei fase naar volwassenheid (met behulp van dit protocol) en getest voor Pb accumulatie met behulp van ICP-MS. In (B): "CF + CM"= F1 volwassenen met ouders gefokt in controle medium, "CF + PbM" = F1 volwassenen met vaders gefokt in loodhoudende medium, "PbF + CM" = F1 volwassenen met moeders gefokt op loodhoudende medium "PbF + PbM" = F1 volwassenen met ouders gefokt in loodhoudende medium. Dit cijfer is gewijzigd van Peterson et al. 24 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De resultaten gepresenteerd in tabel 1 en Figuur 4 blijkt dat Drosophila gemakkelijk worden bij elkaar opgeteld Pb op verschillende doses, ontwikkelingsstadia en evolutionaire schalen met behulp van dit protocol. Daarom geeft dit het protocol van effectiviteit in D. melanogaster bloot aan een mondelinge verontreinigingen.
In Figuur 5, werd het protocol hier beschreven gebruikt door Peterson et al. 24 voor het testen van de gevolgen van ontwikkelingsstoornissen Pb blootstelling voor stuurman voorkeur. Experimentele onderwerpen zijn gefokt uit ei fase naar volwassenheid op controle of gelode medium van ei podium naar volwassenheid en getest voor stuurman voorkeur na 24 h van depuratiefase. Peterson et al. 24 gevonden dat Pb-blootgesteld vrouwtjes netcongestieproblemen met Pb-blootgesteld mannetjes gekruist wanneer de mogelijkheid van een besturingselement of de man Pb-blootgesteld. Deze resultaten zijn een representatief voorbeeld van de implementatie van het protocol bij het onderzoeken van de fenotypische output.
Figuur 5: Mate voorkeur bij mannen en vrouwen die zijn blootgesteld aan 250 µM PbAc uit ei etappe naar volwassenheid. Bars in (A), (B), en (C) gemiddelde procent (%) paring succes (in 60 mins) ± SEM. Toon *** = p < 0.001. * = p < 0.05. Experimentele onderwerpen in (A), (B) en (C) werden blootgesteld aan controle of gelode medium (250 µM PbAc) vanaf ei fasen om te rijpen van volwassenheid en getest voor verschillen in de keuze van de partner. (A) vrouwelijke voorkeur voor beide mannen van controle - of Pb-gefokt (d.w.z. twee-keuze test). Omvang van de steekproeven waren: N = 126 controle-gefokt vrouwtjes en 137 Pb-gefokt vrouwtjes. (B) mannelijke voorkeur voor controle - en Pb-gefokt vrouwtjes (d.w.z. twee-keuze test). Monsters maten waren: N = 59 controle-gefokt mannetjes en N = 64 Pb-gefokt mannetjes. (C) Mate voorkeur in zowel mannen en vrouwen wanneer afzonderlijk gekoppeld met één partner van beide blootstelling (dat wil zeggen nee-keuze tests). In (C): "CF + CM" = een controle gehouden vrouwelijke gekoppeld aan een controle gehouden man (N = 85 paren), "CF + PbM" = een controle gehouden vrouwelijke gekoppeld per Pb-gefokt mannetje (N = 79 paren), "PbF + CM" = een Pb-gefokt vrouwelijke gekoppeld aan een controle gehouden man (N = 91 paren), "PbF + PbM"= een Pb-gefokt danseres + per Pb-gefokt mannetje (N = 98 paren). Dit cijfer is gewijzigd van Peterson et al. 24. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila melanogaster is opgezet als een krachtig model voor een scala aan biologische processen als gevolg van de uitgebreide instandhouding van genen en trajecten tussen D. melanogaster en mensen13,14. Om dezelfde redenen dat er een krachtig model voor medische wetenschap, heeft Drosophila ontpopt als een geschikt modelsysteem te bestuderen van de gevolgen van antropogene vervuiling voor tal van toxicologische eindpunten. Verschillende laboratoria zijn succesvol D. melanogaster gebruik als een modelsysteem te bestuderen van een aantal stoffen, met inbegrip van zware metalen11,16,18-25,37 ,38,39,40,44,45, ethanol46, nanodeeltjes26,47, pesticiden48 , en oplosmiddelen49. Ondanks de recente inspanningen om het gebruik van Drosophila als een model van de toxicologie, het gebruik ervan als een modelsysteem om de talloze toxicologische vragen te beantwoorden is nog in de kinderschoenen. Echter, gezien het uitgebreide gebruik ervan als een model voor medisch gerelateerde eindpunten, alsmede het gebruik ervan in ecologisch50 en evolutionaire studies17, zijn potentieel als een toxicologische modelsysteem is enorm.
Hier presenteren we methoden voor het opfokken van diverse soorten binnen het geslacht Drosophila op besmette medium om te testen op verschillende toxicologische eindpunten. Hoewel andere vormen van blootstelling mogelijk zijn met behulp van Drosophila als een model (bijvoorbeeld inademing en dermale blootstelling), dit protocol richt zich op de mondelinge consumptie van verontreinigende stoffen die nodig is voor contaminanten dat zou uiteraard ingenomen) zoals via de voedselketen). Deze methoden zijn geschikt voor het gebruik van meerdere Drosophila soorten en verontreinigingen. Wild, genetisch variabele populaties van Drosophila kunnen ook worden verzameld in het veld en onderhouden in het onderzoekslaboratorium. Er zijn vele opties van de vallen en aas dat kan worden gebruikt, afhankelijk van de soorten voedselvoorkeur; Zie voor veld gidsen op veld collectie, Markow en O'Grady33 en Werner en Jaenike34. Bovendien, de methoden kan worden gewijzigd om te bepalen van de gevolgen van ontwikkelingsstoornissen blootstelling op verschillende kritieke developmental perioden en zorgt voor langdurige multigeneratie testen van verontreinigingen blootstelling.
De kritische stappen van deze methoden omvatten: (1) handhaving vliegen voorraden in milieu-gecontroleerde omstandigheden, (2) het vermijden van overbevolking van vliegen bevolking, (3) het verdunnen van de verontreiniging van de test volgens de chemische eigenschappen en (4) te kiezen biologisch relevante concentratie van de verontreiniging van de test. Behoud van de visbestanden in milieu-gereglementeerde incubators (of een kleine kamer) zorgt ervoor dat extra variaties in de omgevingscondities niet resultaten verwarren doen. Bovendien seizoensgebonden variaties in gedrag eerder gevonden51 en verschillende soorten van Drosophila Voer diapauze over de winter-52. Tweede, larvale overbevolking kan langdurige gevolgen hebben voor ontwikkeling30, volwassen lichaam grootte30en levensduur53. Verdunning van de verontreiniging is bovendien een essentiële stap om ervoor te zorgen dat de verontreinigingen biologisch beschikbaar voor Drosophila te verzamelen van de verontreiniging is. PbAc is bijvoorbeeld opgelost in dH2O23,24,25, overwegende dat andere chemische stoffen wellicht worden opgelost in zout water of ethanol. Het kiezen van biologisch relevante concentratie van de verontreiniging kan invloed hebben op de richting van de resultaten; bijvoorbeeld, verhogen lage doses van PbAc de gemiddelde aantal vrouwtjes paring met mannetjes (binnen 20 minuten), overwegende dat hogere doseringen blijkt significante dalingen in het gemiddelde aantal vrouwtjes paring19. Lezers overwegen om te identificeren biologisch relevante concentratie van de verontreiniging van de test, uitvoeren van voorbereidende studies om de dodelijke dosis en LD50 te bepalen van de juiste doses voor het uitvoeren van een dosis-respons-curve te bepalen. Door het uitvoeren van een dosis-responscurve om te testen van een aantal uiteenlopende concentraties op een bepaald eindpunt, kunnen lezers nauwkeurig vastgestelde doses die zijn "gunstig" of "gevaarlijke" aan individuen of bevolkingsgroepen voor verder onderzoek.
Dit protocol biedt een laan te bepalen: 1) het samenspel van meerdere biologische niveaus van organisatie op fitness en toxicologische eindpunten; 2) de rol van ontwikkelings- en opkomende factoren; 3) ecologisch belangrijke eindpunten; 4) medisch belangrijke eindpunten; 5) hoe meerdere stressoren interactie te produceren resultaten; en 6) de gevolgen van langdurige blootstelling die generaties overstijgt. Ter illustratie van de doeltreffendheid van dit protocol, werd het bewijs geleverd dat aangeeft dat personen blootgesteld in de gehele ontwikkeling2423,Pb (tabel 1 accumuleren). Bovendien, representatieve resultaten tonen aan dat dit protocol kan worden gebruikt voor het testen van de gevolgen van blootstelling op ecologisch belangrijke eindpunten (bv., de gevolgen van ontwikkelingsstoornissen Pb blootstelling op partner keuze24). Daarnaast anderen de effecten van verontreinigingen op meerdere biologische niveaus van organisatie hebben getest (met inbegrip van fysiologische18,,21,22 en fenotypische-niveaus van de genetische20,19 , 23 , 24 , 25), medisch-belangrijk eindpunten18,20,21,22,23, en op de lange termijn effecten van intergenerationele23,24 ,25,54. Bovendien voorlopige gegevens wijzen erop dat ontwikkelings Pb blootstelling transgenerationele epigenetische effecten op de vruchtbaarheid in D. melanogaster54 induceert. Een belangrijke beperking van dit protocol is dat het gebruik van dit protocol met Drosophila in de kinderschoenen. Daarom zijn er beperkte publicaties18,19,20,21,22,23,24,25 inspelen op de mogelijkheden van het protocol tot extra toxicologische vragen beantwoorden, zoals de rol van ontwikkelings- en opkomende factoren, extra ecologisch belangrijke eindpunten, meerdere stressoren en evolutionaire gevolgen van blootstelling.
Met dit protocol, kunnen lezers verontreinigingen die zijn uiteraard ingenomen met biologisch relevante methoden toetsen. Continu vloeibare voeding, ontwikkeld door Soares et al. 55 is een alternatieve benadering voor orale inname, met name voor bestrijdingsmiddelen blootstelling. Echter, continu vloeibare voeding is geschikt voor volwassen inname van vloeibare contaminanten en niet van toepassing op verontreinigingen waar individuen kunnen blootgestelde pre eclosion. Dit is vooral belangrijk gezien het potentieel voor kritieke perioden in ontwikkeling voor blootstelling. Eerdere studies hebben aangetoond een kritieke periode voor Pb blootstelling23. Daarom, Drosophila mag worden blootgesteld in de gehele ontwikkeling om te voorkomen dat de potentiële actieve verwijdering van verontreinigende stoffen door Drosophila vóór de test tot kritieke perioden kunnen worden bepaald.
Kortom, hebben wij verstrekt een protocol om mondeling Drosophila verontreinigingen bloot te stellen. Met behulp van dit protocol en model systeem, kunnen toxicologen verschuiven naar ethische en niet-invasieve benaderingen voor dierproeven bevorderen terwijl de tegelijkertijd de integratie van een meer holistische benadering van de invloed van verontreinigingen8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze publicatie werd gesteund door een subsidie van het ministerie van onderwijs (PR Award #P031C160025-17, titel van het Project: 84.031 C) tot de Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) Gemeenschappen tot actieve stam bouwen Engagement (C-BASE). Wij danken huidige zoölogie en Elsevier voor het verstrekken van de rechten op het gebruik van de representatieve resultaten gepubliceerd in vorige documenten, evenals de redactie van JoVE voor het verstrekken van ons met de mogelijkheid om het publiceren van dit protocol. Wij willen ook dank aan de C-BASE programma, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE en departement biologie, CSU-Pueblo), CSU-Pueblo biologie-afdeling, Thomas Graziano, Dr Bernard Possidente (departement biologie, Skidmore College), en Dr. Claire Varian Ramos (Departement biologie, Universiteit van de staat Colorado-Pueblo) voor hun steun en hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24 | Carolina Biological | 173204 | |
| Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit | Genessee Scientific | 32-116SB | Used to store flies |
| Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials | Genessee Scientific | 49-102 | Used to store flies |
| Cardboard trays, trays only, narrow | Genessee Scientific | 32-124 | Used to organize populations of flies |
| Cardboard trays, dividers only, narrow | Genessee Scientific | 32-126 | Used to organize populations of flies |
| Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure | Fischer Scientific | 03-312D | Useful for storage of contaminants |
| Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles | Fischer Scientific | 03-409-17C | Useful for storage of contaminants |
| Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser | Fischer Scientific | 14-287-150 | Used to prepare medium |
| Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips | Fischer Scientific | 13-683-708 | Used to prepare medium |
| Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm) | Genessee Scientific | 59-114 | Used to anesthetize flies |
| Flystuff foot valve | Genessee Scientific | 59-121 | Used to anesthetize flies |
| Tubing, green (1 continguous foot/unit) | Genessee Scientific | 59-124G | Used to anesthetize flies |
| Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle | VWR | 97064-130 | Used to make a morgue |
| Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2 | Walmart | Not applicable | Used to make a morgue |
| BGSET5 Glass Beaker Set Of 5 | Walmart | ||
| Inbred or wildtype line of Drosophila | Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University | https://bdsc.indiana.edu | |
| Wild popultions of Drosophila | UC San Diego Drosophila Stock Center | https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php |
References
- Postel, S. Defusing the Toxics Threat: Controlling Pesticides and Industrial Waste. , Worldwatch Institute. Washington, DC. (1987).
- Vitousek, P. M., Mooney, H. A., Lubchenco, J., Melillo, J. M. Human domination of earth's ecosystems. Science. 277, 494-499 (1997).
- United Nations Environment Program (UNEP). Saving Our Planet: Challenges and Hopes. , UNEP. Nairobi. (1992).
- Hansen, L. J., Johnson, M. L. Conservation and toxicology: Integrating the disciplines. Conservation Biology. 13, 1225-1227 (1999).
- Johnston, E. L., Mayer-Pinto, M., Crowe, T. P. REVIEW: Chemical contaminant effects on marine ecosystem functioning. Journal of Applied Ecology. 52, 140-149 (2015).
- Dell'Omo, G. Behavioral ecotoxicology. , John Wiley & Sons, LTD. West. Sussex, UK. (2002).
- Clotfelter, E. D., Bell, A. M., Levering, K. R. The role of animal behaviour in the study of endocrine-disrupting chemicals. Animal Behaviour. 68, 665-676 (2004).
- Peterson, E. K., Buchwalter, D. B., Kerby, J. L., LeFauve, M. K., Varian-Ramos, C. W., Swaddle, J. P. Integrative behavioral ecotoxicology: bringing together fields to establish new insight to behavioral ecology, toxicology, and conservation. Current Zoology. 63, 185-194 (2017).
- Scott, G. R., Sloman, K. A. The effects of environmental pollutants on complex fish behaviour: Integrating behavioural and physiological indicators of toxicity. Aquatic Toxicology. 68, 369-392 (2004).
- Zala, S. M., Penn, D. J. Abnormal behaviors induced by chemical pollution: A review of the evidence and new challenges. Animal Behaviour. 68, 649-664 (2004).
- Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic & Applied Medicine. 1, 33-38 (2013).
- Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology and medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacology Reviews. 63, 411-436 (2011).
- Rubin, G. M., et al.
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32, 74 (2010).
- Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1.12.1-1.12.20 (2015).
- Burke, M. K., Rose, M. R. Experimental evolution with Drosophila. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296, R1847-R1854 (2009).
- He, T., Hirsch, H. V. B., Ruden, D. M., Lnenicka, G. A. Chronic lead exposure alters presynaptic calcium regulation and synaptic facilitation in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 30, 777-784 (2009).
- Hirsch, H. V., et al. Behavioral effects of chronic exposure to low levels of lead in Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 24, 435-442 (2003).
- Hirsch, H. V. B., et al. Variations at a quantitative trait locus (QTL) affect development of behavior in lead-exposed Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 30, 305-311 (2009).
- Morley, E. J., Hirsch, H. V. B., Hollocher, K., Lnenicka, G. A. Effects of chronic lead exposure on the neuromuscular junction in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 24, 35-41 (2003).
- Ruden, D. M., et al. Genetical toxicologenomics in Drosophila identifies master- modulatory loci that are regulated by developmental exposure to lead. NeuroToxicology. 30, 898-914 (2009).
- Peterson, E. K., et al. Accumulation, elimination, sequestration, and genetic variation of lead (Pb2+) loads within and between generations of Drosophila melanogaster. Chemosphere. 181, 368-375 (2017).
- Peterson, E. K., et al. Asymmetrical positive assortative mating induced by developmental lead (Pb2+) exposure in a model system, Drosophila melanogaster. Current Zoology. 63, 195-203 (2017).
- Peterson, E. K. Consequences of developmental lead (Pb2+) exposure on reproductive strategies in Drosophila. , University at Albany-State University of New York. Dissertation (2016).
- Chifiriuc, M. C., Ratiu, A. C., Popa, M., Ecovolu, A. A. Drosophotoxicology: An emerging research area for assessing nanoparticles interaction with living organisms. International Journal of Molecular Sciences. 17, 36 (2016).
- Lachaise, D., Cariou, M. L., David, J. R., Lemeunier, F., Tsacas, L., Ashburner, M. Historical biogeography of the Drosophila melanogaster species subgroup. Evolutionary Biology. 22, 159-225 (1988).
- Elgin, C. R., Miller, D. W. Mass rearing of flies and mass production and harvesting of embryos. The Genetics and Biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, 112-121 (1978).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, C. R. Chapter 5: Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods in Cell Biology. 44, 99-108 (1994).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Jennings, J. H., Etges, W. J., Schmitt, T., Hoikkala, A. Cuticular hydrocarbons of Drosophila montana: geographic variation, sexual dimorphism and potential roles as pheromones. Journal of Insect Physiology. 61, 16-24 (2014).
- Drosophila Speciation Patterns. , http://www.drosophila-speciation-patterns.com/rangemaps.html. (2018).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. London. (2005).
- Werner, T., Jaenike, J. Drosopholids of the midwest and northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester NY. (2017).
- Greenspan, R. J. The basics of doing a cross. Fly Pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 3-24 (1997).
- JoVE Science Education Database. . Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Castañeda, P. L., Muñoz, G. L. E., Durán, D. A., Heres, P. M. E., Dueñas, G. I. E. LD50 in Drosophila melanogaster. fed on lead nitrate and lead acetate. Drosophila Information Service. 84, 44-48 (2001).
- Massie, H. R., Aiello, V. R., Whitney, S. J. P. Lead accumulation during aging of Drosophila and effect of dietary lead on life span. Age. 15, 47-49 (1992).
- Akins, J. M., Schroeder, J. A., Brower, D. L., Aposhian, H. V. Evaluation of Drosophila melanogaster as an alternative animal for studying the neurotoxicity of heavy metals. BioMetals. 5, 111-120 (1992).
- Zhou, S., et al. The genetic basis for variation in sensitivity to lead toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Health Perspectives. 124, 1062-1070 (2016).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Delayed male maturity is a cost of producing large sperm in Drosophila. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 92, 10614-10618 (1995).
- Beauchemin, D. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82, 4786-4810 (2010).
- Tyler, M. S. Development of the fruit fly Drosophila melanogaster. Developmental Biology, a Guide for Experimental Study. Tyler, M. S. , 2nd, Sinauer Associates Inc. Sunderland, MA, USA. 8-27 (2000).
- Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107, 416-426 (2009).
- Bonilla, E., Contreras, R., Medina-Leendertz, S., Mora, M., Villalobos, V., Bravo, Y. Minocycline increases the life span and motor activity and decreases lipid peroxidation in manganese treated Drosophila melanogaster. Toxicology. 294, 50-53 (2012).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 199-228 (2003).
- Posgai, R., Cipolla-McCulloch, C. B., Murphy, K. R., Hussain, S. M., Rowe, J. J., Nielsen, M. G. Differential toxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles on Drosophila melanogaster development, reproductive effort, and viability: size, coatings and antioxidants matter. Chemosphere. 85, 34-42 (2011).
- Gupta, S. C., et al. Adverse effect of organophosphate compounds, dichlorvos and chlorpyrifos in the reproductive tissues of transgenic Drosophila melanogaster: 70kDa heat shock protein as a marker of cellular damage. Toxicology. 238, 1-14 (2007).
- Wasserkort, R., Koller, T. Screening toxic effects of volatile organic compounds using Drosophila melanogaster. Journal of Applied Toxicology. 17, 119-125 (1997).
- Markow, T. A., O'Grady, P. O. Reproductive ecology of Drosophila. Functional Ecology. 22, 747-759 (2008).
- Dev, K., Chahal, J., Parkash, R. Seasonal variations in the mating-related traits of Drosophila melanogaster. Journal of Ethology. 31, 165-174 (2013).
- Salminen, T. S., Vesala, L., Laiho, A., Merisalo, M., Hoikkala, A., Kankare, M. Seasonal gene expression kinetics between diapause phases in Drosophila virilus group species and overwintering differences between diapausing and non-diapausing females. Nature Scientific Reports. 5, 11197 (2015).
- Miller, R. S., Thomas, J. L. The effects of larval crowding and body size on the longevity of adult Drosophila melanogaster. Ecology. 39, 118-125 (1958).
- Peterson, E. K., Ghiradella, H., Possidente, B., Hirsch, H. Transgenerational epigenetic effects of lead exposure on behavior in Drosophila melanogaster. Abstracts of the IBANGS Genes, Brain and Behavior Meeting, May 16-19, 2012, Boulder, CO, 11, Genes, Brain & Behavior 492-493 (2012).
- Soares, J. J., et al. Continuous liquid feeding: New method to study pesticides toxicity in Drosophila melanogaster. Analytical Biochemistry. 537, 60-62 (2017).
