Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Eksperimentell protokoll for bruke Drosophila som en virvelløse modellsystem for toksisitet Testing i laboratoriet

Published: July 10, 2018 doi: 10.3791/57450
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Communities for Building Active STEM Engagement, Colorado State University-Pueblo, 2Department of Biology, Colorado State University-Pueblo

Summary

I dette papiret gir vi en detaljert protokoll for å utsette arter i slekten Drosophila til forurensning med mål å studere virkningen av eksponering på en rekke fenotypiske utganger på ulike utviklingsstadier og mer enn én generasjon.

Abstract

Emergent egenskaper og eksterne faktorer (populasjon-nivå og økosystem-nivå interaksjoner, spesielt) spille viktige roller i formidling økologisk viktige endepunkter, men de anses sjelden i toksikologiske studier. D. melanogaster fremstår som en toksikologi modell for opptreden, nevrologiske og genetisk virkningene av giftstoffer, for å nevne noen. Enda viktigere, kan arter i slekten Drosophila benyttes som et modellsystem for rammeverk tilnærming å innlemme emergent egenskaper og svare økologisk relevante spørsmål i toksikologi forskning. Målet med denne utredningen er å gi en protokoll for å utsette arter i slekten Drosophila til miljøgifter som skal brukes som et modellsystem for en rekke fenotypiske utganger og økologisk relevante spørsmål. Mer spesifikt, kan denne protokollen brukes til 1) koble flere biologiske nivåer av organisasjonen og forstå virkningen av giftstoffer på både enkelt - og befolkningen-nivå fitness; 2) test virkningen av giftstoffer på ulike stadier av utviklingsmessige eksponering; 3) test multigenerational og evolusjonære implikasjoner av; og 4) teste flere forurensninger og stressors samtidig.

Introduction

Hvert år er ca 1000 nye kjemikalier innført av kjemisk industri1,2; Imidlertid er miljøvirkningene av bare en liten prosentandel av disse kjemikaliene testet før distribusjon2,3. Selv om store katastrofer er uvanlig, sublethal og kronisk eksponering til et stort utvalg av stoffer er utbredt i både mennesker og dyr4,5. Historiske fokus økotoksikologi og miljømessige toksikologi var å teste dødelighet, enkelt kjemisk eksponering, akutt eksponering og fysiologiske effekter av eksponering, som en måte å måle virkningen av miljøgifter på overlevelse6, 7 , 8 , 9 , 10. selv om det er en dreining mot etiske og ikke-invasive metoder å dyreforsøk, dagens tilnærminger er begrensende rolle som utvikling, emergent egenskaper og eksterne faktorer (for eksempel populasjon-nivå og økosystem-nivå interaksjoner) spille i formidling økologisk viktige endepunktene8. Derfor er det behov for metoder som inneholder en mer holistisk tilnærming uten å ofre dyr og/eller virveldyr i laboratoriet.

Virvelløse modellsystemer, for eksempel Drosophila melanogaster, er et attraktivt alternativ til møte behovet for en mer helhetlig tilnærming til toksisitet testing. D. melanogaster, ble opprinnelig utviklet som en virvelløse modellsystem for menneske-relaterte genetisk forskning om århundre siden11. D. melanogaster fremtredende brukes nå som virveldyr modell alternativ for flere grunner: 1) bevaring av gener og veier mellom D. melanogaster og mennesker; 2) kort generasjonstid i forhold til vertebrate modeller; 3) rimelig pris for vedlikehold; 4) lette generere store utvalgene; og 5) mengde fenotypiske og økologisk-relevante endepunktene tilgjengelig for testing11,12,13,14,15,16,17 .

Flere laboratorier11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 nå bruker D. melanogaster som virveldyr modell alternativ for toksisitet tester for å forstå konsekvensene av forurensning på mennesker. Lokale arter av Drosophila kan benyttes, også, som toksisitet modeller for dyr og mennesker svare økologisk-, behaviorally-, og evolusjonært relevante spørsmål på flere biologiske nivåer av organisasjonen. Med arter i slekten Drosophila som modell, er flere målbare endepunktene mulig11,15,16,18,19,20 ,,21,,22,,23,,24,,25. In addition, bruker Drosophila modellen, toxicologists kan: 1) etisk koble effekter på flere biologiske nivåer av organisasjonen; 2) innlemme rollen emergent faktorer og utvikling; 3) studere økologisk viktige sluttpunkt (i tillegg til medisinsk viktige endepunktene); 4) teste flere stressfaktorer samtidig; 5) og test langsiktige multigenerational (f.eks evolusjonære og transgenerational) virkningene av stressfaktorer. Derfor gjør bruker Drosophila som et modellsystem en rekke tilnærminger, ikke begrenset å studere mekanistisk tilnærminger med innavlet stammer av D. melanogaster i laboratoriet.

I dette papiret presentere vi metoder for oppdrett og samle Drosophila å svare ulike toksikologiske spørsmål. Mer spesifikt, beskriver vi metodikken for 1) oppdrett Drosophila medium laced med én eller flere stoffer; 2) samle Drosophila gjennom utvikling (f.eks vandrende tredje-skikkelsen larver, pupal tilfeller, nylig-eclosed voksne og eldre voksne); og 3) oppdrett Drosophila i forurensede medium å test intergenerational samt transgenerational overføring og evolusjonære konsekvensene av langvarig toxicant eksponering. Med denne protokollen, tidligere forfattere18,19,20,21,22,23,24har,25 rapportert forskjellige fysiologiske, genetisk og behavioral virkninger av utviklingsmessige bly (Pb2 +) eksponering. Denne protokollen kan toxicologists bruke en mer helhetlig toksikologiske tilnærming som er nødvendig for å forstå hvordan stoffer er risikofaktorer for både mennesker og dyr i et stadig mer forurenset miljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende-protokollen er en eksperimentell brukt til bakre arter i Drosophila slekten på forurenset medium når oralt inntak av en gift er aktuelle; andre former for eksponering er mulig å bruke Drosophila modellen11,15,16,26. Metodene som er beskrevet i denne protokollen har tidligere blitt beskrevet av Hirsch et al. 19 og Peterson et al. 23 , 24 , 25.

1. Sett opp lager bestander av Drosophila i forskningslaboratoriet

  1. Sette opp en miljømessig-kontrollerte inkubator (eller lite rom) på huset lager bestander av Drosophila ved å angi inkubatorer for en konstant temperatur, lys: mørke syklus og fuktighet, avhengig av preferansene til test arter.
    Merk: Foretrukket miljøforhold varierer avhengig av innfødte økologi av arten valgt for studien. For eksempel D. melanogaster er innfødt til sub-Sahara Afrika27 og vedlikeholdes vanligvis ved 25 ° C, 12:12 lys: mørke syklus og ca 60% fuktighet16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. derimot, D. montana rekkevidde utvides gjennom det meste av Canada og Midtvesten USA, et mye kaldere regionen. Derfor er D. montana vanligvis opprettholdt på 19-20 ° C og noen ganger en 24-timers lyset regimet å simulere forhold under mating årstid31. En mer detaljert beskrivelse av geografiske områdene av forskjellige arter av Drosophila, kan du se Drosophila artsdannelse mønstre nettsted32.
  2. Hente en foretrukket Drosophila arter og/eller innavlet linjen enten lager center (se tabellen for materiale), en annen forskningslaboratorium på forespørsel, eller samle vill, genetisk variabelen befolkninger fra feltet.
    Merk: De følgende trinnene forklarer metodene for å samle vill, genetisk variabelen befolkninger i Drosophila å opprettholde i forskningslaboratoriet. Disse metodene er endret fra Markow og O'Grady33 og Werner og Jaenike34 for å samle bredeste mangfoldet av arter, målet bestemt arter med en agn kilde.
    1. Fryse halvt dusin moden bananer i fryseren over natten og tine før agn feller.
    2. Forbered flere 1-2-L plastflasker ved å kutte en u-formet splitten foran flasken for å tillate flyr til fanges i agn flaske og ikke rømme. Cap plastflasker med sin flaske caps så fluene ikke flykte via lokkene.
    3. Legg defrosted banan til bunnen av flaskene slik at bunnen av flaskene inneholder omtrent en tomme av banan. Plass et stykke moden tomat i flasken. Legge til en gjær slurry (leftover gjær fra øl gjør prosessen) banan på bunnen av flasken slik at banan blir å suge i gjær gjødsel.
    4. Legge til tre pinner (i loddrett stående) til flasken slik fluene har en ren substrat å gå på gjær slurry og banan.
      Figur 1 illustrerer det endelige produktet av disse metodene.
    5. Henge agn flasker i trær over natten og når hver 24 h. munnen leveringstanken flyr ut av flasker og individuelt sted kvinner i hetteglass med medium til å opprette iso-kvinne.
      Merk: Flere kvinnelige linjer kan opprettes, men bare hvis kvinner av hver art kan være tydelig identifisert. I tillegg fluer i slekten Drosophila okkupere forskjellige økologiske nisjer og vil ha forskjellige diettbehov avhengig av de nisjene (Werner og Jaenike34); se Werner og Jaenike34 for kosthold anbefalinger og matoppskrifter.
    6. Undersøke voksen F1 avkom under disseksjon mikroskop for å identifisere arten av den innsamlede Drosophila (se Markow og O'Grady33 og Werner og Jaenike34 for hjelp i å identifisere ulike arter ).

Figure 1
Figur 1 : Billedlig fremstilling av feller og agn brukes til å samle ville bestander av Drosophila innen. (A) Fly feller sett hos en lokal feltet i Colorado. (B) et nærmere blikk på fly feller sett på dette feltet området. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Opprettholde den iso-kvinnelige eller flere kvinnelige linjene i en miljømessig-kontrollerte inkubator eller med konstant temperatur, lys: mørke syklus og fuktighet. Dette huset fluer i hetteglass eller flasker i foretrukne medium og tillate gravid kvinner å legge egg i medium. Overvåke hetteglass for larver og pupae.
    Merk: Fluer i slekten Drosophila okkupere forskjellige økologiske nisjer og vil ha forskjellige diettbehov og miljømessig abiotiske innstillinger avhengig av de nisjene33,34. Miljømessige valg og kostanbefalinger (og mer informasjon på fly dyrehold) finnes i Elgin og Miller28, Shaffer et al. 29, stocker og Gallant30, Markow og O'Grady33og Werner og Jaenike34. Hvis bruker villfanget arter, kan miljøforholdene simuleres i inkubatorer før de kan identifiseres.
  2. Overføre aksjer ofte til frisk medium, forkaster gamle ampuller, å opprettholde sunn linjer og unngå smitte fra midd.
    Merk: Frekvensen av overføring vil avhenge livet syklus av arten. For eksempel overføre Drosophila melanogaster annenhver uke til frisk medium. For ytterligere informasjon om vedlikehold av linjer i laboratoriet, kan du se Rand et al. 16, Elgin og Miller28, Shaffer et al. 29, stocker og Gallant30, Greenspan35og naturfag Database36.

2. bak Drosophila i forurensede Medium

Merk: Hvis du tester Drosophila i laboratoriet for første gang eller med en ny contaminant(s), identifisere dødelig dose (se Castaneda et al. 37 og Massie et al. 38 for metoder) og LD50 (se Castaneda et al. 37 og Akins et al. 39 for metoder) første. Deretter Kjør en dose-respons kurve for å identifisere biologisk relevante konsentrasjoner for ønsket fenotypiske utdataene. se Hirsch et al. 19 og Zhou et al. 40 for metoder.

  1. Klargjør lager løsninger av forurenset middels på den ønskede concentration(s), avhengig av kjemi av miljøgifter.
    Merk: For eksempel å forberede lager løsninger av PbAc: forberede lager løsninger av bly acetate (PbAc) medium ved å legge til miljøgifter destillert vann (dH20) til middels laget med miljøgifter vann når ønsket konsentrasjon. For eksempel en lagerløsning på 1000 µM PbAc, kan tilberedes ved å legge PbAc til dH20 til den når 1000 µM PbAc. Videre fortynne lagerløsning (f.eks 1000 µM PbAc løsning) til ønsket konsentrasjonen (for eksempel 500 µM PbAc) og opprettholde disse løsningene som lager også.
  2. Forberede medium, følgende produsentens retningslinjer som kontroll medium. Forbered flere medium, følgende produsentens retningslinjer; imidlertid supplement forberedt miljøgifter løsning for dH20.
    Merk: For eksempel, hvis bruker et øyeblikk Drosophila medium, legge til ca en teskje øyeblikkelig medium plast ampuller. Legge til ca 5-5.5 mL dH20 til medium. Strø et par korn av levende gjær å forberede kontroll medium. For å forberede eksperimentelle medium, supplere lager løsningen (for eksempel 500 µM PbAc) for dH20.
  3. Overføre reproductively levedyktig eldre menn og kvinner fra lager populasjoner i kontrollen og eksperimentelle medium.
    Merk: Tid etter eclosion til reproduktive modenhet er forskjellig mellom de Drosophila arter41.
    1. Forsiktig Tapp ampullen lager fluer ned med dominerende hånd. Kontroller at fluene automatisk flytte til bunnen av ampullen. Med den andre hånden, fjerne hetten av ampullen mens peke ampullen og plasser frisk ampuller med kontroll eller forurenset medium på ampullen med fluene. Hold hetteglass sammen og snu dem over, trykke forsiktig slik at fluene automatisk overføres til frisk ampullen for kontroll eller forurenset medium. Mens fortsatt peke ampullen med fluene, cap ampullen.
    2. Gjenta med mer ampuller, og pass på å standardisere antall fluer i hvert hetteglass.
      Merk: Antall voksne overført via enkelt overføring eller anestesi vil avhenge av størrelsen på hetteglass brukes til å unngå overbefolkning.
    3. Inkuber voksne i en standard miljømessige tilstand (dvs. en inkubator) og la voksne kompis og legger egg i medium for 24-96 h.
    4. Etter 24-96 timer, forkaste voksne i en likhuset (en kolbe fylt med mineralolje og avsluttes med en tettsittende trakt) etterlot befruktede egg (som vil senere bli eksperimentelle fagene) å modne for testing. Plass ampullene i inkubator å tillate egg å utvikle.
    5. Overvåke hetteglass for vandrende skikkelsen Larvene etter larver som dukker opp fra mediet.

3. samle eksperimentelle emner på ulike utviklingsstadier

Merk: Eksperimentell fag kan samles på noen utviklingsstadiet, plassert i blinde kodet 15-mL konisk rør, og testet for akkumulering. Metoder for testing akkumulering av forurensninger avhenger av miljøgifter blir studert. For eksempel kan opphopning av PbAc testes ved hjelp Inductively-Coupled Plasma massespektrometri (ICP-MS)42. I tillegg kan eksperimentelle fag samles på noen utviklingsstadiet skal testes for en rekke fenotypiske effekter av miljøgifter. Figur 2 viser Drosophila livssyklus43. Figur 3 viser eksperimentelle protokollen for eksponering og de ulike utviklingsstadier for samlingen.

Figure 2
Figur 2 : Begrepsoversikt over livet syklus av D. melanogaster (mest brukte Drosophila modell systemet). Stadier av Drosophila livssyklusen er: 1) egg, 2) første-skikkelsen Larven, 3) andre-skikkelsen Larven, 4) tredje-skikkelsen larve, 5) vandrende tredje-skikkelsen larve, 6) Kereru puppe, 7) røde puppe, 8) nylig-eclosed voksen og 9) voksenfilmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Begrepsoversikt over metoder for muntlig utsette Drosophila for forurenset medium i både foreldre (F0) og etterfølgende generasjoner (F-1 og fremover). (A) metoder for muntlig eksponering under utvikling i utsatte generasjon. (B) metoder for å teste overføring av forurensninger til avkom (F1 til ønsket generasjon). Dette tallet har blitt endret fra Peterson et al. 24 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Samle vandrende tredjedel skikkelsen larver
    1. Starte overvåking ampuller når lysene slår på i inkubator, som larver vil dukke opp fra mediet og flytte oppover på siden av ampullen i en h når lysene slått på i inkubator. Innenfor denne h, fjerne vandrende tredjedel skikkelsen Larvene fra sidene av ampullen forsiktig med en tre-pinne eller pinsett.
      Merk: Antall Larvene tilgjengelig for samling vil avhenge av hvor mange egg lagt i "2.3.4".
    2. For å fjerne overflødig medium fra larvene, plassere Larvene i et lite beger med dH2O. hell dH2O av begeret og plasser Larvene på en delikate oppgaven vindusvisker. Bruker en delikate oppgaven vindusvisker, forsiktig fjerne de overskytende dH2O fra larvene.
    3. Opprettholde eksperimentelle befolkninger i en miljømessig-kontrollerte inkubator.
  2. Samle nylig-eclosed voksne
    1. Overvåke hetteglass for eclosion ved å observere fargen pupae langs sidene av hetteglass.
      Merk: Pupae vil mørkere under utvikling. Utviklingsmessige tid, spesielt før eclosion, avhengig av arten testet.
    2. Når de første voksne begynner å dra, fylling og forkaste disse voksne i en likhuset som inneholder mineralolje.
    3. Når lysene slår på i inkubator morgenen, fylling og kast noen voksne ukjent alder (eller jomfrudom) kan ha eclosed over natten eller under morningbefore lysene på.
    4. Ca 4 timer senere, bedøve noen voksne som nylig-eclosed voksne med en CO2 pistol i hetteglass. Plasser voksne på en CO2 plate under disseksjon mikroskop. Sex voksne etter sex kammer på forelimbs menn og ovipositors i kvinner.
      Merk: D. melanogaster må samles innen 6 timer av eclosion å unngå mating, men andre arter kan ha lenger utviklingsmessige ganger (og derfor trenger ikke hentes innenfor denne tidsrammen).
    5. Egen voksne på CO2 plate med en tre-pinne. Forsiktig overføre voksne i sex-spesifikke grupper bruker en trestav middels samsvarende eksisterende historie.
  3. Samle eldre voksne etter eclosion
    1. La voksne på middels samsvarende pre eclosion eksponering fra egget overvintrer ønsket alder etter eclosion i en miljømessig-kontrollerte inkubator.
    2. Enkeltvis overføre voksne til kontroll medium for 24 timer før testing for å tillate voksne å groom overflødig forurenset medium fram kroppen sin.

4. bakre eksperimentelle fag for å teste effekten av Multigenerational eller Transgenerational eksponering.

  1. Til bak foreldre generasjon (aka P0 eller F0 generasjoner), overføre voksne fra lager populasjoner kontroll og eksperimentelle mediet fremgangsmåten i "2.1" til "2,3" og "3.1" til "3.3".
  2. Når voksne er reproductively modne (se Pitnick et al. 41), enkeltvis overføring (som angitt i 2.3.1) en flaske av menn å en ny medisinglass av kontroll eller eksperimentelle medium. Enkeltvis overføre en flaske av kvinner til frisk ampullen som inneholder nå menn. Tillate voksne kompis og lå egg i medium for 24-96 h. Dump og forkaste voksne i en likhuset som inneholder mineralolje og re ruge hetteglass for å tillate avkom å utvikle.
  3. Gjenta 4.1 gjennom 4.2 avhengig av ønsket antall generasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Av muntlig utsette Drosophila for en contaminant(s) gjennom utvikling, kan diverse toksikologiske spørsmål testes ved å utsette Drosophila på ulike nivåer av biologisk organisasjon. Denne delen presenterer representant resultatene bruker denne protokollen i tidligere publiserte artikler23,24. Spesielt ble denne protokollen tidligere brukt til å vurdere akkumulering, eliminering og lagring av bly (Pb) til samme generasjon eksponering og over den første generasjonen av avkom23; og for å studere Implikasjonen av akkumulering på kompis valg24.

Tabell 1 og Figur 4 viser representant resultatene bruker denne protokollen for å finne akkumulering og eliminering av Pb i både F0 og F1 generasjoner.

Tabell 1 viser representant resultater indikativ av opphopning av Pb utsettes generasjon (ved ulike doser: 0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 og 500 µM PbAc) i prøvene testet på flere utviklingsstadier (vandrende tredje-skikkelsen larvene, pupal tilfeller, nylig-eclosed voksne, og voksne hunner og hanner) i Peterson et al. 23 innhentet prøver på ulike utviklingsmessige stadier, fryses på 20 ° C, behandlet med salpetersyre og hydrogen peroxide og testet for Pb med ICP-MS23,42.

Dose (µM PbAc) Larven Pupal tilfeller Nylig-Eclosed voksne Eldre voksne kvinner Eldre voksne hanner
0 0.009 ± 0,001 0.099 ± 0,02 0.04 ± 0.005 0.069 ± 0.031 0.0015 ± 0.003
10 0.42 ± 0.025 0,46 ± 0,03 0,12 ± 0,009 0,12 ± 0.012 0.056 ± 0.008
40 7.5 ± 0,67
50 5.2 ± 0.71 2,77 ± 0,30 1.11 ± 0.14
75 14 ± 1.06
100 12 ± 0,95 4.7 ± 0,38 3.36 ± 0.58 1.20 ± 0,63 1,24 ± 0.46
250 89 ± 8.49 25.06 ± 4,72 5.46 ± 0,75
500 271 ± 41.01 334.30 ± 39.43 8.44 ± 0.84 46.50 ± 14.72 14.43 ± 1.83

Tabell 1: mener Pb laster (ng/individuelle) testet i D. melanogaster under utvikling etter muntlig eksponering for Pb egg scenen å teste scenen. Betyr (ng/fly) ± standardfeil betyr vises (n = 8 larve, n = 3 kontroll-bakside voksne, n = 3 Pb-bakside voksne). Wild type D. melanogaster var oppdratt kontrollen eller blyholdig medium (0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 eller 500 µM PbAc) egg scenen til ulike stadier av utviklingen. Prøvene ble samlet inn og testet for Pb akkumulering bruker ICP-MS.42 denne tabellen er endret fra Peterson et al. 23

I Figur 4foreldre generasjon (F0) ble utsatt for Pb fra egg stadier voksen alder, paret i kontroll medium, og den første generasjonen av avkom (F-1) var oppdratt i kontroll medium til voksen24. Metoder for å oppdage Pb akkumulering og eliminering var lik Peterson et al. 23. resultatene fra dette eksperimentet tyder på at foreldre eksponering ikke overføres til den første generasjonen av voksne avkom24. Derfor, bruker denne protokollen, er det mulig å teste adaptive svar på ulike evolusjonære skalaer, samt transgenerational effekter av F0 eksponering. Lignende resultater ble funnet i Peterson et al. 23

Figure 4
Figur 4: PB akkumulering i D. melanogaster (A) foreldre (F0) og (B) ueksponerte avkom (F1). (A) og (B) viser gjennomsnittet (ng/voksen) ±SEM. utvalgene ovenfor barer i (A) og (B). = p < 0,001. (A) F0 voksne var muntlig utsatt for 250 µM PbAc bruke denne protokollen egg scenen for alderen 5 d etter eclosion og samlet alder 6 dager etter eclosion (etter 24 h rensingen) skal testes for Pb akkumulering bruker ICP-MS.42(B) F0 voksne var paret i behandling i kontroll medium. Ueksponerte F1 avkom ble oppdratt i kontroll medium egg scenen til voksen (med denne protokollen) og testet for Pb akkumulering bruker ICP-MS. I (B): "CF + CM"= F1 voksne med foreldre oppdratt i kontroll medium, "CF + PbM" = F1 voksne med fedre oppdratt i bly medium, "PbF + CM" = F1 voksne med mødre oppdratt i bly medium, "PbF + PbM" = F1 voksne med foreldre oppdratt i bly medium. Dette tallet har blitt endret fra Peterson et al. 24 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Resultatene presenteres i tabell 1 og Figur 4 indikerer at Drosophila lett akkumuleres Pb i ulike doser og utviklingsstadier evolusjonære skalaer bruker denne protokollen. Derfor angir protokollen effektivitet i utsette D. melanogaster for en muntlig miljøgifter.

I figur 5ble protokollen beskrevet her brukt av Peterson et al. 24 å teste effekten av utviklingsmessige Pb eksponering på kompis preferanse. Eksperimentell fag var oppdratt egg scenen til voksen på kontrollen eller blyholdig medium egg scenen til voksen og testet for kompis preferanse etter 24 h av rensingen. Peterson et al. 24 fant at Pb-eksponerte kvinner fortrinnsvis parret med Pb-eksponerte menn når gitt muligheten til en kontroll eller Pb-eksponerte mann. Disse resultatene er et representativt eksempel på gjennomføringen av protokollen for å undersøke fenotypiske utdataene.

Figure 5
Figur 5: Kompis preferanse i menn og kvinner utsatt for 250 µM PbAc fra egg scenen til voksenlivet. Barer i (A), (B), og (C) viser mener prosent (%) parring suksess (i 60 minutter) ± SEM. *** = p < 0,001. * = p < 0,05. Eksperimentell fag i (A), (B) og (C) ble utsatt for kontroll eller blyholdig medium (250 µM PbAc) fra egg stadier modne voksen og testet for forskjeller i kompis valg. (A) kvinnelige preferanse for enten kontroll - eller Pb-bakside menn (dvs. to-valget test). Utvalgene var: N = 126 kontroll-bakside kvinner og 137 Pb-bakside kvinner. (B) mannlige preferanse for kontroll - og Pb-bakside kvinner (dvs. to-valget test). Prøver størrelser var: N = 59 kontroll-bakside menn og N = 64 Pb-bakside menn. (C) kompis preferanse i både hanner og hunner da enkeltvis sammen med en partner i enten eksponering (dvs. ingen valg tester). I (C): "CF + CM" = en kontroll-bakside kvinner sammen med en kontroll-bakside mann (N = 85 par), "CF + PbM" = en kontroll-bakside kvinner sammen med en Pb-bakside mann (N = 79 par), "PbF + CM" = en Pb-bakside kvinner sammen med en kontroll-bakside mann (N = 91 par), "PbF + PbM"= en Pb-bakside kvinnelig + en Pb-bakside mann (N = 98 par). Dette tallet har blitt endret fra Peterson et al. 24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drosophila melanogaster har blitt etablert som en kraftig modell for en rekke biologiske prosesser på grunn av omfattende bevaring av gener og veier mellom D. melanogaster og mennesker13,14. Av samme grunn at det er en kraftig modell for medisinsk vitenskap har Drosophila framstått som en passende modell-system for å studere virkningen av menneskeskapt forurensning på en rekke toksikologiske endepunktene. Flere laboratorier bruker vellykket D. melanogaster som modellsystem for å studere en rekke stoffer, inkludert tungmetaller11,16,18-25,37 ,,38,,39,,40,,44,,45, etanol46, nanopartikler26,47, plantevernmidler48 , og løsemidler49. Til tross for siste innsats for å utnytte Drosophila som toksikologi modell, bruk som en modell å svare på utallige toksikologiske spørsmål er fortsatt i sin barndom. Men er gitt sin omfattende bruk som en modell for medisinsk-relaterte endepunktene og dens bruk i økologisk50 og evolusjonære studier17, dens potensial som et toksikologiske modellsystem enorm.

Her presenterer vi metoder for oppdrett forskjellige arter innen Drosophila slekten på forurenset medium til å teste ulike toksikologiske endepunktene. Andre former for eksponering er mulig fokuserer med Drosophila som modell (f.eks innånding og dermal eksponering), denne protokollen på den muntlige forbruket av stoffer som er nødvendig for forurensninger som ville selvsagt være inntatt ( som gjennom næringskjeden). Disse metodene kan innkvartere bruk av flere Drosophila arter og forurensninger. Vill, genetisk variabelen befolkninger i Drosophila kan også samles i feltet og vedlikeholdes i forskningslaboratoriet. Det er mange valg av feller og agn som kan brukes, avhengig av arten mat preferanser; Hvis feltet guider på feltet samling, kan du se Markow og O'Grady33 og Werner og Jaenike34. I tillegg metodene kan endres for å fastslå effekten av utviklingsmessige eksponering i ulike kritiske utviklingsmessige perioder og gir langsiktig multigenerational testing av miljøgifter eksponering.

De avgjørende skritt av disse metodene inkludere: (1) opprettholde fly aksjer i miljømessig-kontrollerte forhold, (2) unngå overbefolkning fly befolkninger, (3) fortynne test miljøgifter etter dens kjemiske egenskaper og (4) velge biologisk relevante konsentrasjoner av miljøgifter til test. Opprettholde aksjer i miljømessig regulert inkubatorer (eller et lite rom) sikrer at flere variasjoner i miljøforhold ikke forvirre resultater. I tillegg sesongmessige variasjoner i atferd er tidligere funnet51 og flere Drosophila arter angi diapause over vinteren52. Andre, larver overbefolkning kan få varige konsekvenser for utvikling30, voksne kroppen størrelse30og levetid53. I tillegg er fortynning av miljøgifter et viktig skritt for å sikre at miljøgifter er biologisk tilgjengelig for Drosophila å akkumulere miljøgifter. For eksempel oppløses PbAc i dH2O23,24,25, mens andre kjemikalier må være oppløst i saltholdig vann eller etanol. Velge biologisk relevante konsentrasjoner av miljøgifter kan påvirke retningen av resultater; for eksempel øker lave doser av PbAc gjennomsnittlig antall kvinner parring med menn (innen 20 minutter), mens høyere doser Vis signifikant nedgang i gjennomsnittlig antall kvinner parring19. For å identifisere biologisk relevante konsentrasjoner av testen miljøgifter, bør leserne vurdere kjører forstudier for å bestemme dødelig dose og LD50 å fastslå riktig doser utføre en dose-respons kurve. Ved å utføre en dose-respons kurve for å teste en rekke konsentrasjoner på et bestemt sluttpunkt, kan leserne finne doser som enten "nyttighet" eller "farlige" til enkeltpersoner eller bestander for ytterligere testing.

Denne protokollen gir en avenue for å fastslå: 1) samspillet mellom flere biologiske nivåer av fitness og toksikologiske endepunktene; 2) rollen utviklingsmessige og emergent faktorer; 3) økologisk viktige endepunktene; 4) medisinsk viktige endepunktene; 5) hvordan flere stressfaktorer samhandle for å produsere resultater; og 6) virkningen av langvarig eksponering som overgår generasjoner. For å illustrere effekten av denne protokollen, fikk bevis indikerer at personer utsatt gjennom utvikling samle Pb (tabell 1)23,24. I tillegg representant resultatene viser at denne protokollen kan brukes til å teste implikasjonene av eksponering på økologisk viktige sluttpunkt (f.eks., virkningen av utviklingsmessige Pb eksponering på kompis valg24). I tillegg andre har testet effekter av miljøgifter på flere biologiske nivåer i organisasjonen (inkludert fysiologiske18,21, genetisk20,22 og fenotypiske-nivå19 , 23 , 24 , 25), medisinsk-viktig endepunktene18,20,21,22,23, og langsiktig multigenerational effekter23,24 ,25,54. I tillegg indikerer foreløpige data at utviklingsmessige Pb eksponering induserer transgenerational epigenetic effekter på fruktbarhet i D. melanogaster54. En viktig begrensning av denne protokollen er at bruk av denne protokollen med Drosophila er i sin barndom. Det er derfor begrenset publikasjoner18,19,20,21,22,23,24,25 å løse potensialet av protokollen svare toksikologiske spørsmål, som rolle utvikling og emergent faktorer, mer økologisk viktige endepunktene, flere stressfaktorer og evolusjonære implikasjoner av eksponering.

Bruker denne protokollen, kan leserne teste forurensninger som naturlig inntatt ved hjelp av biologisk relevante metoder. Kontinuerlig flytende fôring, utviklet av Soares et al. 55 er en alternativ tilnærming for muntlig svelging, spesielt for plantevernmidler eksponering. Men er kontinuerlig flytende mater egnet for voksne inntak av flytende forurensninger og gjelder ikke for forurensninger der personer kan være synlige før eclosion. Dette er spesielt viktig gitt potensialet for kritiske perioder i utvikling for eksponering. Tidligere studier har vist en kritisk periode for Pb eksponering23. Derfor må Drosophila utsettes gjennom utvikling av potensielle aktive eliminering av forurensning ved Drosophila før testing før kritiske perioder kan bestemmes.

I sammendraget, har vi gitt en protokoll for å avsløre muntlig Drosophila forurensninger. Bruker denne protokollen og modell, kan toxicologists skifte mot etiske og ikke-invasive metoder å dyreforsøk mens samtidig omfatter en mer holistisk tilnærming til å forstå virkningen av forurensninger8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne publikasjonen ble støttet av et stipend fra Institutt for utdanning (PR Award #P031C160025-17, prosjekttittel: 84.031 C) til Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) fellesskap å bygge aktive STEM engasjement (C-BASE). Vi takker gjeldende zoologi og Elsevier for å gi rettigheter til å bruke representant resultatene publisert i tidligere artikler, i tillegg til redaktørene av JoVE for å gi oss muligheten til å publisere denne protokollen. Vi ønsker også å takke C-BASE Program, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE og biologisk Institutt, CSU-Pueblo), CSU-Pueblo biologi avdeling, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (Institutt for biologi, Skidmore College) og Dr. Claire Varian Ramos (Biologisk Institutt, Colorado State University-Pueblo) for deres støtte og hjelp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24 Carolina Biological 173204
Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit Genessee Scientific 32-116SB Used to store flies
Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials Genessee Scientific 49-102 Used to store flies
Cardboard trays, trays only, narrow Genessee Scientific 32-124 Used to organize populations of flies
Cardboard trays, dividers only, narrow Genessee Scientific 32-126 Used to organize populations of flies
Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure Fischer Scientific 03-312D Useful for storage of contaminants
Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles Fischer Scientific 03-409-17C Useful for storage of contaminants
Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser Fischer Scientific 14-287-150 Used to prepare medium
Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips Fischer Scientific 13-683-708 Used to prepare medium
Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm) Genessee Scientific 59-114 Used to anesthetize flies
Flystuff foot valve Genessee Scientific 59-121 Used to anesthetize flies
Tubing, green (1 continguous foot/unit) Genessee Scientific 59-124G Used to anesthetize flies
Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle VWR 97064-130 Used to make a morgue
Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2 Walmart Not applicable Used to make a morgue
BGSET5 Glass Beaker Set Of 5 Walmart
Inbred or wildtype line of Drosophila Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University https://bdsc.indiana.edu
Wild popultions of Drosophila UC San Diego Drosophila Stock Center https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Postel, S. Defusing the Toxics Threat: Controlling Pesticides and Industrial Waste. , Worldwatch Institute. Washington, DC. (1987).
  2. Vitousek, P. M., Mooney, H. A., Lubchenco, J., Melillo, J. M. Human domination of earth's ecosystems. Science. 277, 494-499 (1997).
  3. United Nations Environment Program (UNEP). Saving Our Planet: Challenges and Hopes. , UNEP. Nairobi. (1992).
  4. Hansen, L. J., Johnson, M. L. Conservation and toxicology: Integrating the disciplines. Conservation Biology. 13, 1225-1227 (1999).
  5. Johnston, E. L., Mayer-Pinto, M., Crowe, T. P. REVIEW: Chemical contaminant effects on marine ecosystem functioning. Journal of Applied Ecology. 52, 140-149 (2015).
  6. Dell'Omo, G. Behavioral ecotoxicology. , John Wiley & Sons, LTD. West. Sussex, UK. (2002).
  7. Clotfelter, E. D., Bell, A. M., Levering, K. R. The role of animal behaviour in the study of endocrine-disrupting chemicals. Animal Behaviour. 68, 665-676 (2004).
  8. Peterson, E. K., Buchwalter, D. B., Kerby, J. L., LeFauve, M. K., Varian-Ramos, C. W., Swaddle, J. P. Integrative behavioral ecotoxicology: bringing together fields to establish new insight to behavioral ecology, toxicology, and conservation. Current Zoology. 63, 185-194 (2017).
  9. Scott, G. R., Sloman, K. A. The effects of environmental pollutants on complex fish behaviour: Integrating behavioural and physiological indicators of toxicity. Aquatic Toxicology. 68, 369-392 (2004).
  10. Zala, S. M., Penn, D. J. Abnormal behaviors induced by chemical pollution: A review of the evidence and new challenges. Animal Behaviour. 68, 649-664 (2004).
  11. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic & Applied Medicine. 1, 33-38 (2013).
  12. Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology and medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  13. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacology Reviews. 63, 411-436 (2011).
  14. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287, 2204-2215 (2000).
  15. Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32, 74 (2010).
  16. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1.12.1-1.12.20 (2015).
  17. Burke, M. K., Rose, M. R. Experimental evolution with Drosophila. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296, R1847-R1854 (2009).
  18. He, T., Hirsch, H. V. B., Ruden, D. M., Lnenicka, G. A. Chronic lead exposure alters presynaptic calcium regulation and synaptic facilitation in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 30, 777-784 (2009).
  19. Hirsch, H. V., et al. Behavioral effects of chronic exposure to low levels of lead in Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 24, 435-442 (2003).
  20. Hirsch, H. V. B., et al. Variations at a quantitative trait locus (QTL) affect development of behavior in lead-exposed Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 30, 305-311 (2009).
  21. Morley, E. J., Hirsch, H. V. B., Hollocher, K., Lnenicka, G. A. Effects of chronic lead exposure on the neuromuscular junction in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 24, 35-41 (2003).
  22. Ruden, D. M., et al. Genetical toxicologenomics in Drosophila identifies master- modulatory loci that are regulated by developmental exposure to lead. NeuroToxicology. 30, 898-914 (2009).
  23. Peterson, E. K., et al. Accumulation, elimination, sequestration, and genetic variation of lead (Pb2+) loads within and between generations of Drosophila melanogaster. Chemosphere. 181, 368-375 (2017).
  24. Peterson, E. K., et al. Asymmetrical positive assortative mating induced by developmental lead (Pb2+) exposure in a model system, Drosophila melanogaster. Current Zoology. 63, 195-203 (2017).
  25. Peterson, E. K. Consequences of developmental lead (Pb2+) exposure on reproductive strategies in Drosophila. , University at Albany-State University of New York. Dissertation (2016).
  26. Chifiriuc, M. C., Ratiu, A. C., Popa, M., Ecovolu, A. A. Drosophotoxicology: An emerging research area for assessing nanoparticles interaction with living organisms. International Journal of Molecular Sciences. 17, 36 (2016).
  27. Lachaise, D., Cariou, M. L., David, J. R., Lemeunier, F., Tsacas, L., Ashburner, M. Historical biogeography of the Drosophila melanogaster species subgroup. Evolutionary Biology. 22, 159-225 (1988).
  28. Elgin, C. R., Miller, D. W. Mass rearing of flies and mass production and harvesting of embryos. The Genetics and Biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, 112-121 (1978).
  29. Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, C. R. Chapter 5: Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods in Cell Biology. 44, 99-108 (1994).
  30. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  31. Jennings, J. H., Etges, W. J., Schmitt, T., Hoikkala, A. Cuticular hydrocarbons of Drosophila montana: geographic variation, sexual dimorphism and potential roles as pheromones. Journal of Insect Physiology. 61, 16-24 (2014).
  32. Drosophila Speciation Patterns. , http://www.drosophila-speciation-patterns.com/rangemaps.html. (2018).
  33. Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. London. (2005).
  34. Werner, T., Jaenike, J. Drosopholids of the midwest and northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester NY. (2017).
  35. Greenspan, R. J. The basics of doing a cross. Fly Pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 3-24 (1997).
  36. JoVE Science Education Database. . Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  37. Castañeda, P. L., Muñoz, G. L. E., Durán, D. A., Heres, P. M. E., Dueñas, G. I. E. LD50 in Drosophila melanogaster. fed on lead nitrate and lead acetate. Drosophila Information Service. 84, 44-48 (2001).
  38. Massie, H. R., Aiello, V. R., Whitney, S. J. P. Lead accumulation during aging of Drosophila and effect of dietary lead on life span. Age. 15, 47-49 (1992).
  39. Akins, J. M., Schroeder, J. A., Brower, D. L., Aposhian, H. V. Evaluation of Drosophila melanogaster as an alternative animal for studying the neurotoxicity of heavy metals. BioMetals. 5, 111-120 (1992).
  40. Zhou, S., et al. The genetic basis for variation in sensitivity to lead toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Health Perspectives. 124, 1062-1070 (2016).
  41. Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Delayed male maturity is a cost of producing large sperm in Drosophila. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 92, 10614-10618 (1995).
  42. Beauchemin, D. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82, 4786-4810 (2010).
  43. Tyler, M. S. Development of the fruit fly Drosophila melanogaster. Developmental Biology, a Guide for Experimental Study. Tyler, M. S. , 2nd, Sinauer Associates Inc. Sunderland, MA, USA. 8-27 (2000).
  44. Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107, 416-426 (2009).
  45. Bonilla, E., Contreras, R., Medina-Leendertz, S., Mora, M., Villalobos, V., Bravo, Y. Minocycline increases the life span and motor activity and decreases lipid peroxidation in manganese treated Drosophila melanogaster. Toxicology. 294, 50-53 (2012).
  46. Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 199-228 (2003).
  47. Posgai, R., Cipolla-McCulloch, C. B., Murphy, K. R., Hussain, S. M., Rowe, J. J., Nielsen, M. G. Differential toxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles on Drosophila melanogaster development, reproductive effort, and viability: size, coatings and antioxidants matter. Chemosphere. 85, 34-42 (2011).
  48. Gupta, S. C., et al. Adverse effect of organophosphate compounds, dichlorvos and chlorpyrifos in the reproductive tissues of transgenic Drosophila melanogaster: 70kDa heat shock protein as a marker of cellular damage. Toxicology. 238, 1-14 (2007).
  49. Wasserkort, R., Koller, T. Screening toxic effects of volatile organic compounds using Drosophila melanogaster. Journal of Applied Toxicology. 17, 119-125 (1997).
  50. Markow, T. A., O'Grady, P. O. Reproductive ecology of Drosophila. Functional Ecology. 22, 747-759 (2008).
  51. Dev, K., Chahal, J., Parkash, R. Seasonal variations in the mating-related traits of Drosophila melanogaster. Journal of Ethology. 31, 165-174 (2013).
  52. Salminen, T. S., Vesala, L., Laiho, A., Merisalo, M., Hoikkala, A., Kankare, M. Seasonal gene expression kinetics between diapause phases in Drosophila virilus group species and overwintering differences between diapausing and non-diapausing females. Nature Scientific Reports. 5, 11197 (2015).
  53. Miller, R. S., Thomas, J. L. The effects of larval crowding and body size on the longevity of adult Drosophila melanogaster. Ecology. 39, 118-125 (1958).
  54. Peterson, E. K., Ghiradella, H., Possidente, B., Hirsch, H. Transgenerational epigenetic effects of lead exposure on behavior in Drosophila melanogaster. Abstracts of the IBANGS Genes, Brain and Behavior Meeting, May 16-19, 2012, Boulder, CO, 11, Genes, Brain & Behavior 492-493 (2012).
  55. Soares, J. J., et al. Continuous liquid feeding: New method to study pesticides toxicity in Drosophila melanogaster. Analytical Biochemistry. 537, 60-62 (2017).

Tags

Biologi problemet 137 toksikologi økotoksikologi integrerende atferdsmessige økotoksikologi emergent egenskaper emergent egenskaper vandrende-tredje skikkelsen larver pupae eclosion intergenerational transgenerational
Eksperimentell protokoll for bruke <em>Drosophila</em> som en virvelløse modellsystem for toksisitet Testing i laboratoriet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peterson, E. K., Long, H. E.… More

Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory. J. Vis. Exp. (137), e57450, doi:10.3791/57450 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter