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Biology

Experimentelles Protokoll für die Verwendung von Drosophila als ein Wirbellosen Modellsystem für Toxizitätstests im Labor

Published: July 10, 2018 doi: 10.3791/57450
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Communities for Building Active STEM Engagement, Colorado State University-Pueblo, 2Department of Biology, Colorado State University-Pueblo

Summary

In diesem Papier bieten wir ein detailliertes Protokoll für das Verfügbarmachen von Arten der Gattung Drosophila Schadstoffe mit dem Ziel der Untersuchung der Auswirkungen der Exposition zu einer Reihe von phänotypischen Ausgänge in unterschiedlichen Entwicklungsstadien und für mehr als eine Generation.

Abstract

Emergente Eigenschaften und externe Faktoren (Bevölkerung und Ökosystem-Ebene Wechselwirkungen, insbesondere) spielen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung von ökologisch wichtigen Endpunkte, obwohl sie nur selten in toxikologischen Studien betrachtet werden. D. Melanogaster entsteht Toxikologie Modellcharakter für die Verhaltensstörungen, neurologischen und genetische Auswirkungen von Schadstoffen, um nur einige zu nennen. Darüber hinaus können Arten der Gattung Drosophila als Modellsystem für eine integrative Framework-Ansatz emergente Eigenschaften zu integrieren und ökologisch relevante Fragen in der toxikologischen Forschung genutzt werden. Das Ziel dieser Arbeit soll ein Protokoll für das Verfügbarmachen von Arten der Gattung Drosophila Schadstoffe als Modellsystem für eine Reihe von phänotypischen Ausgänge und ökologisch relevante Fragen verwendet werden. Genauer gesagt, dieses Protokoll kann zur 1) mehrere biologische Organisationsebenen zu verknüpfen und die Auswirkungen von Schadstoffen auf beide einzelnen und Populationsebene Fitness; (2) testen Sie die Auswirkungen von Schadstoffen in verschiedenen Stadien der Entwicklung Exposition; (3) Test Mehrgenerationen und evolutionären Auswirkungen der Schadstoffe; und 4) gleichzeitig mehrere Schadstoffe und Stressoren zu testen.

Introduction

Jedes Jahr werden rund 1.000 neue Chemikalien durch die chemische Industrie1,2eingeführt; Allerdings werden die Umweltauswirkungen der nur ein kleiner Prozentsatz dieser Chemikalien vor Verteilung2,3getestet. Obwohl große Katastrophen ungewöhnlich sind, subletale und chronische Exposition gegenüber einer Vielzahl von Schadstoffen sind weit verbreitet bei Menschen und Tieren4,5. Im historischen Mittelpunkt der Ökotoxikologie und Umwelttoxikologie war testen Letalität, einzelne Exposition gegenüber chemischen Stoffen, akute Exposition und die physiologischen Wirkungen der Exposition, als ein Mittel zur Messung der Auswirkungen von Schadstoffen auf Überleben6, 7 , 8 , 9 , 10. zwar eine Verschiebung hin zu ethischen und nicht-invasive Methoden zu Tierversuchen, aktuelle Ansätze sind begrenzt wegen der Rolle, dass Entwicklung, emergente Eigenschaften und externen Faktoren (z. B. Bevölkerung-Ebene und ökosystemebene Wechselwirkungen) spielen bei der Vermittlung von ökologisch wichtigen Endpunkte8. Daher gibt es einen Bedarf an Methoden, die einen ganzheitlichen Ansatz zu integrieren, ohne Einbußen bei der Tier-und Pflanzenwelt und/oder Wirbeltiere im Labor.

Wirbellosen Modellsysteme wie Drosophila Melanogaster, sind eine attraktive Alternative zu der Notwendigkeit einen ganzheitlicheren Ansatz zu Toxizitätstests befassen. D. Melanogaster, wurde ursprünglich als ein Wirbellosen Modellsystem für menschliche genetische Forschungen vor etwa einem Jahrhundert entwickelt11. D. Melanogaster prominent dient heute als ein Wirbeltier modellalternative aus mehreren Gründen: 1) die Erhaltung der Gene und Wege zwischen D. Melanogaster und Menschen; (2) kurze Generationszeit im Vergleich zu fest gefügten Modellen; (3) günstige Kosten für die Wartung; (4) bei der Schaffung von großen Stichproben zu erleichtern; und 5) Fülle der phänotypischen und ökologisch-relevante Endpunkte verfügbar zum Testen11,12,13,14,15,16,17 .

Mehrere Labore11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 sind jetzt mit D. Melanogaster als ein Wirbeltier modellalternative für Toxizitätstests um zu verstehen, die Auswirkungen der Luftverschmutzung auf den Menschen. Lokale wilde Arten von Drosophila genutzt werden, ebenso wie Toxizität Modelle für Tiere (und Menschen), ökologisch zu beantworten-, verhaltensorientierte-, und evolutionär relevante Fragen auf mehreren biologischen Ebenen der Organisation. Arten innerhalb der Gattung Drosophila als Modell verwenden, sind mehrere messbare Endpunkte möglich11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. Darüber hinaus mit dem Drosophila -Modell, Toxikologen können: 1) ethisch link Effekte auf mehreren biologischen Ebenen der Organisation; (2) übernehmen Sie die Rolle der aufstrebenden Faktoren und Entwicklung; (3) Studie ökologisch wichtige Endpunkte (neben medizinisch wichtige Endpunkte); (4) testen Sie gleichzeitig mehrere Stressoren; (5) und langfristigen Test Mehrgenerationen (z. B. evolutionäre und transgenerationalen) Auswirkungen von Stressoren. Daher ermöglicht die Verwendung von Drosophila als Modellsystem eine Vielzahl von Ansätzen, nicht beschränkt auf mechanistische Ansätze mit Inzucht Stämme von D. Melanogaster im Labor zu studieren.

In diesem Papier stellen wir die Methoden für die Aufzucht und das Sammeln von Drosophila um verschiedenen toxikologischen Fragestellungen zu beantworten. Genauer gesagt, wir beschreiben die Methodik für 1) Aufzucht Drosophila in Medium geschnürt mit einem oder mehreren Schadstoffen; (2) sammeln von Drosophila während der Entwicklung (z.B. Wandern, dritte Instar Larven, pupal Fällen neu geschlüpften Erwachsene und Reife Erwachsene); und 3) Aufzucht Drosophila kontaminierten Mittel-bis Test zwischen den Generationen sowie Tradierung und evolutionären Auswirkungen der vergiftendes Langzeitexposition. Mit diesem Protokoll, frühere Autoren18,19,20,21,22,23,24haben,25 berichtet verschiedene physiologische, genetische und Verhaltensstörungen Effekte von Entwicklungsstörungen führen (Pb2 +) Belichtung. Dieses Protokoll ermöglicht Toxikologen einen ganzheitlicheren toxikologischen Ansatz verwenden, der ist für das Verständnis, wie Schadstoffe sind Risikofaktoren für Mensch und Tier in einer zunehmend belasteten Umwelt.

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Protocol

Das folgende Protokoll ist ein experimentelles Protokoll verwendet, um die Arten der Gattung Drosophila auf kontaminierten Medium hinten, bei oraler Einnahme eines Toxins geeignet ist; andere Formen der Belichtung sind möglich mit Drosophila Modell11,15,16,26. In diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden zuvor von Hirsch Et Al. beschrieben 19 und Peterson Et al. 23 , 24 , 25.

1. richten Sie Lager Populationen von Drosophila im Forschungslabor

  1. Richten Sie eine ökologisch kontrollierten Inkubator (oder kleine Zimmer) Haus Lager Populationen von Drosophila durch Festlegen der Inkubatoren für eine Konstante Temperatur, Licht: Dunkel-Zyklus und Luftfeuchtigkeit, je nach den Vorlieben der Testspezies.
    Hinweis: Bevorzugte Umweltbedingungen variieren abhängig von den einheimischen Ökologie der Arten für die Studie ausgewählt. Z. B. D. Melanogaster stammt aus Sub-Sahara Afrika27 und bleibt in der Regel bei 25 ° C, 12:12-Licht: Dunkel-Zyklus und ca. 60 % Luftfeuchtigkeit16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. auf der anderen Seite D. Montana reicht in den meisten Teilen von Kanada und den USA Mittlerer Westen, einer sehr viel kälteren Region; D. Montana wird daher in der Regel auf 19 – 20 ° C und manchmal eine leichte 24 h-Regime zu simulieren, während der fügenden Jahreszeit31gehalten. Für eine detailliertere Beschreibung der geografischen Bereiche von verschiedenen Arten von Drosophilasiehe die Drosophila Speziation Muster Webseite32.
  2. Entweder ein Lager-Center eine bevorzugte Drosophila -Arten und/oder Inzuchtlinie einzuholen (siehe Tabelle der Materialien), ein weiteres Forschungslabor auf Anfrage oder sammle Wild, genetisch Variable Populationen aus dem Feld.
    Hinweis: Die folgenden Schritte erläutern die Methoden um wilde, genetisch Variable Populationen von Drosophila weiterhin im Forschungslabor zu sammeln. Diese Methoden sind von Markow und O'Grady33 und Werner und Jaenike34 geändert worden, um die größte Artenvielfalt auf einmal anstatt besondere Zielarten mit einem Köder Quelle erfassen.
    1. Ein halbes Dutzend Reife Bananen in der Tiefkühltruhe über Nacht Einfrieren und Auftauen vor dem Köder fallen.
    2. Bereiten Sie mehrere 1 – 2 L Kunststoff-Flaschen durch Schneiden einen u-förmigen Schlitz an der Vorderseite der Flasche, fliegt in den Köder Flasche und nicht Flucht erfasst werden können. Cap die Kunststoff-Flaschen mit ihren Kronkorken, damit die fliegen über die Lider nicht entgehen.
    3. Fügen Sie die aufgetaute Banane auf den Boden der Flaschen, so dass der Boden der Flaschen ungefähr ein Zoll Banane enthält. Legen Sie eine Scheibe Reife Tomate in der Flasche. Fügen Sie einen Hefe-Slurry (den übrig gebliebenen Hefen den Herstellungsprozess Bier) die Banane an der Unterseite der Flasche, so dass die Banane bekommt in der Hefe Brei einweichen.
    4. Fügen Sie hinzu, Holzstäbchen (in aufrechter Position vertikale) in die Flasche damit die fliegen ein sauber Substrat von der Hefe Gülle und Banane auf Weg zu gehen.
      Abbildung 1 zeigt das Endprodukt dieser Methoden.
    5. Hängen Sie Köder Flaschen in den Bäumen über Nacht und überprüfen Sie, ob alle 24 h. Mund Absaugen aus Flaschen fliegt und individuell Weibchen in Fläschchen mit Mittel-bis Iso-weiblichen Linien zu erstellen.
      Hinweis: Multi-weibliche Linien, allerdings entstehen nur dann, wenn die Weibchen der einzelnen Arten eindeutig identifiziert werden können. Darüber hinaus fliegen innerhalb der Gattung Drosophila unterschiedliche ökologische Nischen besetzen und haben unterschiedliche diätetische Anforderungen je nach diesen Nischen (Werner und Jaenike34); Siehe Werner und Jaenike34 für Diät-Empfehlungen und Rezepte.
    6. Untersuchen Sie die Erwachsenen F1 Nachkommen unter dem Mikroskop Dissektion um die Arten der gesammelten Drosophila zu identifizieren (siehe Markow und O'Grady33 und Werner und Jaenike34 für Hilfe bei der Identifizierung von verschiedenen Arten ).

Figure 1
Abbildung 1 : Bildliche Darstellung von fallen und Köder verwendet, um wilde Populationen von Drosophila im Feld sammeln. (A) Fly fallen auf ein lokales Feld Standort in Colorado. (B) ein näher Blick auf die Fliegen fallen auf dieser Wiese. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Pflegen Sie das Iso-Weibchen oder die Multi-weiblichen Linien in einem ökologisch kontrollierten Inkubator oder Raum mit konstanter Temperatur, Licht: Dunkel-Zyklus und Feuchtigkeit. Um dies zu tun, Haus fliegt in Fläschchen oder Flaschen in Medium bevorzugt und die trächtigen Weibchen zur Eiablage in das Medium zu ermöglichen. Überwachen Sie die Fläschchen auf das Vorhandensein von Larven und Puppen.
    Hinweis: Fliegen innerhalb der Gattung Drosophila unterschiedliche ökologische Nischen besetzen und haben unterschiedliche Ernährungsbedürfnisse und Umwelt abiotischen Vorlieben abhängig von diesen Nischen33,34. Ökologische Präferenzen und Ernährungsempfehlungen (und weitere Anweisungen auf Fliege Tierhaltung) finden Sie in Elgin und Miller28, Shaffer Et Al. 29, Stocker und Gallant30Markow und O'Grady33und Werner und Jaenike34. Wenn Wildfänge Arten verwenden, können lokale Umweltbedingungen in den Inkubatoren simuliert werden, bis die Spezies identifiziert werden können.
  2. Übertragen Sie Aktien häufig auf frisches Medium, gesunde Linien zu erhalten und vermeiden Infektion durch Milben alten Fläschchen zu verwerfen.
    Hinweis: Die Häufigkeit der Übertragung hängt von den Lebenszyklus der Art. Übertragen Sie Drosophila Melanogaster werden z. B. alle 2 Wochen auf frisches Medium. Weitere Informationen zur Verwaltung von Linien im Labor, siehe Rand Et Al. 16, Elgin und Miller28, Shaffer Et Al. 29, Stocker und Gallant30, Greenspan35und naturwissenschaftliche Bildung Datenbank36.

(2) hinten Drosophila kontaminierten Mittel-

Hinweis: Wenn Drosophila im Labor zum ersten Mal oder mit einem neuen Verunreinigung(s) testen, identifizieren die letale Dosis (siehe Castaneda Et Al. 37 und Massie Et al. 38 für Methoden) und die LD50 (siehe Castaneda Et Al. 37 und Akins Et Al. 39 für Methoden) erste. Führen Sie dann eine Dosis-Wirkungs-Kurve, um biologisch relevante Konzentrationen für die gewünschte phänotypischen Ausgabe zu identifizieren; sehen Sie Hirsch Et Al. 19 und Zhou Et Al. 40 für Methoden.

  1. Vorbereiten des kontaminierten Mediums auf die gewünschte konzentrasion(s), abhängig von der Chemie der Verunreinigung auf lagerlösungen.
    Hinweis: zum Beispiel, um Stammlösungen PbAc vorbereiten: Stammlösungen Bleiacetat (PbAc) Medium indem Verunreinigung zu destilliertem Wasser (dH20) bis Medium gemacht mit Wasser erreicht gewünschte Schadstoffkonzentration vorzubereiten. Zum Beispiel eine Stammlösung von 1.000 µM PbAc, können werden vorbereitet, indem man PbAc, dH20 bis 1.000 µM erreicht PbAc. Stammlösung (z.B. die 1.000 µM PbAc Lösung) weiter, um die gewünschte Konzentration zu verdünnen (z. B. 500 µM PbAc) und pflegen diese Lösungen als Lager als auch.
  2. Bereiten Sie Medium, folgende Herstellerangaben als das Steuermedium dienen. Zusätzliche Mittel, folgende Herstellerrichtlinien vorzubereiten; jedoch bereit Ergänzung Verunreinigung Lösung für dH20.
    Hinweis: zum Beispiel, wenn Nu Drosophila Medium verwenden, fügen Sie etwa einen Teelöffel instant Medium zu einem Kunststoff-Fläschchen hinzu. Das Medium ca. 5 – 5,5 mL dH20 hinzufügen. Streuen Sie ein paar Körner live Bäckerhefe Steuermedium vorzubereiten. Zur Vorbereitung der experimentellen Mittel ergänzen die Stammlösung (z. B. 500 µM PbAc) für dH20.
  3. Übertragen Sie reproduktiv lebensfähigen Reife Männchen und Weibchen aus Lager Populationen in der Kontrolle und dem experimentellen Medium.
    Hinweis: Die Zeit nach dem bewegungsapparate, Geschlechtsreife unterscheidet zwischen der Drosophila -Arten-41.
    1. Klopfen Sie leicht das Fläschchen Lager fliegen nach unten mit der dominanten Hand. Stellen Sie sicher, dass die fliegen automatisch an das Ende des Röhrchens verschieben. Entfernen Sie mit der anderen Hand die Kappe des Fläschchens beim Tippen auf das Fläschchen und legen Sie ein frisches Fläschchen oder verunreinigte Medium auf das Fläschchen mit den fliegen. Halten Sie die Fläschchen zusammen und drehen Sie sie um, leichtes Klopfen, so dass die fliegen automatisch auf das frische Fläschchen oder verunreinigte Medium übertragen werden. Während noch Antippen der Durchstechflasche mit dem fliegen, Kappe das Fläschchen.
    2. Wiederholen Sie mit mehr Fläschchen, und achten Sie auf die Anzahl der fliegen in jedes Fläschchen zu standardisieren.
      Hinweis: Die Gesamtzahl der Erwachsenen übertragen über einzelne Übertragung oder Anästhesie hängt die Größe der Ampullen verwendet, um eine Überfüllung zu vermeiden.
    3. Brüten Sie Erwachsene in einem standard ökologischen Zustand (d. h. ein Inkubator) und ermöglichen Sie die Erwachsenen, paaren sich und legen ihre Eier in das Medium für 24 / 96 h.
    4. Nach 24 – 96 h, verwerfen Erwachsene in einem Leichenschauhaus (eine Flasche gefüllt mit Mineralöl und begrenzt mit einem eng anliegenden Trichter) hinterließ befruchtete Eier (die später die Versuchspersonen werden) zu Testzwecken Reifen. Legen Sie die Fläschchen in den Inkubator ermöglicht die Eier zu entwickeln.
    5. Überwachen Sie die Fläschchen für wandernde Instar Larven durch auf der Suche nach Larven, die aus dem Medium zu entwickeln.

3. Sammeln von Versuchspersonen in verschiedenen Entwicklungsstadien

Hinweis: Versuchspersonen können in jedem Entwicklungsstadium, platziert in den blinden codierten 15 mL konische Röhrchen und getestet für die Akkumulation gesammelt werden. Methoden zur Prüfung der Ansammlung von Verunreinigungen hängt von der Verunreinigung untersucht. Zum Beispiel kann Ansammlung von PbAc mit Inductively-Coupled Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS)42getestet werden. Darüber hinaus können die Versuchspersonen in jeder Entwicklungsphase für eine Vielzahl von phänotypischen Effekten von Verunreinigungen getestet werden gesammelt werden. Abbildung 2 veranschaulicht die Drosophila -Life-Cycle-43. Abbildung 3 illustriert das experimentelle Protokoll für die Belichtung und die verschiedenen Entwicklungsstadien für Sammlung.

Figure 2
Abbildung 2 : Konzeptionelle Übersicht über den gesamten Lebenszyklus von D. Melanogaster (das am häufigsten verwendete Drosophila Modellsystem). Die Phasen des Lebenszyklus von Drosophila sind: (1) Ei, Larve (2) erste Instar, 3) zweiten Instar Larve, (4) dritte Instar Larve, 5) dritte Instar Larve, Wandern (6) White-eye Puppe, 7) rote-Augen-Puppe, 8) neu-geschlüpften Erwachsenen und 9) älterer Erwachsener. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Grundlegende Übersicht der Methoden zur Aufdeckung von Drosophila Oral kontaminierten Medium in der elterlichen (F-0) und die nachfolgenden Generationen (F1 und höher). (A) Methoden für die orale Exposition während der Entwicklung in der exponierten Generation. (B) Methoden der Übertragung von Kontaminanten an Nachkommen (F1 bis die gewünschte Generation) zu testen. Diese Zahl wurde von Peterson Et Al. modifiziert 24 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Wandern-dritte Instar Larven sammeln
    1. Starten Sie die Überwachung Fläschchen, wenn Lichter in den Inkubator einschalten Larven werden vom Medium entstehen und bewegen sich nach oben auf der Seite das Fläschchen in ein h nach Schalten Sie Lichter im Inkubator. Innerhalb dieser h entfernen Sie Bummel durch Dritte Instar Larven von den Seiten des Fläschchens sorgfältig mit einem Holzstab oder einer Pinzette
      Hinweis: Die Anzahl der Larven abholbereit hängt von der Anzahl der Eier in "2.3.4".
    2. Um überschüssige Mittel aus den Larven zu entfernen, legen Sie die Larven in einen kleinen Becher mit dH2O. Pour dH2O aus dem Becher und die Larven auf eine heikle Aufgabe Wischer. Entfernen Sie mit einer heiklen Aufgabe Wischer, vorsichtig die überschüssige dH2O aus die Larven.
    3. Pflegen Sie experimentellen Populationen im Brutkasten ökologisch kontrolliert.
  2. Sammeln Sie neu geschlüpften Erwachsene
    1. Monitor-Fläschchen für bewegungsapparate anhand der Färbung der Puppen entlang der Seiten des Vials.
      Hinweis: Während der Entwicklung werden Puppen dunkler. Entwicklungszeit, besonders vor bewegungsapparate hängt von der Spezies getestet.
    2. Wenn die ersten Erwachsenen zu Eclose beginnen, dump und entsorgen Sie diese Erwachsenen in einem Leichenschauhaus mit Mineralöl.
    3. Wenn die Lichter in den Inkubator am nächsten Morgen einschalten, dump und verwerfen alle Erwachsenen unbekannt Alter (oder Jungfräulichkeit), die geschlüpften über Nacht oder während der Morningbefore Lichter haben können, auf.
    4. Ca. 4 h später, alle Erwachsenen, die sich als neu geschlüpften Erwachsene mit einer CO2 Pistole in das Fläschchen zu betäuben. Legen Sie Erwachsene auf einen CO2 Teller unter dem Mikroskop Dissektion. Sex Erwachsene durch auf der Suche nach Sex Kämme auf die Vorderbeine der Männchen und Renderbild bei Frauen.
      Hinweis: D. Melanogaster muss innerhalb von 6 h des bewegungsapparate Paarung vermeiden gesammelt werden aber andere Arten können mehr Entwicklungs-Zeiten haben (und daher auch nicht innerhalb dieses Zeitrahmens gesammelt werden müssen).
    5. Separate Erwachsene auf dem CO2 Teller mit einem Holzstab. Erwachsene in geschlechtsspezifische Gruppen mit einem Holzstab auf die mittlere passenden vorbestehenden Geschichte sanft zu übertragen.
  3. Post-bewegungsapparate Reife Erwachsene zu sammeln
    1. Können Sie Erwachsene auf die mittlere passenden Pre bewegungsapparate Exposition gegenüber Eistadium auf das gewünschte Alter Post-bewegungsapparate im Brutkasten ökologisch kontrolliert bleiben.
    2. Übertragen Sie Erwachsene auf das Steuermedium für 24 h vor der Prüfung damit Erwachsene, überschüssige kontaminierten Medium ihre Körper pflegen können einzeln.

(4) hinten Versuchspersonen, die Auswirkungen der Mehrgenerationen oder transgenerationalen Belichtung zu testen.

  1. Um die elterliche Generation (aka P0 oder F0 Generationen) hinten, übertragen Sie Erwachsene aus Lager Populationen zu kontrollieren und das experimentelle Medium nach den Schritten in "2.1" auf "2.3" und "3.1" auf "3.3".
  2. Wenn die Erwachsenen reproduktiv reif sind (siehe Pitnick Et Al. 41), einzeln Transfer (lt. 2.3.1) ein Fläschchen von Männern zu einem frischen Fläschchen der Kontrolle oder experimentelle Medium. Übertragen Sie eine Durchstechflasche Weibchen auf frisches Fläschchen, das Männchen jetzt enthält einzeln. Ermöglichen Sie Erwachsenen, Paaren und Eier legen in das Medium für 24-96 h Dump und verwerfen Sie Erwachsene in einem Leichenschauhaus mit Mineralöl zu und neu inkubieren Sie Fläschchen um Nachwuchs zu ermöglichen.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.2 abhängig von der gewünschten Anzahl der Generationen.

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Representative Results

Durch mündlich belichten Drosophila Verunreinigung(s) während der gesamten Entwicklung, können verschiedenen toxikologische Fragestellungen getestet werden, indem man Drosophila auf verschiedenen Ebenen der biologischen Organisation. In diesem Abschnitt werden repräsentative Ergebnisse unter Verwendung dieses Protokolls in zuvor veröffentlichten Papiere23,24. Dieses Protokoll war insbesondere zur Bewertung der Akkumulation, Beseitigung und Sequestrierung von Blei (Pb) innerhalb der gleichen Generation der Exposition und über die erste Generation von Nachkommen23früher; und die Implikation der Akkumulation auf Mate Wahl24zu studieren.

Tabelle 1 und Abbildung 4 zeigen repräsentative Ergebnisse unter Verwendung dieses Protokolls, die Ansammlung und Beseitigung von Pb im F0 und F1 Generationen bestimmen.

Tabelle 1 zeigt die repräsentative Ergebnisse bezeichnend für die Anhäufung von Pb wenn innerhalb Generation ausgesetzt (bei verschiedenen Dosen: 0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 und 500 µM PbAc) in Proben in mehrere Entwicklungsstadien (dritte Instar Larven Wandern pupal Fälle, neu geschlüpften Erwachsene und Reife Frauen und Männer) in Peterson Et Al. 23 Proben wurden in verschiedenen Entwicklungsstadien, bei-20 ° C eingefroren, mit Salpetersäure und Wasserstoffperoxid behandelt und getestet für Pb mit ICP-MS23,42gewonnen.

Dosis (µM PbAc) Larve Pupal Fällen Neu geschlüpften Erwachsene Reife adulte Weibchen Reife Männchen
0 0,009 ± 0,001 0.099 ± 0,02 0,04 ± 0,005 0.069 ± 0.031 0.0015 ± 0,003
10 0,42 ± 0,025 0,46 ± 0,03 0.12 ± 0,009 0.12 ± 0,012 0.056 ± 0,008
40 7,5 ± 0,67
50 5.2 ± 0,71 2,77 ± 0,30 1.11 ± 0,14
75 14 ± 1.06
100 12 ± 0,95 4,7 ± 0,38 3,36 ± 0,58 1,20 ± 0,63 1.24 ± 0,46
250 89 ± 8,49 25.06 ± 4.72 5.46 ± 0,75
500 271 ± 41.01 334.30 ± 39,43 8.44 ± 0,84 46,50 ± 14.72 14.43 ± 1,83

Tabelle 1: meine Pb Lasten (ng/Einzelperson) getestet D. Melanogaster während der Entwicklung nach der oralen Exposition gegenüber Pb von Eistadium Bühne zu testen. Mittel (ng/Fliege) ± Standardfehler von Mittelwert dargestellt (n = 8 Larve, n = 3 Kontrolle aufgezogen Erwachsene, n = 3 Erwachsene Pb aufgezogen). Wildtyp D. Melanogaster auf Steuerelement aufgezogen wurden oder verbleit Medium (0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 oder 500 µM PbAc) von Eistadium in verschiedenen Stadien der Entwicklung. Proben wurden gesammelt und getestet für Pb Akkumulation mit ICP-MS.42 , die diese Tabelle von Peterson Et al.geändert wurde. 23

In Abbildung 4die elterlichen Generation (F0) Pb aus Ei Stufen bis zum Erwachsenenalter, gedeckt in Steuermedium, ausgesetzt war und die erste Generation der Nachkommen (F1) bis zum Erwachsenenalter24in Steuermedium aufgezogen wurden. Methoden zur Erkennung von Pb Ansammlung und Beseitigung waren ähnlich wie Peterson Et Al. 23. Ergebnisse aus diesem Experiment zeigen, dass elterliche Belastung nicht auf die erste Generation von Erwachsenen Nachkommen24übertragen wird. Daher ist es unter Verwendung dieses Protokolls, möglich, adaptive Reaktionen bei unterschiedlichen evolutionären Maßstäben sowie generationsübergreifende Auswirkungen der F0 Exposition zu testen. Ähnliche Ergebnisse wurden in Peterson Et al.gefunden. 23

Figure 4
Abbildung 4: PB-Akkumulation in D. Melanogaster (A) Eltern (F0) und (B) unbelichteten Nachkommen (F1). Balken (A) und (B) zeigen bedeuten (ng/Erwachsene) ±SEM. Stichprobengrößen obigen Balken in (A) und (B). = p < 0,001. (A) F0 Erwachsene wurden mündlich ausgesetzt bis 250 µM PbAc unter Verwendung dieses Protokolls von Eistadium, Alter 5D nach bewegungsapparate und gesammelten Alter 6 Tage nach dem bewegungsapparate (nach 24 h Ausscheidungsmuster) für Pb-Ansammlung mit ICP-MS.42(B) getestet werden F0 Erwachsene wurden in Behandlung in Steuermedium gedeckt. Unbelichtete F1 Nachkommen wurden in Steuermedium von Eistadium bis zum Erwachsenenalter (unter Verwendung dieses Protokolls) aufgezogen und für Pb Akkumulation mit ICP-MS getestet. In (B): "CF + CM"= F1 Erwachsenen mit Eltern aufgezogen in Steuermedium, "CF + PbM" = F1 Erwachsene mit Vätern aufgezogen in verbleitem Medium, "PbF + CM" = F1 Erwachsene mit Müttern aufgezogen in verbleitem Medium, "PbF + PbM" = F1 Erwachsene mit Eltern aufgezogen in verbleitem Medium. Diese Zahl wurde von Peterson Et Al. modifiziert 24 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Die in Tabelle 1 und Abbildung 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Drosophila leicht Pb in verschiedenen Dosierungen, Entwicklungsstadien und evolutionäre Skalen unter Verwendung dieses Protokolls ansammelt. Daher deutet dies auf das Protokoll Wirksamkeit bei der Aufdeckung D. Melanogaster mit einer mündlichen Verunreinigung.

In Abbildung 5wurde das hier beschriebene Protokoll von Peterson Et Al. verwendet. 24 , die Auswirkungen einer Entwicklungsstörung Pb auf Mate Präferenz zu testen. Versuchspersonen aus Eistadium aufgezogen wurden, bis ins Erwachsenenalter auf Kontrolle oder verbleit Medium von Eistadium bis zum Erwachsenenalter und für Mate Präferenz nach 24 h Ausscheidungsmuster getestet. Peterson Et Al. 24 festgestellt, dass Pb-exponierten Weibchen bevorzugt mit Pb-exponierten Männchen wenn die Möglichkeit eines Steuerelements oder einer Pb-exponierten Männchen verpaart. Diese Ergebnisse sind ein repräsentatives Beispiel für die Umsetzung des Protokolls zu phänotypische Ausgabe untersuchen.

Figure 5
Abbildung 5: Mate bevorzugt bei Männern und Frauen ausgesetzt bis 250 µM inszenieren PbAc vom Ei bis zum Erwachsenenalter. Bars in (A), (B) und (C) mittlere Prozent (%) Erfolg (in nur 60 Minuten) ± SEM Paarung zeigen *** = p < 0,001. * = p < 0,05. Versuchspersonen in (A), (B) und (C) Kontrolle ausgesetzt waren oder verbleit Medium (250 µM PbAc) vom Ei Stufen bis ins Erwachsenenalter Reife und getestet für Unterschiede in der Partnerwahl. (A) weibliche Vorliebe für entweder Kontrolle oder Pb aufgezogen Männchen (d.h. zwei-Choice-Test). Stichprobengrößen waren: N = 126 Kontrolle aufgezogen Weibchen und 137 Pb aufgezogen Weibchen. (B) männliche Vorliebe für Kontrolle und Pb aufgezogen Weibchen (d.h. zwei-Choice-Test). Proben-Größen waren: N = 59 Männer Kontrolle aufgezogen und N = 64 Pb aufgezogen Männchen. Paaren Sie (C) bevorzugt in Männchen und Weibchen einzeln in Verbindung mit einem Partner der beiden Exposition (d.h. nicht-Choice-Tests). In (C): "CF + CM" = ein Steuerelement aufgezogen Weibchen mit einem Steuerelement aufgezogen männlich gepaart (N = 85 Paare), "CF + PbM" = ein Steuerelement aufgezogen Weibchen mit einem Pb aufgezogen Männchen gepaart (N = 79 Paare), "PbF + CM" = ein Pb aufgezogen Weibchen mit einem Steuerelement aufgezogen männlich gepaart (N = 91 Paare), "PbF + PbM"= ein Pb aufgezogen Weibchen + Pb aufgezogen männlich (N = 98 Paare). Diese Zahl wurde von Peterson Et Al. modifiziert 24. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Drosophila Melanogaster wurde als ein leistungsfähiges Modell für eine Reihe von biologischen Prozessen aufgrund der umfangreichen Erhaltung der Gene und Wege zwischen D. Melanogaster und Menschen13,14gegründet. Aus den gleichen Gründen ist es ein leistungsfähiges Modell für die medizinische Wissenschaft hat Drosophila als geeignete Modellsystem zur Untersuchung der Auswirkungen der anthropogenen Umweltverschmutzung auf eine Reihe von toxikologischen Endpunkten entstanden. Mehrere Labore benutzen erfolgreich D. Melanogaster als Modellsystem, um eine Reihe von Verbindungen, einschließlich Schwermetalle11,16,18–25,37 studieren ,38,39,40,44,45, Ethanol46, Nanopartikel26,47, Pestizide,48 , und Lösungsmittel49. Trotz der jüngsten Bemühungen, Drosophila als Toxikologie Modell zu nutzen ist seine Verwendung als Modellsystem, unzählige toxikologischen Fragestellungen zu beantworten noch in den Kinderschuhen. Allerdings ist angesichts seines umfangreichen Einsatzes als Modell für medizinisch-bezogene Endpunkte sowie den Einsatz in ökologisch50 und evolutionären Studien17, sein Potenzial als toxikologischen Modellsystem enorm.

Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Aufzucht verschiedener Arten innerhalb der Gattung Drosophila auf kontaminierten Medium für verschiedenen toxikologischen Endpunkten zu testen. Obwohl andere Formen der Belichtung möglich konzentriert sich mit Drosophila als Modell (z.B. Inhalation und dermale Exposition), dieses Protokoll auf der oralen Einnahme von Schadstoffen, die für Verunreinigungen, die aufgenommenen (natürlich wäre wie über die Nahrungskette). Diese Methoden bieten Platz für die Verwendung mehrerer Drosophila -Arten und Verunreinigungen. Wild, genetisch Variable Populationen von Drosophila können auch im Bereich gesammelt und gepflegt im Forschungslabor. Es gibt viele Möglichkeiten von fallen und Köder, die verwendet werden kann, abhängig von der Spezies Nahrungsmittelpräferenzen; für Feld Reiseführer Auflistung dar siehe Markow und O'Grady33 und Werner und Jaenike34. Darüber hinaus die Methoden könnte geändert werden, um die Auswirkungen von Entwicklungsstörungen Exposition an den verschiedenen kritischen Entwicklungs-Perioden zu bestimmen und Mehrgenerationen Langzeittests der Schadstoff-Exposition ermöglicht.

Die entscheidenden Schritte dieser Methoden gehören: Bestände in ökologisch kontrollierten Bedingungen, (2) Vermeidung von Überbelegung der Fliege Populationen, (3) verdünnen der Test Schadstoff entsprechend ihrer chemischen Eigenschaften und (4) die Wahl fliegen Pflege (1) biologisch relevante Konzentrationen von der Test-Verunreinigung. Erhaltung der Bestände in ökologisch-regulierten Inkubatoren (oder einen kleinen Raum) sorgt dafür, dass zusätzliche Variationen in Umweltbedingungen Ergebnisse nicht verwirren zu tun. Darüber hinaus saisonale Schwankungen im Verhalten wurden bisher51 gefunden und mehrere Drosophila -Arten geben Sie Diapause über die Winter-52. Zweite, larval Überbelegung kann lang anhaltende Auswirkungen auf die Entwicklung30Erwachsenen Körper Größe30und Langlebigkeit53haben. Darüber hinaus ist die Verdünnung der Verunreinigung ein wesentlicher Schritt, um sicherzustellen, dass der Schadstoff für Drosophila akkumulieren Verunreinigung biologisch verfügbar ist. Zum Beispiel ist PbAc andere Chemikalien notwendig erweisen, in salzhaltigem Wasser oder Ethanol aufgelöst werden aufgelöst, dH2O23,24,25. Auswahl biologisch relevante Konzentrationen von Verunreinigung kann die Richtung der Ergebnisse beeinflussen; niedrige Dosen von PbAc erhöhen beispielsweise die mittlere Zahl Weibchen Paarung mit Männchen (innerhalb von 20 Minuten), während höhere Dosen zeigen signifikante Abnahme in die mittlere Anzahl der Weibchen Paarung19. Um biologisch relevante Konzentrationen von der Test-Verunreinigung zu identifizieren, sollten Leser laufen Vorstudien zur Ermittlung die letale Dosis und LD50 die entsprechenden Dosen durchzuführen eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu bestimmen. Durch das Ausführen einer Dosis-Wirkungs-Kurve um eine Reihe von Konzentration auf einen bestimmten Endpunkt zu testen, konnte Leser Dosen herauszufiltern, die entweder "positiv" oder "gefährlichen" Individuen oder Populationen sind für weitere Tests.

Dieses Protokoll bietet einen Weg, um zu bestimmen: 1) das Zusammenspiel von mehreren biologischen Organisationsebenen auf Fitness und toxikologische Endpunkte; (2) die Rolle der Entwicklungs- und emergent Faktoren; (3) ökologisch wichtige Endpunkte; (4) medizinisch-wichtige Endpunkte; (5) wie mehrere Stressoren interagieren Ergebnisse hervorbringen; und 6) die Auswirkungen der langfristigen Exposition, die über Generationen hinausgeht. Um die Wirksamkeit dieses Protokolls zu veranschaulichen, wurden Beweise vorgelegt darauf hinweist, dass Personen während der gesamten Entwicklung Pb (Tabelle 1)23,24ansammeln. Darüber hinaus repräsentative Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Auswirkungen der Exposition auf ökologisch wichtige Endpunkte zu testen (zB., die Auswirkungen der Entwicklungsbiologie Pb-Exposition auf Mate Wahl24). Darüber hinaus haben andere getestet, die Auswirkungen von Schadstoffen auf mehreren biologischen Organisationsebenen (inkl. physiologische18,21, genetische20,22 und phänotypischen-Level19 , 23 , 24 , ( 25), medizinisch wichtige Endpunkte18,20,21,22,23und langfristige Mehrgenerationen Effekte23,24 ,25,54. Vorläufige Daten zufolge außerdem Entwicklungsstörungen Pb Exposition transgenerationalen epigenetische Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit in D. Melanogaster54induziert. Eine wichtige Einschränkung dieses Protokolls ist, dass die Verwendung dieses Protokolls mit Drosophila in den Kinderschuhen steckt. Daher gibt es begrenzte Publikationen18,19,20,21,22,23,24,25 das Potenzial des Protokolls für zusätzliche toxikologische, wie die Rolle der Entwicklung emergent Faktoren, zusätzliche ökologisch wichtige Endpunkte, mehrere Stressoren und evolutionären Auswirkungen der Exposition Fragen anzugehen.

Unter Verwendung dieses Protokolls, können Leser Verunreinigungen, die natürlich aufgenommen werden mit biologisch relevante Methoden testen. Kontinuierliche Flüssigfütterung entwickelt von Soares Et al.. 55 ist ein alternativer Ansatz zur oralen Einnahme, insbesondere für schädlingsbekämpfungsmittelbelichtung. Ist jedoch kontinuierliche Flüssigfütterung für Erwachsene Einnahme von flüssigen Verunreinigungen geeignet und gilt nicht für Verunreinigungen wo Einzelpersonen exponierten Pre bewegungsapparate sein. Dies ist besonders wichtig, angesichts des Potenzials für kritische Phasen in der Entwicklung für die Belichtung. Frühere Studien haben eine kritische Phase für Pb Exposition23gezeigt. Daher sollten Drosophila ausgesetzt werden während der Entwicklung zu vermeiden, die mögliche aktive Beseitigung der Verunreinigungen von Drosophila vor dem Test bis kritische Perioden bestimmt werden können.

Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir ein Protokoll zur mündlich Drosophila Verunreinigungen ausgesetzt zur Verfügung gestellt. Mit diesem Protokoll und Modell System können Toxikologen gegen ethische und nicht-invasive Methoden zu Tierversuchen und beinhaltet gleichzeitig einen ganzheitlicheren Ansatz zum Verständnis der Auswirkungen von Schadstoffen8verschieben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Publikation wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Bildungsministerium (PR-Preis #P031C160025-17, Titel des Projekts: 84,031 C) an der Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) Gemeinschaften zu bauen aktiv STEM Engagement (C-BASE). Wir bedanken uns bei aktuellen Zoologie und Elsevier für die Bereitstellung der Nutzungsrechte an die repräsentativen Ergebnisse veröffentlicht in früheren Arbeiten, sowie die Redaktion des Jupiter für bietet uns die Gelegenheit, dieses Protokoll zu veröffentlichen. Wir möchten auch die C-BASE Programm, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE und Institut für Biologie, CSU-Pueblo), CSU-Pueblo-Biologie-Abteilung, danke Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (Institut für Biologie, Skidmore College) und Dr. Claire Varian Ramos (Institut für Biologie, Kolorado Landesuniversität-Pueblo) für ihre Unterstützung und Hilfe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24 Carolina Biological 173204
Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit Genessee Scientific 32-116SB Used to store flies
Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials Genessee Scientific 49-102 Used to store flies
Cardboard trays, trays only, narrow Genessee Scientific 32-124 Used to organize populations of flies
Cardboard trays, dividers only, narrow Genessee Scientific 32-126 Used to organize populations of flies
Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure Fischer Scientific 03-312D Useful for storage of contaminants
Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles Fischer Scientific 03-409-17C Useful for storage of contaminants
Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser Fischer Scientific 14-287-150 Used to prepare medium
Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips Fischer Scientific 13-683-708 Used to prepare medium
Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm) Genessee Scientific 59-114 Used to anesthetize flies
Flystuff foot valve Genessee Scientific 59-121 Used to anesthetize flies
Tubing, green (1 continguous foot/unit) Genessee Scientific 59-124G Used to anesthetize flies
Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle VWR 97064-130 Used to make a morgue
Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2 Walmart Not applicable Used to make a morgue
BGSET5 Glass Beaker Set Of 5 Walmart
Inbred or wildtype line of Drosophila Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University https://bdsc.indiana.edu
Wild popultions of Drosophila UC San Diego Drosophila Stock Center https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php

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Biologie Ausgabe 137 Toxikologie Ökotoxikologie integrative behavioral Ökotoxikologie emergente Eigenschaften emergente Eigenschaften Wandern-dritte Instar Larven Puppen bewegungsapparate zwischen den Generationen generationsübergreifende
Experimentelles Protokoll für die Verwendung von <em>Drosophila</em> als ein Wirbellosen Modellsystem für Toxizitätstests im Labor
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Peterson, E. K., Long, H. E.… More

Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory. J. Vis. Exp. (137), e57450, doi:10.3791/57450 (2018).

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