Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forsøgsplan for at bruge Drosophila som hvirvelløse modelsystem for afprøvning af toksicitet i laboratoriet

Published: July 10, 2018 doi: 10.3791/57450
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Communities for Building Active STEM Engagement, Colorado State University-Pueblo, 2Department of Biology, Colorado State University-Pueblo

Summary

I dette papir giver vi en detaljeret protokol for udsætter arter i slægten Drosophila til forurenende stoffer med mål at studere virkningerne af eksponering på en række fænotypiske udgange på forskellige udviklingsstadier og for mere end én generation.

Abstract

Emergente egenskaber og eksterne faktorer (befolkning- og økosystem-niveau interaktioner, navnlig) spille en vigtig rolle i mægle økologisk vigtige slutpunkter, selv om de sjældent betragtes som toksikologiske undersøgelser. D. melanogaster fremstår som en toksikologi model for de adfærdsmæssige, neurologiske og genetiske virkninger af giftstoffer, at nævne nogle få. Endnu vigtigere, kan arter i slægten Drosophila udnyttes som en modelsystem for en integrativ ramme tilgang at indarbejde emergente egenskaber og besvare økologisk relevante spørgsmål i toksikologi forskning. Formålet med dette dokument er at give en protokol for udsætter arter i slægten Drosophila for forurenende stoffer, der skal bruges som et modelsystem for en række fænotypiske udgange og økologisk relevante spørgsmål. Mere specifikt, kan denne protokol bruges til 1) linke flere biologiske niveauer af organisation og forstå virkningen af giftige stoffer på både individ og befolkningen niveau fitness; 2) test virkningen af giftige stoffer på forskellige stadier af udviklingsmæssige eksponering; 3) test mindretalsspørgsmålet og evolutionære konsekvenser af forurenende stoffer; og 4) teste flere forurenende stoffer og stressfaktorer samtidigt.

Introduction

Hvert år, er cirka 1.000 nye kemikalier indført af den kemiske industri1,2; men de miljømæssige konsekvenser af kun en lille procentdel af disse kemikalier er testet før distribution2,3. Selv om store katastrofer er ualmindelige, subletale og kronisk eksponering for en lang række forurenende stoffer er udbredt i både mennesker og dyreliv4,5. Økotoksikologi og miljø toksikologi historiske fokus var at teste dødelighed, enkelt kemisk eksponering, akut eksponering og de fysiologiske virkninger af eksponering, som et middel til at måle effekten af forurenende stoffer på overlevelse6, 7 , 8 , 9 , 10. selv om der er et skift i retning af etiske og ikke-invasive metoder til dyreforsøg, nuværende strategier er begrænsende på grund af rollen, at udvikling, emergente egenskaber og eksterne faktorer (såsom befolkningen niveau og økosystem-niveau interaktioner) spiller i mægle økologisk vigtige slutpunkter8. Der er derfor behov for metoder, indarbejde en mere holistisk tilgang uden at ofre dyreliv og/eller hvirveldyr i laboratoriet.

Hvirvelløse modelsystemer, såsom Drosophila melanogaster, er et attraktivt alternativ til at løse behovet for en mere holistisk tilgang til afprøvning af toksicitet. D. melanogaster, blev oprindeligt udviklet som et hvirvelløse modelsystem for human-relaterede genetiske forskning om et århundrede siden11. D. melanogaster er nu prominently bruges som en hvirveldyr model alternativ af flere grunde: 1) bevarelse af gener og veje mellem D. melanogaster og mennesker; 2) kort generationstid i forhold til hvirveldyr modeller; 3) billige pris af vedligeholdelse; 4) lette generere store stikprøvestørrelser; og 5) overflod af fænotypiske og økologisk-relevante endpoints anvendelig nemlig prøvning11,12,13,14,15,16,17 .

Flere laboratorier11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 nu bruger D. melanogaster som en hvirveldyr model alternativ til afprøvning af toksicitet for at forstå virkningerne af forurening på mennesker. Lokale vilde arter af Drosophila kan blive udnyttet, såvel som toksicitet modeller for vilde dyr (og mennesker) at besvare økologisk-, behaviorally-, og evolutionært relevante spørgsmål på flere biologiske niveauer af organisationen. Ved hjælp af arter i Drosophila slægt som en model, er flere målbare slutpunkter muligt11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. In addition, ved hjælp af Drosophila model, toksikologer kan: 1) etisk link effekter på flere biologiske niveauer af organisationen; 2) indarbejde rolle emergent faktorer og udvikling; 3) undersøgelse økologisk vigtige slutpunkter (ud over lægeligt vigtigt slutpunkter); 4) teste flere stressfaktorer samtidigt; 5) og test langsigtede mindretalsspørgsmålet (fx evolutionære og transgenerationel) konsekvenser af stressorer. Derfor muliggør bruger Drosophila som en modelsystem en mangfoldighed af tilgange, ikke begrænset til at studere mekanistiske tilgange med indavlede stammer af D. melanogaster i laboratoriet.

I dette papir præsenterer vi metoderne til opdræt og indsamle Drosophila at besvare forskellige toksikologiske spørgsmål. Mere specifikt beskriver vi metoden for 1) opdræt Drosophila i medium snøret med et eller flere forurenende stoffer; 2) indsamling Drosophila i hele udvikling (f.eks. vandrer tredje-instar larver, puppe sager, nyligt eclosed voksne og modne voksne); og 3) opdræt Drosophila forurenet mellemlang test mellem generationerne samt transgenerationel transmission og evolutionære konsekvenser af giftstof langtidseksponering. Ved hjælp af denne protokol, tidligere forfattere18,19,20,21,22,23,24har,25 rapporteret forskellige fysiologiske, genetiske og adfærdsmæssige effekter af udviklingsmæssige føre (Pb2 +) eksponering. Denne protokol giver mulighed for toksikologer for en mere holistisk toksikologiske metode, som er nødvendigt for at forstå hvordan forurenende stoffer er risikofaktorer for både mennesker og dyr i en stadig mere forurenet miljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende protokol er en eksperimentel protokol, der bruges til bageste arter i Drosophila slægten på forurenede medium, når oral indtagelse af et toksin er passende; andre former for eksponering er muligt ved hjælp af Drosophila model11,15,16,26. De i denne protokol beskrevne metoder er tidligere beskrevet af Hirsch et al. 19 og Peterson et al. 23 , 24 , 25.

1. oprette lager bestande af Drosophila i forskningslaboratorium

  1. Oprette en miljømæssigt kontrolleret inkubator (eller lille værelse) til huset bestand bestande af Drosophila ved at indstille væksthuse for en konstant temperatur, lys: mørke cyklus og fugtighed, afhængig af præferencer af test arter.
    Bemærk: Foretrukne miljøforhold vil variere afhængigt af den indfødte økologi arter udvalgt til undersøgelsen. For eksempel, D. melanogaster er hjemmehørende i Sub-Sahara Afrika27 og holdes typisk på 25 ° C, 12:12 lys: mørke cyklus og ca 60% fugtighed16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. på den anden side D. montana rækkevidden strækker sig gennem det meste af Canada og Midtvesten USA, en meget koldere region; D. montana fastholdes derfor typisk på 19 – 20 ° C og nogle gange en 24 h lys regime til at simulere betingelserne under parring sæson31. For en mere detaljeret beskrivelse af de geografiske områder af forskellige arter af Drosophila, se Drosophila artsdannelse mønstre hjemmeside32.
  2. Opnå en foretrukne Drosophila arter og/eller indavlede linje fra enten en stock center (se tabel af materialer), en anden forskningslaboratorium efter anmodning eller indsamle vilde, genetisk variable befolkninger fra feltet.
    Bemærk: De følgende fremgangsmåde forklares metoder til at indsamle vilde, genetisk variabel populationer af Drosophila at opretholde i forskningslaboratorium. Disse metoder er blevet ændret fra Markow og O'Grady33 og Werner og Jaenike34 for at samle de bredeste mangfoldighed af arter på én gang, i stedet for bestemt målarter med en agn kilde.
    1. Fryse en halv snes modne bananer i fryseren natten over og afrimning før indstilling agn fælder.
    2. Forbered flere 1 – 2 L flasker ved at skære en u-formet slids foran flaske at tillade fluer til at blive fanget i den agn flaske og ikke flygte. Cap plastflasker med deres flaske hætter, så fluerne ikke undslippe via låg.
    3. Tilføje optøede banan til bunds i flaskerne, så bunden af flaskerne indeholder cirka en tomme af banan. Læg en skive af moden tomat i flasken. Føje en gær gylle (sidesten gær fra øl beslutningsproces) til banan i bunden af flasken, så bananen får lov til at suge i gær gylle.
    4. Tilføje træ pinde (i lodret opad) til flasken, så fluerne ikke et rent underlag at gå på gær gylle og banan.
      Figur 1 illustrerer det endelige produkt af disse metoder.
    5. Hænge agn flasker i træer natten over og tjekke hver 24 h. munden aspirat flyver ud af flasker og individuelt sted hunner i hætteglas med medium til at oprette iso-kvindelige linjer.
      Bemærk: Flere kvindelige linjer kan oprettes, dog kun hvis hunner af hver art klart kan identificeres. Derudover flyver inden for slægten Drosophila indtager forskellige økologiske nicher og vil have forskellige kostbehov afhængigt af disse nicher (Werner og Jaenike34); Se Werner og Jaenike34 for kost anbefalinger og madopskrifter.
    6. Undersøge den voksne F1 afkom under dissektion mikroskop for at identificere, hvilken art af den indsamlede Drosophila (Se Markow og O'Grady33 og Werner og Jaenike34 for at få hjælp til at identificere forskellige arter ).

Figure 1
Figur 1 : Billedlig repræsentation af fælder og agn bruges til at indsamle vilde populationer af Drosophila i feltet. (A) flyve fælder sæt på et lokalt felt websted i Colorado. (B) et tættere billede af fluen fælder sæt på dette felt websted. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Opretholde iso-kvindelige eller flere kvindelige linjerne i en miljømæssigt kontrolleret inkubator eller værelse med konstant temperatur, lys: mørke cyklus og fugtighed. For at gøre dette, hus fluer i hætteglas eller flasker i foretrukne medium og tillade de fælderne hunner til at lægge æg i medium. Overvåge hætteglas for forekomst af larver og pupper.
    Bemærk: Fluer inden for slægten Drosophila indtager forskellige økologiske nicher og vil have forskellige kostbehov og miljømæssige abiotiske indstillinger afhængigt af disse nicher33,34. Miljømæssige præferencer og kostanbefalinger (og yderligere instruktion på flyve dyrehold) kan findes i Elgin og Miller28, Shaffer mfl. 29, stocker og Gallant30, Markow og O'Grady33og Werner og Jaenike34. Hvis bruger indfanget arter, kan lokale miljøforhold simuleres i væksthuse, indtil arterne kan identificeres.
  2. Overføre lagre ofte til fersk medium, kassere gamle hætteglas, til at opretholde sunde linier og undgå infektion fra mider.
    Bemærk: Hyppigheden af overførsel vil afhænge af arternes livscyklus. For eksempel, overføre Drosophila melanogaster hver 2 uge til frisk medium. For yderligere informationer om vedligeholdelse af linjer i laboratoriet, Se Rand mfl. 16, Elgin og Miller28, Shaffer mfl. 29, stocker og Gallant30, Greenspan35og Science Education Database36.

2. bag Drosophila i den forurenede Medium

Bemærk: Hvis test Drosophila i laboratoriet for første gang eller med en ny contaminant(s), identificere den dødelige dosis (Se Castaneda et al. 37 og Massie et al. 38 for metoder) og LD50 (Se Castaneda mfl. 37 og Akins mfl. 39 for metoder) første. Kør derefter en dosis-respons kurve for at identificere biologisk relevante koncentrationer for den ønskede fænotypiske output; Se Hirsch mfl. 19 og Zhou mfl. 40 for metoder.

  1. Forberede stamopløsninger af den forurenede medium på ønskede koncentrationen, afhængigt af kemien af det forurenende stof.
    Bemærk: For eksempel, at forberede stamopløsninger af PbAc: forberede stamopløsninger af blyacetat (PbAc) medium ved at tilføje forurenende destilleret vand (DH-20) indtil medium lavet med forurenende stoffer vand når ønskede koncentration. For eksempel, en stamopløsning af 1.000 µM PbAc, kan være forberedt ved at føje PbAc til dH20 indtil 1.000 µM PbAc. Yderligere, fortyndes stamopløsning (f.eks. 1.000 µM PbAc løsning) til den ønskede koncentration (f.eks 500 µM PbAc) og vedligeholde disse løsninger som lager også.
  2. Forberede medium, følgende producentens retningslinjer skal tjene som kontrol medium. Forberede yderligere medium, følgende producentens retningslinjer; men supplement rede forurenende løsning for dH20.
    Bemærk: For eksempel, hvis du bruger et øjeblik Drosophila medium, tilføje omkring en teskefuld instant medium til et plastik hætteglas. Tilføje ca 5-5,5 mL dH20 til medium. Drys et par korn af levende bagegær at forberede kontrol medium. For at forberede eksperimentelle medium, supplere stamopløsningen (f.eks 500 µM PbAc) for dH20.
  3. Overføre reproduktivt levedygtige voksne hanner og hunner fra stock befolkninger til kontrollen og den eksperimentelle medium.
    NOTE: Tid post eclosion til reproduktive modenhed er forskellige mellem Drosophila arter41.
    1. Forsigtigt trykke hætteglas af stock fluer ned med den dominerende hånd. Sikre, at fluerne automatisk flyttes til bunden af hætteglasset. Med anden hånden, fjerne hætten af hætteglasset mens trykke hætteglasset og placere en frisk hætteglas af kontrol eller forurenet medium på toppen af hætteglasset med fluer. Holde hætteglassene sammen og vende dem over, forsigtigt at trykke, så at fluerne automatisk overføres til den friske hætteglas af kontrol eller forurenet medium. Mens stadig trykke hætteglas med fluer, cap hætteglasset.
    2. Gentag med flere hætteglas, og sørg for at standardisere antallet fluer i hvert hætteglas.
      Bemærk: Det samlede antal voksne overføres via enkelt overførsel eller anæstesi vil afhænge af størrelsen af hætteglassene anvendes for at undgå overbefolkning.
    3. Inkuber voksne i en standard miljømæssig stand (dvs. en inkubator) og giver mulighed for voksne til at parre sig og lægge æg i medium i 24-96 timer.
    4. Efter 24-96 h, kassere voksne i et lighus (en kolbe fyldt med mineralsk olie og loft med en tætsiddende tragt) efterlod befrugtede æg (der vil senere blive de eksperimenterende fag) til at modne til test. Placer hætteglassene i inkubator tillade æg til at udvikle.
    5. Overvåge hætteglas til vandrer instar larver af udkig larver, der er ved at opstå fra mediet.

3. indsamle eksperimenterende fag på forskellige udviklingsstadier

Bemærk: Eksperimenterende fag kan blive indsamlet på nogen udviklingsstadiet, placeret i de blinde kodede 15 mL konisk rør, og testet for akkumulering. Verifikationsmetoderne for ophobning af forurenende stoffer vil afhænge af det forurenende stof ved at blive undersøgt. For eksempel, kan ophobning af PbAc testes ved hjælp af Inductively-Coupled Plasma massespektrometri (ICP-MS)42. Derudover kan eksperimenterende fag, indsamles på enhver udviklingsstadiet skal testes for en række fænotypisk virkninger af forurenende stoffer. Figur 2 illustrerer Drosophila livscyklus43. Figur 3 illustrerer forsøgsplan for eksponering og forskellige udviklingsstadier i indsamling.

Figure 2
Figur 2 : Oversigt over D. melanogaster (den mest almindeligt anvendte Drosophila modelsystem) livscyklus. Stadier af Drosophila livscyklus er: 1) æg, 2) first-instar larve, 3) sekund-instar larve, 4) tredje-instar larve, 5) vandrer tredje-instar larve, 6) white-eye puppe, 7) røde øjne puppe, 8) nyligt-eclosed voksne og 9) moden voksen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Oversigt over metoderne for mundtligt at udsætte Drosophila til forurenet medium i både forældrenes (F0) og efterfølgende generationer (F1 og fremefter). (A) metoder til oral eksponering under udvikling i de udsatte generation. (B) metoder til at teste overførsel af forurenende stoffer til afkom (F1 til den ønskede generation). Dette tal er blevet ændret fra Peterson et al. 24 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Indsamle vandrer tredje instar larver
    1. Begynde at overvåge hætteglas, når lysene tænder i rugemaskine som larver vil opstå fra medium og bevæge sig opad på siden af hætteglasset inden for en h efter lys tænder i rugemaskinen. Inden for denne h, fjerne vandrer tredje instar larver fra siderne af hætteglasset omhyggeligt ved hjælp af en træpind eller pincet.
      Bemærk: Antallet af larver til samling vil afhænge af antallet af æg lagt i "2.3.4".
    2. For at fjerne overskydende medium fra larverne, placere larverne i et lille bæger med dH2O. Pour dH2O ud af bægerglasset og placere larverne på en delikat opgave vinduesvisker. Ved hjælp af en delikat opgave visker forsigtigt fjerne den overskydende dH2O fra larverne.
    3. Vedligeholde eksperimentelle populationer i en miljømæssigt kontrolleret inkubator.
  2. Indsamle nyligt eclosed voksne
    1. Overvåge hætteglas til eclosion ved at observere farvning af pupper langs siderne af hætteglassene.
      Bemærk: Pupper bliver mørkere under udvikling. Udviklingsmæssige tid, især før eclosion, afhænger af de arter, der er testet.
    2. Når de første voksne begynder at velsmagende, dump og kassér disse voksne i et lighus, der indeholder mineralsk olie.
    3. Når lysene tænder i rugemaskinen den følgende morgen, dump og kassér eventuelle voksne af ukendt alder (eller jomfruelighed), der kan have eclosed natten over eller under morningbefore lys på.
    4. Ca 4 timer senere, bedøver alle voksne, der fremstod som nyligt eclosed voksne med en CO2 pistol i hætteglassene. Sted voksne på et CO2 plade under et mikroskop for dissektion. Sex voksne ved at kigge efter sex kamme på forbens mænd og ovipositors hos kvinder.
      Bemærk: D. melanogaster skal afhentes inden for 6 h af eclosion at undgå parring, men andre arter kan have længere udviklingsmæssige gange (og derfor ikke behøver at blive indsamlet inden for denne tidsramme).
    5. Separat voksne på CO2 plade ved hjælp af en træpind. Forsigtigt overføre voksne i sex-specifikke grupper ved hjælp af en træpind til medium matchende præ-eksisterende historie.
  3. Indsamle modne voksne efter eclosion
    1. Tillad voksne til at forblive på den medium matchende præ eclosion eksponering fra æg fase til den ønskede alder efter eclosion i en miljømæssigt kontrolleret inkubator.
    2. Enkeltvis overføre voksne til kontrol medium i 24 timer inden prøvningen for at give mulighed for voksne til at soignere overskydende forurenet medium off deres organer.

4. bag eksperimentelle emner at teste effekten af mindretalsspørgsmålet eller transgenerationel eksponering.

  1. For at bag den forældrene generation (aka P0 eller F0 generationer), overføre voksne fra stock befolkninger til kontrol og eksperimentelle mellemlang og følge trinene i "2.1" til "2,3" og "3,1" til "3.3".
  2. Når voksne er reproduktivt modne (Se Pitnick mfl. 41), enkeltvis overførsel (som anført i 2.3.1) ét hætteglas hanner til en frisk hætteglas af kontrol eller eksperimenterende medium. Enkeltvis overføre et hætteglas af hunner til frisk hætteglasset, der nu indeholder hanner. Tillader voksne til mate og lægge æg i medium for 24-96 h. Dump og kassér voksne i et lighus, der indeholder mineralsk olie og re Inkuber hætteglas for at tillade afkom til at udvikle.
  3. Gentag trin 4.1 gennem 4.2 afhængigt af det ønskede antal generationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved at udsætte mundtligt Drosophila til en contaminant(s) i hele udvikling, kan forskellige toksikologiske spørgsmål testes ved at udsætte Drosophila på forskellige niveauer i biologiske organisation. Dette afsnit præsenterer repræsentative resultater, der opnås ved hjælp af denne protokol i tidligere offentliggjorte papirer23,24. Især blev denne protokol tidligere brugt til at evaluere ophobning, fjernelse og binding af bly (Pb) i den samme generation af eksponering og på tværs af den første generation af afkom23; og at studere konsekvenserne af ophobning på mate valg24.

Tabel 1 og figur 4 viser repræsentative resultater, der opnås ved hjælp af denne protokol til at bestemme den ophobning og eliminering af Pb i både F0 og F1 generationer.

Tabel 1 viser repræsentative resultater vejledende af ophobning af Pb, når de udsættes i generation (ved forskellige doser: 0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 og 500 µM PbAc) i stikprøver, der undersøges på flere udviklingsstadier (vandrer tredje-instar larver, puppe tilfælde, nyligt eclosed voksne og modne hunner og hanner) i Peterson mfl. 23 blev prøverne indsamlet på forskellige udviklingsstadier, frosne ved-20 ° C, behandles med salpetersyre og hydrogenperoxid og testet for Pb ved hjælp af ICP-MS23,42.

Dosis (µM PbAc) Larve Puppe tilfælde Nyligt Eclosed voksne Modne voksne hunner Modne voksne hanner
0 0,009 ± 0,001 0.099 ± 0,02 0,04 ± 0,005 0.069 ± 0.031 0.0015 ± 0,003
10 0,42 ± 0,025 0.46 ± 0,03 0,12 ± 0,009 0,12 ± 0,012 0.056 ± 0,008
40 7.5 ± 0,67
50 5.2 ± 0,71 2.77 ± 0,30 1.11 ± 0,14
75 14 ± 1,06
100 12 ± 0,95 4.7 ± 0,38 3.36 ± 0,58 1,20 ± 0,63 1.24 ± 0,46
250 89 ± 8,49 25.06 ± 4.72 5,46 ± 0,75
500 271 ± 41.01 334.30 ± 39.43 8.44 ± 0,84 46.50 ± 14.72 14.43 ± 1,83

Tabel 1: betyde Pb belastninger (ng/individ) testet i D. melanogaster under udvikling efter oral eksponering for Pb fra æg fase at teste fase. Midler (ng/flyve) ± standardfejl af middelværdien vist (n = 8 larve, n = 3 kontrol-opdrættet voksne, n = 3 Pb-opdrættet voksne). Vildtype D. melanogaster blev opdrættet på kontrol eller blyholdig medium (0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 eller 500 µM PbAc) fra æg fase til forskellige udviklingstrin. Prøverne blev indsamlet og testet for Pb akkumulering ved hjælp af ICP-MS.42 denne tabel er ændret fra Peterson mfl. 23

I figur 4, at forældrenes generation (F0) var udsat for Pb fra æg stadier til voksenalderen, parret i kontrol medium, og den første generation af afkom (F1) var opdrættet i kontrol medium indtil voksenalderen24. Metoder til at opdage Pb ophobning og eliminering lignede Peterson mfl. 23. resultater fra dette eksperiment viser, at forældrenes eksponering ikke overføres til den første generation af voksen afkom24. Derfor er bruger denne protokol, det muligt at teste adaptive responser på forskellige evolutionære skalaer samt transgenerationel effekter af F0 eksponering. Lignende resultater blev fundet i Peterson mfl. 23

Figure 4
Figur 4: PB ophobning i D. melanogaster (A) forældre (F0) og (B) ikke eksponerede afkom (F1). Barer i (A) og (B) Vis middelværdi (ng/voksen) ±SEM. stikprøvestørrelser vist ovenfor barer i (A) og (B). = p < 0,001. (A) F0 voksne blev oralt eksponeret til 250 µM PbAc bruger denne protokol fra æg fase til alder 5 d efter eclosion og indsamlede alder 6 dage efter eclosion (efter 24 h hastige) skal testes for Pb akkumulering ved hjælp af ICP-MS.42(B) F0 voksne var parret inden for behandling i kontrol medium. Eksponerede F1 afkom var opdrættet i kontrol medium fra æg fase til voksenalderen (ved hjælp af denne protokol) og testet for Pb akkumulering ved hjælp af ICP-MS. I (B): "CF + CM"= F1 voksne med forældre opdrættet i kontrol medium, "CF + PbM" = F1 voksne med fædre, der opdrættes i blyholdig medium, "PbF + CM" = F1 voksne med mødre, der opdrættes i blyholdig medium, "PbF + PbM" = F1 voksne med forældre opdrættet i blyholdig medium. Dette tal er blevet ændret fra Peterson et al. 24 Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Resultaterne præsenteres i tabel 1 og figur 4 viser, at Drosophila let ophobes Pb på forskellige doser, udviklingsstadier og evolutionære skalaer bruger denne protokol. Derfor angiver protokollens effektivitet i udsætter D. melanogaster til en mundtlig forurenende.

I figur 5, blev protokollen beskrevet her brugt af Peterson et al. 24 at afprøve virkningerne af udviklingsmæssige Pb eksponering på mate præference. Eksperimentelle emner blev opdrættet fra æg fase til voksenliv på kontrol eller blyholdig medium fra æg fase til voksenalderen og testet for mate præference efter 24 h af hastige. Peterson mfl. 24 fandt, at Pb-eksponerede kvinder fortrinsvis parret med Pb-eksponerede hanner da givet mulighed for enten en kontrol eller Pb-eksponerede mand. Disse resultater er et repræsentativt eksempel på gennemførelse af protokollen for at undersøge de fænotypiske output.

Figure 5
Figur 5: Mate præference i hanner og hunner udsat for 250 µM PbAc fra æg stage til voksenalderen. Barer i (A), (B), og (C) Vis gennemsnitlig procent (%) parring succes (i 60 mins) ± SEM. *** = p < 0,001. * = p < 0,05. Eksperimentelle emner i (A), (B) og (C) blev udsat for kontrol eller blyholdig medium (250 µM PbAc) fra æg faser at modne voksenalderen og testet for forskelle i mate valg. (A) kvindelige præference for enten kontrol - eller Pb-opdrættet hanner (dvs. to-valg test). Stikprøvestørrelser var: N = 126 kontrol-opdrættet kvinder og 137 Pb-opdrættet hunner. (B) mandlige præference for kontrol - og Pb-opdrættet hunner (dvs. to-valg test). Prøver størrelser var: N = 59 kontrol-opdrættet hanner og N = 64 Pb-opdrættet hanner. (C) Mate præference i både hanner og hunner når enkeltvis parret med en partner af enten eksponering (dvs. nej-valg test). I (C): "CF + CM" = en kontrol-opdrættet kvinde parret med en kontrol-opdrættet mand (N = 85 par), "CF + PbM" = en kontrol-opdrættet kvinde parret med en Pb-opdrættet mand (N = 79 par), "PbF + CM" = en Pb-opdrættet kvinde parret med en kontrol-opdrættet mand (N = 91 par), "PbF + PbM"= en Pb-opdrættet kvindelige + en Pb-opdrættet mand (N = 98 par). Dette tal er blevet ændret fra Peterson et al. 24. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drosophila melanogaster er blevet oprettet som en kraftfuld model for en række biologiske processer på grund af den omfattende bevaring af gener og veje mellem D. melanogaster og mennesker13,14. Af samme grund at det er en kraftfuld model for lægevidenskaben, fremstod Drosophila som en egnet modelsystem til at undersøge virkningerne af menneskeskabte forurening på en række toksikologiske endpoints. Flere laboratorier bruger med held D. melanogaster som et modelsystem til at undersøge en række forbindelser, herunder tungmetaller11,16,18-25,37 ,38,39,40,44,45, ethanol46, nanopartikler26,47, pesticider48 , og opløsningsmidler49. Trods de seneste bestræbelser på at udnytte Drosophila som toksikologi model, dens anvendelse som en modelsystem at besvare de utallige toksikologiske er stadig i sin vorden. Imidlertid er givet sin omfattende brug som en model for medicinsk-relaterede slutpunkter, og dets anvendelse i økologisk50 og evolutionære undersøgelser17, sit potentiale som en toksikologiske modelsystem enorme.

Vi præsenterer her, metoder til opdræt af forskellige arter i Drosophila slægt på forurenede medium til at teste for forskellige toksikologiske endpoints. Selv om andre former for eksponering er muligt fokuserer ved hjælp af Drosophila som en model (fx indånding og dermal eksponering), denne protokol på den oral indtagelse af forurenende stoffer, som er nødvendige for forurenende stoffer, der naturligt ville blive indtaget ( som gennem fødekæden). Disse metoder kan rumme flere Drosophila arter og forurenende stoffer. Vilde, genetisk variabel populationer af Drosophila kan også indsamlet i feltet og vedligeholdes i forskningslaboratorium. Der er mange muligheder for fælder og agn, der kan bruges, afhængigt af arter mad præferencer; for felthåndbøger på feltsamlingen, se Markow og O'Grady33 og Werner og Jaenike34. Derudover metoderne, der kan ændres for at fastslå virkningen af udviklingsmæssige eksponering på forskellige kritiske udviklingsmæssige perioder og giver mulighed for langsigtet mindretalsspørgsmålet afprøvning af forurenende eksponering.

Kritiske trin i disse metoder omfatter: (1) opretholde flyve bestande i miljømæssigt kontrollerede betingelser, (2) at undgå overbefolkning af flyve populationer, (3) fortynding test forurenende stof ud fra sine kemiske egenskaber og (4) at vælge biologisk relevante koncentrationer af test-forurenende. Opretholde bestande i miljømæssigt reguleret væksthuse (eller en lille værelse) sikrer, at yderligere ændringer i de miljømæssige forhold ikke forvirre resultater. Desuden sæsonmæssige udsving i adfærd er tidligere fundet51 og flere Drosophila arter Angiv diapause over vinteren52. Andet, larve overbelægning kan have langvarige konsekvenser for udviklingen30, voksen krop størrelse30og levetiden53. Fortynding af det forurenende stof er derudover et vigtigt skridt til at sikre, at det forurenende stof er biologisk tilgængelig for Drosophila ophobes det forurenende stof. For eksempel, opløses PbAc i dH2O23,24,25, mens andre kemikalier kan være nødvendigt at være opløst i saltvand eller ethanol. At vælge biologisk relevante koncentrationer af det forurenende stof kan påvirke retningen af resultaterne; for eksempel, øge lave doser af PbAc de gennemsnitlige antal hunner parring med hanner (inden for 20 minutter), mens højere doser vise betydelige fald i det gennemsnitlige antal hunner parring19. For at identificere biologisk relevante koncentrationer af forurenende stof test, bør læsere overveje kører foreløbige undersøgelser for at bestemme den dødelige dosis og LD50 til at bestemme de passende doser til at udføre en dosis-respons kurve. Ved at udføre en dosis-respons kurve for at teste en række koncentrationer på et bestemt slutpunkt, kunne læsere lokalisere doser, der er enten "gavnlige" eller "farligt" at individer eller befolkningsgrupper for yderligere test.

Denne protokol giver en avenue til at bestemme: 1) samspillet mellem flere biologiske niveauer af organisation på fitness og toksikologiske endpoints; 2) rollen udviklingsmæssige og emergent faktorer; 3) økologisk-vigtige slutpunkter; 4) medicinsk vigtige slutpunkter; 5) hvordan flere stressfaktorer interagerer for at producere resultater; og 6) virkningerne af langtidseksponering, der går på tværs af generationer. For at illustrere effektiviteten af denne protokol, blev der fremlagt beviser, der viser, at personer udsættes hele udvikling akkumulerer Pb (tabel 1)23,24. Derudover repræsentative resultater viser, at denne protokol kan bruges til at teste virkninger af eksponering på økologisk vigtige slutpunkter (fx., virkningen af udviklingsmæssige Pb eksponering på mate valg24). Desuden, andre har testet virkningerne af forureninger på flere biologiske niveauer af organisation (herunder fysiologiske18,21, genetiske20,22 og fænotypiske-niveauer19 , 23 , 24 , 25), medicinsk vigtige slutpunkter18,20,21,22,23, og langsigtede mindretalsspørgsmålet effekter23,24 ,25,54. Desuden viser foreløbige data, at udviklingsmæssige Pb eksponering inducerer transgenerationel epigenetiske effekter på fertilitet i D. melanogaster54. En vigtig begrænsning af denne protokol er at anvendelse af denne protokol med Drosophila er i sin vorden. Derfor er der begrænset publikationer18,19,20,21,22,23,24,25 til adresse potentiale af protokollen til at besvare yderligere toksikologiske spørgsmål, såsom udvikling og emergent faktorer, yderligere økologisk vigtige slutpunkter, flere stressfaktorer og evolutionære virkninger af eksponering.

Med denne protokol, kan læsere teste forurenende stoffer, der naturligt indtages ved hjælp af biologisk relevante metoder. Kontinuerlig flydende fodring, udviklet af Soares mfl. 55 er en alternativ tilgang til oral indtagelse, navnlig for pesticider eksponering. Men kontinuerlig flydende fodring er passende for voksen indtagelse af flydende forurenende stoffer og ikke finder anvendelse på forurenende stoffer hvor enkeltpersoner kan være udsatte før eclosion. Dette er især vigtigt i betragtning potentiale for kritiske perioder i udviklingen for eksponering. Tidligere undersøgelser har vist en kritisk periode for Pb eksponering23. Derfor skal Drosophila udsættes hele udvikling for at undgå potentielle aktive eliminering af forurenende stoffer ved Drosophila inden prøvningen indtil kritiske perioder kan bestemmes.

I sammendrag, har vi givet en protokol for at udsætte mundtligt Drosophila for forurenende stoffer. Ved hjælp af denne protokol og model systemet, kan toksikologer skifte til etiske og ikke-invasive metoder til dyreforsøg mens samtidig indarbejde en mere holistisk tilgang til at forstå virkningen af forurenende stoffer8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne publikation blev støttet af en bevilling fra Department of Education (PR Award #P031C160025-17, Projekttitel: 84.031 C) på Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) samfund til at bygge aktive STILK Engagement (C-BASE). Vi takker nuværende zoologi og Elsevier giver brugsret til de repræsentative resultater offentliggjort i tidligere papirer, som redaktørerne af JoVE for at give os mulighed for at udgive denne protokol. Vi vil også gerne takke C-BASE Program, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE og Department of Biology, CSU-Pueblo), CSU-Pueblo biologi afdeling, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (Biologisk Institut, Skidmore College), og Dr. Claire Varian Ramos (Biologisk Institut, Colorado State University-Pueblo) for deres støtte og bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24 Carolina Biological 173204
Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit Genessee Scientific 32-116SB Used to store flies
Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials Genessee Scientific 49-102 Used to store flies
Cardboard trays, trays only, narrow Genessee Scientific 32-124 Used to organize populations of flies
Cardboard trays, dividers only, narrow Genessee Scientific 32-126 Used to organize populations of flies
Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure Fischer Scientific 03-312D Useful for storage of contaminants
Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles Fischer Scientific 03-409-17C Useful for storage of contaminants
Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser Fischer Scientific 14-287-150 Used to prepare medium
Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips Fischer Scientific 13-683-708 Used to prepare medium
Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm) Genessee Scientific 59-114 Used to anesthetize flies
Flystuff foot valve Genessee Scientific 59-121 Used to anesthetize flies
Tubing, green (1 continguous foot/unit) Genessee Scientific 59-124G Used to anesthetize flies
Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle VWR 97064-130 Used to make a morgue
Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2 Walmart Not applicable Used to make a morgue
BGSET5 Glass Beaker Set Of 5 Walmart
Inbred or wildtype line of Drosophila Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University https://bdsc.indiana.edu
Wild popultions of Drosophila UC San Diego Drosophila Stock Center https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Postel, S. Defusing the Toxics Threat: Controlling Pesticides and Industrial Waste. , Worldwatch Institute. Washington, DC. (1987).
  2. Vitousek, P. M., Mooney, H. A., Lubchenco, J., Melillo, J. M. Human domination of earth's ecosystems. Science. 277, 494-499 (1997).
  3. United Nations Environment Program (UNEP). Saving Our Planet: Challenges and Hopes. , UNEP. Nairobi. (1992).
  4. Hansen, L. J., Johnson, M. L. Conservation and toxicology: Integrating the disciplines. Conservation Biology. 13, 1225-1227 (1999).
  5. Johnston, E. L., Mayer-Pinto, M., Crowe, T. P. REVIEW: Chemical contaminant effects on marine ecosystem functioning. Journal of Applied Ecology. 52, 140-149 (2015).
  6. Dell'Omo, G. Behavioral ecotoxicology. , John Wiley & Sons, LTD. West. Sussex, UK. (2002).
  7. Clotfelter, E. D., Bell, A. M., Levering, K. R. The role of animal behaviour in the study of endocrine-disrupting chemicals. Animal Behaviour. 68, 665-676 (2004).
  8. Peterson, E. K., Buchwalter, D. B., Kerby, J. L., LeFauve, M. K., Varian-Ramos, C. W., Swaddle, J. P. Integrative behavioral ecotoxicology: bringing together fields to establish new insight to behavioral ecology, toxicology, and conservation. Current Zoology. 63, 185-194 (2017).
  9. Scott, G. R., Sloman, K. A. The effects of environmental pollutants on complex fish behaviour: Integrating behavioural and physiological indicators of toxicity. Aquatic Toxicology. 68, 369-392 (2004).
  10. Zala, S. M., Penn, D. J. Abnormal behaviors induced by chemical pollution: A review of the evidence and new challenges. Animal Behaviour. 68, 649-664 (2004).
  11. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic & Applied Medicine. 1, 33-38 (2013).
  12. Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology and medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  13. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacology Reviews. 63, 411-436 (2011).
  14. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287, 2204-2215 (2000).
  15. Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32, 74 (2010).
  16. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1.12.1-1.12.20 (2015).
  17. Burke, M. K., Rose, M. R. Experimental evolution with Drosophila. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296, R1847-R1854 (2009).
  18. He, T., Hirsch, H. V. B., Ruden, D. M., Lnenicka, G. A. Chronic lead exposure alters presynaptic calcium regulation and synaptic facilitation in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 30, 777-784 (2009).
  19. Hirsch, H. V., et al. Behavioral effects of chronic exposure to low levels of lead in Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 24, 435-442 (2003).
  20. Hirsch, H. V. B., et al. Variations at a quantitative trait locus (QTL) affect development of behavior in lead-exposed Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 30, 305-311 (2009).
  21. Morley, E. J., Hirsch, H. V. B., Hollocher, K., Lnenicka, G. A. Effects of chronic lead exposure on the neuromuscular junction in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 24, 35-41 (2003).
  22. Ruden, D. M., et al. Genetical toxicologenomics in Drosophila identifies master- modulatory loci that are regulated by developmental exposure to lead. NeuroToxicology. 30, 898-914 (2009).
  23. Peterson, E. K., et al. Accumulation, elimination, sequestration, and genetic variation of lead (Pb2+) loads within and between generations of Drosophila melanogaster. Chemosphere. 181, 368-375 (2017).
  24. Peterson, E. K., et al. Asymmetrical positive assortative mating induced by developmental lead (Pb2+) exposure in a model system, Drosophila melanogaster. Current Zoology. 63, 195-203 (2017).
  25. Peterson, E. K. Consequences of developmental lead (Pb2+) exposure on reproductive strategies in Drosophila. , University at Albany-State University of New York. Dissertation (2016).
  26. Chifiriuc, M. C., Ratiu, A. C., Popa, M., Ecovolu, A. A. Drosophotoxicology: An emerging research area for assessing nanoparticles interaction with living organisms. International Journal of Molecular Sciences. 17, 36 (2016).
  27. Lachaise, D., Cariou, M. L., David, J. R., Lemeunier, F., Tsacas, L., Ashburner, M. Historical biogeography of the Drosophila melanogaster species subgroup. Evolutionary Biology. 22, 159-225 (1988).
  28. Elgin, C. R., Miller, D. W. Mass rearing of flies and mass production and harvesting of embryos. The Genetics and Biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, 112-121 (1978).
  29. Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, C. R. Chapter 5: Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods in Cell Biology. 44, 99-108 (1994).
  30. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  31. Jennings, J. H., Etges, W. J., Schmitt, T., Hoikkala, A. Cuticular hydrocarbons of Drosophila montana: geographic variation, sexual dimorphism and potential roles as pheromones. Journal of Insect Physiology. 61, 16-24 (2014).
  32. Drosophila Speciation Patterns. , http://www.drosophila-speciation-patterns.com/rangemaps.html. (2018).
  33. Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. London. (2005).
  34. Werner, T., Jaenike, J. Drosopholids of the midwest and northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester NY. (2017).
  35. Greenspan, R. J. The basics of doing a cross. Fly Pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 3-24 (1997).
  36. JoVE Science Education Database. . Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  37. Castañeda, P. L., Muñoz, G. L. E., Durán, D. A., Heres, P. M. E., Dueñas, G. I. E. LD50 in Drosophila melanogaster. fed on lead nitrate and lead acetate. Drosophila Information Service. 84, 44-48 (2001).
  38. Massie, H. R., Aiello, V. R., Whitney, S. J. P. Lead accumulation during aging of Drosophila and effect of dietary lead on life span. Age. 15, 47-49 (1992).
  39. Akins, J. M., Schroeder, J. A., Brower, D. L., Aposhian, H. V. Evaluation of Drosophila melanogaster as an alternative animal for studying the neurotoxicity of heavy metals. BioMetals. 5, 111-120 (1992).
  40. Zhou, S., et al. The genetic basis for variation in sensitivity to lead toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Health Perspectives. 124, 1062-1070 (2016).
  41. Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Delayed male maturity is a cost of producing large sperm in Drosophila. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 92, 10614-10618 (1995).
  42. Beauchemin, D. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82, 4786-4810 (2010).
  43. Tyler, M. S. Development of the fruit fly Drosophila melanogaster. Developmental Biology, a Guide for Experimental Study. Tyler, M. S. , 2nd, Sinauer Associates Inc. Sunderland, MA, USA. 8-27 (2000).
  44. Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107, 416-426 (2009).
  45. Bonilla, E., Contreras, R., Medina-Leendertz, S., Mora, M., Villalobos, V., Bravo, Y. Minocycline increases the life span and motor activity and decreases lipid peroxidation in manganese treated Drosophila melanogaster. Toxicology. 294, 50-53 (2012).
  46. Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 199-228 (2003).
  47. Posgai, R., Cipolla-McCulloch, C. B., Murphy, K. R., Hussain, S. M., Rowe, J. J., Nielsen, M. G. Differential toxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles on Drosophila melanogaster development, reproductive effort, and viability: size, coatings and antioxidants matter. Chemosphere. 85, 34-42 (2011).
  48. Gupta, S. C., et al. Adverse effect of organophosphate compounds, dichlorvos and chlorpyrifos in the reproductive tissues of transgenic Drosophila melanogaster: 70kDa heat shock protein as a marker of cellular damage. Toxicology. 238, 1-14 (2007).
  49. Wasserkort, R., Koller, T. Screening toxic effects of volatile organic compounds using Drosophila melanogaster. Journal of Applied Toxicology. 17, 119-125 (1997).
  50. Markow, T. A., O'Grady, P. O. Reproductive ecology of Drosophila. Functional Ecology. 22, 747-759 (2008).
  51. Dev, K., Chahal, J., Parkash, R. Seasonal variations in the mating-related traits of Drosophila melanogaster. Journal of Ethology. 31, 165-174 (2013).
  52. Salminen, T. S., Vesala, L., Laiho, A., Merisalo, M., Hoikkala, A., Kankare, M. Seasonal gene expression kinetics between diapause phases in Drosophila virilus group species and overwintering differences between diapausing and non-diapausing females. Nature Scientific Reports. 5, 11197 (2015).
  53. Miller, R. S., Thomas, J. L. The effects of larval crowding and body size on the longevity of adult Drosophila melanogaster. Ecology. 39, 118-125 (1958).
  54. Peterson, E. K., Ghiradella, H., Possidente, B., Hirsch, H. Transgenerational epigenetic effects of lead exposure on behavior in Drosophila melanogaster. Abstracts of the IBANGS Genes, Brain and Behavior Meeting, May 16-19, 2012, Boulder, CO, 11, Genes, Brain & Behavior 492-493 (2012).
  55. Soares, J. J., et al. Continuous liquid feeding: New method to study pesticides toxicity in Drosophila melanogaster. Analytical Biochemistry. 537, 60-62 (2017).

Tags

Biologi sag 137 toksikologi økotoksikologi Integrativ adfærdsmæssige økotoksikologi emergente egenskaber emergente egenskaber vandrer-tredje instar larver pupper eclosion mellem generationerne transgenerationel
Forsøgsplan for at bruge <em>Drosophila</em> som hvirvelløse modelsystem for afprøvning af toksicitet i laboratoriet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peterson, E. K., Long, H. E.… More

Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory. J. Vis. Exp. (137), e57450, doi:10.3791/57450 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter