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Bioengineering

वयस्क अस्थि मज्जा में MicroRNA हस्तांतरण के लिए प्रोटोकॉल-व्युत्पंन टेम स्टेम कोशिकाओं सेल इंजीनियरिंग चुंबकीय लक्ष्यीकरण के साथ संयुक्त सक्षम करने के लिए

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57474
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, 1,2, 1,2
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल CD133+ टेम स्टेम कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए एक सुरक्षित और कुशल प्रक्रिया दिखाता है । प्रस्तुत गैर वायरल, चुंबकीय polyplex आधारित दृष्टिकोण चिकित्सीय स्टेम सेल प्रभाव के अनुकूलन के लिए एक आधार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के माध्यम से प्रशासित सेल उत्पाद की निगरानी के लिए प्रदान कर सकते हैं ।

Abstract

जबकि CD133+ टेम स्टेम सेल (SCs) को अपक्षयी दवा के क्षेत्र में उच्च क्षमता प्रदान करने के लिए सिद्ध किया गया है, घायल ऊतकों में इंजेक्शन के बाद उनके कम प्रतिधारण दर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मनाया बड़े पैमाने पर सेल मौत की दर का नेतृत्व बहुत प्रतिबंधित उपचारात्मक प्रभाव । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम अपने प्रशासन से पहले उपयुक्त सेल इंजीनियरिंग के लिए एक गैर वायरल आधारित प्रोटोकॉल स्थापित करने की मांग की । microRNA (मीर) भरी हुई चुंबकीय polyplexes का उपयोग करते हुए मानव CD133+ व्यक्त SCs के संशोधन कुशलता और सुरक्षा के साथ ही कोशिकाओं की लक्ष्यीकरण क्षमता के संबंध में संबोधित किया गया था । हमारे प्रोटोकॉल पर निर्भर है, हम उच्च मीर हासिल कर सकते है 80 की दर-90% जबकि CD133+ स्टेम सेल गुण अप्रभावित रहते हैं । इसके अलावा, इन संशोधित कोशिकाओं चुंबकीय लक्ष्यीकरण का विकल्प प्रदान करते हैं । हम यहां CD133+ SCs के संशोधन के लिए एक सुरक्षित और अत्यधिक कुशल प्रक्रिया का वर्णन । हम इस दृष्टिकोण चिकित्सकीय स्टेम सेल प्रभाव के अनुकूलन के लिए और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के माध्यम से प्रशासित सेल उत्पाद की निगरानी के लिए एक मानक प्रौद्योगिकी प्रदान करने के लिए उम्मीद है ।

Introduction

CD133+ SCs एक विषम स्टेम और जनक सेल जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करने के लिए आशाजनक चिकित्सा की क्षमता के साथ । उनके टेम, endothelial, और myogenic विभेद संभावित1,2,3 CD133+ कोशिकाओं को सक्षम बनाता है, उदाहरणके लिए, भेदभाव के माध्यम से neovascularization प्रक्रियाओं में योगदान करने के लिए नए जहाजों और समर्थक angiogenic के सक्रियकरण में paracrine तंत्र4,5,6,7द्वारा संकेतन के गठन ।

उनके उच्च क्षमता 30 से अधिक अनुमोदित नैदानिक परीक्षणों (ClinicalTrails.gov) में प्रदर्शन के बावजूद, उनके चिकित्सीय परिणाम विवादास्पद चर्चा4के तहत अभी भी है । दरअसल, SCs के एक नैदानिक आवेदन ब्याज और बड़े पैमाने पर प्रारंभिक सेल मौत5,8,9के अंग में कम प्रतिधारण द्वारा बाधा है । CD133 के अतिरिक्त इंजीनियरिंग+ SCs पूर्व प्रत्यारोपण इन चुनौतियों से उबरने में मदद कर सकता है ।

एक कुशल कोशिका चिकित्सा के लिए एक शर्त बड़े पैमाने पर प्रारंभिक कोशिका मृत्यु की कमी के लिए चिकित्सीय संबंधित10कोशिकाओं की engraftment बढ़ाने होगा । वर्तमान अध्ययन के एक विशाल सेल नुकसान का प्रदर्शन किया 90-99% अत्यधिक perfused अंगों में ऐसे मस्तिष्क और पहले 1 के दौरान दिल के रूप में-2 ज, प्रत्यारोपित सेल प्रकार या आवेदन मार्ग11,12,13 से स्वतंत्र ,14,15,16,17,18,19,20,21। SC लेबलिंग चुंबकीय नैनोकणों (MNPs) का उपयोग कर एक अभिनव गैर इनवेसिव रणनीति के लिए ब्याज की साइट के लिए कोशिकाओं को लक्षित करने में सक्षम बनाता है22,23,24,25,26 और साथ ही सेल की निगरानी एमआरआई27 और चुंबकीय कण इमेजिंग (MPI) का उपयोग करने की अनुमति देता है । vivo अध्ययन में सबसे कुशल चुंबकीय सेल लक्ष्यीकरण के बाद सेल मार्गदर्शन करने के लिए वरीयता में स्थानीय प्रशासन के बाद सेल प्रतिधारण इस्तेमाल किया नसों में इंजेक्शन23,24,28 . इसलिए, हमारे समूह superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों29से मिलकर एक वितरण प्रणाली तैयार की । इस तकनीक के साथ, CD133+ SCs और मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) कुशलतापूर्वक लक्षित किया जा सकता है, के रूप में द्वारा प्रदर्शन इन विट्रो 30,31प्रयास करता है ।

अनुसूचित जाति के उपचारों के लिए एक और बाधा प्रत्यारोपण के बाद प्रभावित ऊतक के शत्रुतापूर्ण भड़काऊ वातावरण है, जो प्रारंभिक कोशिका मृत्यु३२के लिए योगदान देता है । कई पूर्व कंडीशनिंग अध्ययन के अलावा, चिकित्सीय प्रासंगिक miRs के आवेदन३३का परीक्षण किया गया; यह सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया है कि विरोधी अपोप्तोटिक miRs इन विट्रो में apoptosis को बाधित और vivo३३में सेल engraftment को बढ़ाने. इन छोटे अणुओं, 20 से बना-25 न्यूक्लियोटाइड, दूत RNAs (mRNAs) के posttranscriptional मॉडुलन के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और इस तरह स्टेम सेल भाग्य और व्यवहार३४को प्रभावित करते हैं । इसके अलावा, miRs की exogenous परिचय मेजबान जीनोम३४में अवांछित स्थिर एकीकरण से बचें ।

प्राथमिक SCs में न्यूक्लिक एसिड (NAs) के कुशल परिचय के लिए वर्तमान प्रयास ज्यादातर रिकॉमबिनेंट वायरस8,३५पर आधारित हैं । उच्च अभिकर्मक दक्षता के बावजूद, रिकॉमबिनेंट वायरस हेरफेर एक बेंच के लिए एक बड़ी बाधा-बेडसाइड अनुवाद प्रस्तुत करता है, जैसे, बेकाबू जीन अभिव्यक्ति, pathogenicity, immunogenicity, और प्रविष्टि mutagenesis३५ ,३६. इसलिए, गैर-वायरल वितरण प्रणालियों जैसे बहुलक आधारित निर्माण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । उन में से, polyethylenimine (पी) miRs के लिए एक वैध वितरण वाहन की पेशकश के लिए लाभ का प्रतिनिधित्व करता है इस तरह के रूप में न करने के लिए क्षरण से बचाने के लिए, सेलुलर ऊपर उठाना, और endosomal एस्केप के माध्यम से intracellular रिलीज३७,३८। इसके अलावा, मीर-पी परिसरों नैदानिक परीक्षणों३९में एक उच्च असंगति का प्रदर्शन किया । इसलिए, हमारे वितरण प्रणाली एक biotinylated branched 25 केडीए पी एक streptavidin लेपित िं-कोर30,31,४०के लिए बाध्य कर रहे हैं ।

इस पांडुलिपि में, हम का वर्णन एक व्यापक प्रोटोकॉल वर्तमान (मैं) CD133 के मैनुअल अलगाव+ अनुसूचित जाति उत्पाद की एक विस्तृत लक्षण वर्णन के साथ मानव अस्थि मज्जा (बीएम) दान से और (द्वितीय) एक कुशल और सौंय अभिकर्मक रणनीति चुंबकीय गैर वायरल बहुलक-CD133 के आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए वितरण प्रणाली आधारित+ SCs miRs का उपयोग कर । CD133+ SCs एक सतह एंटीबॉडी आधारित चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) प्रणाली का उपयोग कर मानव स्टर्नल बीएम aspirates से पृथक और चुंबकीय रूप से समृद्ध कर रहे हैं । बाद में, कोशिका व्यवहार्यता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल शुद्धता प्रवाह cytometry का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । इसके बाद, मीर/पी/देि परिसर तैयार कर रहे है और CD133+ SCs transfected हैं । 18 ज अभिकर्मक के बाद, अधिक कुशलता और अनुसूचित जाति मार्कर अभिव्यक्ति और कोशिका व्यवहार्यता पर अभिकर्मक के प्रभाव का विश्लेषण कर रहे हैं । इसके अलावा, अभिकर्मक परिसर यौगिकों के intracellular वितरण का मूल्यांकन चार रंग लेबलिंग और दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम) संरचित का उपयोग किया जाता है ।

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Protocol

कोशिका अलगाव के लिए स्टर्नल मानव बीएम को सूचित दानदाताओं से प्राप्त किया गया था, जिन्होंने हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार अनुसंधान के लिए अपने नमूनों का उपयोग करने के लिए अपनी लिखित सहमति दे दी. रॉस्टॉक विश्वविद्यालय की नैतिक समिति ने प्रस्तुत अध्ययन (reg. No. A २०१० २३, २०१५ में लंबे समय तक) को मंजूरी दी है ।

1. सेल की तैयारी

नोट: बीएम परीक्षा के लिए जमावट को रोकने के लिए हेपरिन सोडियम (२५० IU/एमएल बीएम) का प्रयोग करें ।

  1. CD133+ अनुसूचित जाति अलगाव
    1. आवश्यक समाधान की तैयारी
      1. EDTA (०.५ मीटर) के 4 मिलीलीटर के साथ 1x पंजाबियों के ९९६ मिलीलीटर मिश्रण से फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब)/ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) स्टॉक समाधान (2 मिमी) तैयार करें । जोरदार समाधान मिश्रण और एक ०.४५ µm फिल्टर का उपयोग छानने का । कमरे के तापमान पर स्टोर (आरटी) ।
      2. EDTA 2 मिमी के ९९५ मिलीलीटर के मिश्रण से एमएसीएस बफर तैयार/5 जी के साथ गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) । जोरदार समाधान मिश्रण और एक ०.४५ µm फिल्टर का उपयोग छानने का । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      3. collagenase बी स्टॉक समाधान (४० मिलीग्राम/एमएल) कमजोर ५०० collagenase बी ( क्लोस्ट्रीडियम histolyticumसे) की मिलीग्राम पंजाब के १२.५ मिलीलीटर में तैयार करें । जोरदार समाधान मिश्रण, ३५० µ एल के aliquots बनाने के लिए, और दुकान पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
      4. deoxyribonuclease तैयार (DNAse) मैं शेयर समाधान (10 मिलीग्राम/एमएल) द्वारा कमजोर १०० DNAse मैं (गोजातीय अग्ंयाशय से) के 10 पंजाब में मिलीलीटर । जोरदार समाधान मिश्रण, ३५० µ एल के aliquots बनाने के लिए, और दुकान पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
    2. मानव बीएम के एंजाइमी पाचन
      1. पूर्व गर्म मानव लिम्फोसाइट माध्यम आरटी और गल एंजाइमों के लिए (1 aliquot के प्रत्येक collagenase बी और DNAse प्रति 20 मिलीलीटर बीएम) ।
      2. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब और धीरे मिश्रण में सीरिंज से बीएम ले लीजिए । किसी भी मौजूदा थक्के छोड़ें ।
        नोट: स्थानांतरण २०० µ एल के unपतला बीएम के बाद प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में । उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      3. एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब में 10 एमएल बीएम स्थानांतरण, पंजाब के 6 मिलीलीटर जोड़ें/EDTA (2 मिमी), मानव लिम्फोसाइट मध्यम के 20 मिलीलीटर, Collagenase बी के १७५ µ एल (४० मिलीग्राम/एमएल), और १७५ µ एल के DNAse मैं (10 मिलीग्राम/एमएल) । धीरे समाधान मिश्रण और आरटी पर 30 मिनट के लिए एक शेखर पर मशीन । शेष बीएम नमूने के लिए दोहराएं ।
    3. घनत्व ढाल केंद्रापसारक
      1. प्रधानमंत्री एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में मानव लिम्फोसाइट के 15 मिलीलीटर अलग करने के लिए आवेदन करके एक ५० मिलीलीटर घनत्व ढाल केंद्रापसारक ट्यूब । 30 एस के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक
      2. ध्यान से परत घनत्व ढाल केंद्रापसारक ट्यूब फिल्टर के शीर्ष पर पतला बीएम के ३५ मिलीलीटर और $४४५ के लिए RT पर ३५ मिनट के लिए एक्स जी पर केंद्रापसारक ।
        नोट: केंद्रापसारक सेटिंग्स कम त्वरण (3) और कोई ब्रेक (1) हैं ।
      3. ध्यान से मिलाते हुए बिना केंद्रापसारक से ट्यूब हटा दें । सीधे फिल्टर के शीर्ष पर बादलों की परत को छूने के बिना ऊपरी स्पष्ट समाधान से ~ 20 मिलीलीटर को छोड़ दें ।
      4. ध्यान से बादल परत स्थानांतरण (जो सीधे फिल्टर के शीर्ष पर है और mononuclear कोशिकाओं (MNCs) में शामिल है) एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब में और EDTA के साथ भरने के लिए एक अंतिम मात्रा ५० मिलीलीटर/
        नोट: एक नई ट्यूब में एक बीएम रोगी नमूना से सभी MNCs गठबंधन ।
      5. ५० एमएल सेल सस्पेंशन के 10 µ l को १.५ एमएल ट्यूब में ट्रांसफर कर MNCs की गणना करे । methylene ब्लू के साथ 3% एसिटिक एसिड की 10 µ एल जोड़ें । धीरे मिश्रण और एक मतगणना कक्ष में 10 µ एल लागू होते हैं । MNCs की संख्या की गणना करें ।
      6. 10 मिनट के लिए ३०० x g पर बहुराष्ट्रीय कंपनी निलंबन केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
        नोट: केंद्रापसारक के दौरान, आरटी से 4 डिग्री सेल्सियस के लिए नीचे शांत ।
    4. CD133 का चुंबकीय चयन+ SCs मानव CD133 एंटीबॉडी-लिंक्ड superparamagnetic आयरन dextran कणों का प्रयोग
      नोट: इस कदम के दौरान, बर्फ पर काम करते हैं । 4 ° c पर उपयोग करने तक समाधान संग्रहीत करें । स्टोर एमएसीएस स्थाई चुंबक, जुदाई कॉलम, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व जुदाई फिल्टर ।
      1. स्तंभ आकार चुनें । < 1.2 x 108 MNCs के लिए, MS स्तंभों का उपयोग करें, और > 1.2 x 108 MNCs के लिए, LS स्तंभों का उपयोग करें ( सामग्री तालिकादेखें) ।
      2. 1 x 108 कुल सेल संख्या के लिए चुंबकीय चयन के तैयार करने के लिए, ध्यान से ३०० µ एल एमएसीएस बफर (4 डिग्री सेल्सियस) में MNCs reसस्पेंड । जोड़ें १०० µ l FcR ब्लॉकिंग रिएजेंट (4 ° c) और १०० µ l CD133 एंटीबॉडी-लिंक्ड superparamagnetic आयरन dextran कण (4 ° c).
      3. धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेल निलंबन और गर्मी मिश्रण । धीरे (2-3x) मशीन के दौरान सेल निलंबन हिला ।
      4. एमएसीएस बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें (4 ° c) प्रति 1 x 108 कुल MNCs. धीरे सेल निलंबन मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
      5. एमएसीएस चुंबक धारक की स्थापना की और एमएसीएस स्थाई चुंबक देते हैं । एमएसीएस कॉलम स्थापित करें और शीर्ष पर पूर्व जुदाई फिल्टर लागू होते हैं ।
      6. Equilibrate पहले एमएसीएस ms/LS स्तंभ और ०.५ मिलीलीटर (MS) या 3 एमएल (ls) के साथ पूर्व-पृथक्करण फ़िल्टर एमएसीएस बफ़र (4 डिग्री सेल्सियस) ।
        नोट: कभी नहीं एमएसीएस कॉलम equilibration के बाद बाहर सुखाने के लिए अनुमति देते हैं ।
      7. supernatant त्यागें और ५०० µ एल में एमएसीएस बफर (4 ° c) प्रति 1 x 108 कुल सेल राशि की प्राप्त गोली reसस्पेंड । पूर्व-पृथक्करण फ़िल्टर में कक्ष निलंबन लागू करें ।
      8. एमएसीएस स्तंभ और पूर्व जुदाई फ़िल्टर तीन बार का उपयोग कर धो, प्रत्येक धोने के लिए, ०.५ मिलीलीटर (एमएस) या एमएसीएस बफर (4 डिग्री सेल्सियस) के 3 मिलीलीटर (एलएस) ।
        नोट: तीसरे धोने के दौरान कदम, एमएसीएस स्थाई चुंबक में एक दूसरे एमएसीएस कॉलम स्थापित करने और equilibrate दूसरी एमएसीएस ms ०.५ एमएल (एमएस) या 3 एमएल (एलएस) एमएसीएस बफर (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ/
      9. पूर्व-जुदाई फ़िल्टर छोड़ें ।
      10. Elute दूसरे एमएसीएस कॉलम पर सीधे सेल अंश: पहले एमएसीएस कॉलम पर 1 मिलीलीटर (एमएस) या 5 मिलीलीटर (एलएस) एमएसीएस बफर (4 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें और एमएसीएस स्थाई चुंबक से एमएसीएस कॉलम हटा दें । तुरंत दूसरा एमएसीएस कॉलम के ऊपर पहले एमएसीएस कॉलम हस्तांतरण और एमएसीएस कॉलम के माध्यम से आपूर्ति गोताख़ोर का उपयोग कर सेल निलंबन धक्का ।
      11. प्रत्येक वॉश ०.५ एमएल (MS) या 3 एमएल (LS) एमएसीएस बफर (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए उपयोग कर, एमएसीएस कॉलम तीन बार धो लें ।
      12. Elute कक्ष अंश को स्तंभ से 1 मिलीलीटर (MS) या 5 मिलीलीटर (LS) mac बफ़र (4 ° c) को दूसरे एमएसीएस स्तंभ पर जोड़कर और एमएसीएस स्थाई चुंबक से एमएसीएस कॉलम को हटाने के द्वारा जोड़ें । तुरंत एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब (MS) या 15 एमएल शंकु ट्यूब (एलएस) के ऊपर दूसरा एमएसीएस कॉलम स्थानांतरण और आपूर्ति गोताख़ोर का उपयोग कर एमएसीएस कॉलम के माध्यम से सेल निलंबन धक्का ।
      13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । ध्यान से supernatant त्याग और एमएसीएस बफर (4 डिग्री सेल्सियस) के १०० µ एल में प्राप्त गोली reसस्पेंड ।
      14. CD133+ कोशिकाओं की गणना: एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन के 6 µ एल स्थानांतरण । Add 6 µ l trypan ब्लू सॉल्यूशन (०.४%). धीरे मिश्रण और एक मतगणना कक्ष में 10 µ एल लागू होते हैं । CD133+ कोशिकाओं की संख्या की गणना ।
      15. CD133+ कोशिकाओं बर्फ पर बोने तक की दुकान ।
  2. हौसले से अलग CD133 के लक्षण वर्णन+ SCs
    नोट: निंनलिखित काम एक चमकदार रोशनी से सुरक्षित कमरे में किया जाना चाहिए (केवल मंद प्रकाश) । ट्यूब रखें, बफ़र्स, और बर्फ पर एंटीबॉडी जब तक अंयथा कहा ।
    1. फ्लो cytometric एनालिसिस के लिए SCs की तैयारी
      1. दो नमूनों का उपयोग करें (प्रत्येक 10 µ एल) बीएम aliquots और हौसले से अलग CD133 का एक नमूना+ SCs (न्यूनतम, 1 एक्स 104 कोशिकाओं) विश्लेषण के लिए. कोशिकाओं को एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण । FcR ब्लॉकिंग रिएजेंट के 10 µ l जोड़ें और एमएसीएस बफर के साथ भरें (4 ° c) ३३ µ एल की एक मात्रा के लिए
      2. संबंधित ट्यूब के भीतरी हिस्से पर निम्नलिखित एंटीबॉडी जोड़ें ( तालिका 1देखें): anti-CD34-fluorescein isothiocyanate (FITC) (क्लोन: AC136), anti-CD133/2-phycoerythrin (PE) (क्लोन: 293C3), isotype नियंत्रण माउस आईजीजी बी 2-पे, anti-CD45-allophycocyanin (APC)-H7 (क्लोन: 2D1), और 7-aminoactinomycin (AAD) । सभी एंटीबॉडी के बाद जोड़ा गया है, नीचे ट्यूब के एंटीबॉडी पक्ष हिला । धीरे समाधान (अंतिम मात्रा ५० µ एल) मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
      3. 1x लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर की 1 मिलीलीटर जोड़ें, धीरे निलंबन मिश्रण, और बर्फ पर गर्मी 10 मिन. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर निलंबन केंद्रापसारक ।
      4. supernatant त्यागें और १०० µ l पंजाबियों (4 डिग्री सेल्सियस) में प्राप्त गोली reसस्पेंड । प्रवाह cytometric विश्लेषण तक बर्फ पर स्टोर ।
    2. CD133+ SCs के प्रवाह cytometric विश्लेषण
      1. कोशिका व्यवहार्यता और CD133 की शुद्धता की जांच+ अनुसूचित जाति, Hematotherapy और भ्रष्टाचार इंजीनियरिंग (ISHAGE) प्रवाह cytometry गेटिंग रणनीति४१ के एक अनुकूलित अंतरराष्ट्रीय समाज का उपयोग करें ( चित्र 1में प्रतिनिधि चित्रण देखें) । निंन क्रम का उपयोग करें:
        चरण 1: सेल जनसंख्या का चयन (आंकड़ा 1a)
        चरण 2: CD45+ कोशिकाओं का चयन (चित्र 1b)
        चरण 3: व्यवहार्य CD45+ कोशिकाओं का चयन (चित्रा 1C)
        चरण 4: व्यवहार्य CD45 का चयन+/CD34+ कोशिकाओं (चित्रा 1 डी)
        चरण 5: व्यवहार्य CD45 का चयन+/CD34+/CD133+ कोशिकाओं (चित्रा 1E)
        निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लो cytometer ( सामग्री की तालिकादेखें) चलाएँ.
      2. निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग करके कोशिका व्यवहार्यता और शुद्धता की गणना करें:

Equation 1   समीकरण 1

Equation 2   समीकरण 2

  1. हौसले से पृथक CD133 की कोशिका संस्कृति+ SCs
    1. Aliquot 100x रिकॉमबिनेंट मानव cytokine पूरक में १०० µ एल aliquots और स्टोर पर-20 ° c. मध्यम तैयारी से पहले गल एक 100x aliquot ।
    2. तैयार CD133+ अनुसूचित जाति संस्कृति माध्यम, सीरम मुक्त टेम सेल विस्तार मध्यम रिकॉमबिनेंट मानव cytokine पूरक के साथ पूरक (अंतिम 1x) और 1% पेनिसिलिन/streptomycin.
    3. बीज 5 x 104 हौसले से पृथक CD133+ SCs अभिकर्मक के लिए एक 24 अच्छी प्लेट में ५०० µ एल संस्कृति माध्यम के साथ । ३७ ° c, 5% CO2 और 20% O2पर कोशिकाओं की मशीन ।
      नोट: बीज 5 x 104 हौसले से पृथक CD133+ प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक नियंत्रण के रूप में SCs ।

2. अभिकर्मक परिसरों की तैयारी

नोट: इस चरण के दौरान, संपूर्ण कार्य स्थान ribonuclease (RNAse) रखें-RNAse दूषण समाधान का उपयोग कर निःशुल्क और केवल RNAse-मुक्त उपभोज्य सामग्री का उपयोग करें ।

  1. मीर की तैयारी
    नोट: निंनलिखित काम एक चमकदार रोशनी से सुरक्षित कमरे में किया जाना चाहिए (केवल मंद प्रकाश) ।
    नोट: के लिए मीर-नमूना: का प्रयोग करें Cyanine 3 डाई लेबल के प्रणेता मीर और अनलेबल्ड प्रणेता मीर.
    1. मीर स्टॉक सॉल्यूशन (५० µ m) तैयार करने के लिए, nuclease के उपयुक्त मात्रा में मीर की वांछित राशि को पतला-मुक्त पानी (उदा., १०० µ l water में मीर के 5 nmol को पतला करना) । धीरे समाधान मिश्रण, aliquot मीर स्टॉक (5 µ एल), और दुकान के नीचे-20 डिग्री सेल्सियस ।
  2. बेई की तैयारी
    1. मानक प्रोटोकॉल निंनलिखित बेई तैयार और पी स्टॉक एकाग्रता31,४२ ध्यान दें ।
  3. देि की तैयारी
    1. मानक प्रोटोकॉल के बाद MNPs तैयार करें और िं स्टॉक एकाग्रता31,४२ध्यान दें ।
  4. मीर/पी परिसरों की तैयारी
    1. कमजोर D-(+) द्वारा 5% ग्लूकोज समाधान तैयार करें-nuclease-मुक्त पानी में ग्लूकोज । धीरे समाधान मिश्रण, शेयर aliquot (१.५ मिलीलीटर), और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      नोट: निंनलिखित काम एक चमकदार रोशनी से सुरक्षित कमरे में किया जाना चाहिए (केवल मंद प्रकाश) ।
    2. एक 24-खैर प्लेट30के प्रति अच्छी तरह से 20 pmol मीर का प्रयोग करें । ०.२५ के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 5% ग्लूकोज समाधान में मीर पतला pmol मीर/µ एल
    3. पी की राशि की गणना मीर राशि के आधार पर आवश्यक (20 pmol, कदम 2.3.1) और इष्टतम नाइट्रोजन (पी के) फास्फेट (मीर के) के लिए (एन/P स्टॉक एकाग्रता (कदम 2.2.1; यहां, ७.५ के अनुपात का इस्तेमाल किया गया था) के आधार पर अनुपात30। 5% ग्लूकोज समीकरण के आधार पर समाधान की एक बराबर राशि में बेई को पतला:
      Equation 3
      जो पुनर्व्यवस्थित
      Equation 4    समीकरण 3
      जहां बेई की मात्रा µ l में है और [बेई] मिमी में है, और N/पी (इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित) ०.७५ है । ०.१२ मीर के लिए विशिष्ट रूपांतरण कारक है ।
    4. पूर्व में पतला बेई जोड़ें 30 एस के लिए मीर और भंवर पतला ।
    5. आरटी में 30 मिनट के लिए मीर/
  5. मीर पी/िं परिसरों की तैयारी
    नोट: निंनलिखित काम एक चमकदार रोशनी से सुरक्षित कमरे में किया जाना चाहिए (केवल मंद प्रकाश) ।
    1. जबकि मीर की मशीन/पी परिसरों, sonicating पर 20 मिनट के लिए MNPs द्वारा MNPs तैयार ३५ kHz पर sonicating जल स्नान में भ सुनिश्चित करने के लिए कणों निलंबन और एकत्रीकरण नहीं कर रहे हैं ।
    2. िं स्टॉक सॉल्यूशन (step 2.3.1) के आधार पर आवश् यक MNPs (3 µ g आयरन/एमएल) की संख् या की गणना करें ।
    3. 30 एस के लिए मीर/पी परिसरों और भंवर में sonicated MNPs जोड़ें/RT पर 30 मिनट के लिए मीर की मशीन/
  6. चार रंग लेबलिंग सिम का उपयोग करने के लिए अभिकर्मक परिसरों की तैयारी
    नोट: अनलेबल्ड प्रणेता मीर का प्रयोग करें ।
    1. Cyanine 5 डाई एक Cyanine 5 डाई मीर लेबलिंग किट का उपयोग कर के साथ मीर लेबल ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के निर्देशों का पालन । (न्यूक्लिक एसिड, आरएनए-४०) निर्माता द्वारा प्रदान की पूर्व सेटिंग के अनुसार सूचीबद्ध spectrophotometer ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर अंतिम मीर एकाग्रता को मापने. Aliquot मीर (5 µ एल) और स्टोर पर-८० ° c प्रकाश से सुरक्षित ।
    2. एक उज्ज्वल हरी प्रतिदीप्ति के साथ पी लेबल एक उपयुक्त प्रोटीन लेबलिंग किट का उपयोग कर डाई ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के निर्देशों का पालन । अंतिम पी एकाग्रता Ninhydrin परख (2.2.1 कदम) का उपयोग कर परिभाषित करें । Aliquot पी (मात्रा में समीकरण 3के आधार पर गणना में) और 4 प्रकाश से सुरक्षित ° c पर दुकान ।
    3. rhodamine डाई संयुग्मित के साथ MNPs लेबल 1 के अनुपात का उपयोग कर बायोटिन के लिए: 1000 w/ rhodamine डाई और MNPs मीर की तैयारी के साथ समवर्ती मिश्रण और अंधेरे में 30 मिनट के लिए समाधान की मशीन के साथ मिक्स । प्रत्यक्ष त्यसपछि MNPs प्रयोग गर्ने ।

3. अभिकर्मक का CD133+ SCs

नोट: इस चरण के दौरान, पूरा काम अंतरिक्ष ribonuclease (RNAse) रखें-RNAse दूषण समाधान का उपयोग कर मुक्त और केवल RNAse-मुक्त उपभोज्य सामग्री का उपयोग
नोट: निंनलिखित काम एक चमकदार रोशनी से सुरक्षित कमरे में किया जाना चाहिए (केवल मंद प्रकाश) ।

  1. तैयार miRNA/बेई/िं लेक् dropwise को सीधे रूप से उपयुक्त अच्छी तरह से जोड़ें जिसमें संस्कृति माध्यम में ताजा पृथक CD133+ SCs है ।
  2. आगे और पीछे थाली रॉक द्वारा धीरे से मिक्स । ३७ ° c, 5% CO2 और 20% O2पर 18 ज के लिए कोशिकाओं को मशीन ।

4. मीर अभिकर्मक का विश्लेषण

  1. मीर के तीनो कुशलता की परीक्षा और अभिकर्मक परिसरों की cytotoxicity
    नोट: के लिए मीर-नमूना: उपयोग Cyanine 3 डाई के लिए प्रणेता मीर लेबल के लिए तेज मूल्यांकन और गैर transfected CD133+ प्रवाह cytometry नियंत्रण गेट्स के लिए SCs ।
    नोट: निंनलिखित काम एक चमकदार रोशनी से सुरक्षित कमरे में किया जाना चाहिए (केवल मंद प्रकाश) ।
    नोट: बर्फ पर ट्यूबों, बफ़र्स, और एंटीबॉडी रखने के लिए जब तक अंयथा कहा ।
    1. १०० मिलीलीटर पंजाब में कमजोर 4 जी पीएफए द्वारा paraformaldehyde शेयर समाधान (पीएफए, 4%), और ८० डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान हीटिंग तैयार करें । तेजी से समाधान मिश्रण और ७.३ के लिए पीएच मान को समायोजित । Aliquot पीएफए स्टॉक (१.५ मिलीलीटर) और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
    2. 18 ज अभिकर्मक के बाद, एक अलग १.५ मिलीलीटर ट्यूब में एक अच्छी तरह से इकट्ठा । पंजाब के ५०० µ एल के साथ एक बार अच्छी तरह धोएं और इसी ट्यूब पर इस सेल सस्पेंशन को ट्रांसफर करें ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और 4 ° c एमएसीएस बफर के १०० µ एल में प्राप्त गोली reसस्पेंड ।
    4. एक अमीन प्रतिक्रियाशील डाई के ०.५ µ एल जोड़ें जीने और मृत कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए, धीरे निलंबन मिश्रण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन । 1 एमएल पंजाब (4 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    5. supernatant त्यागें, १०० µ l पंजाब में प्राप्त गोली reसस्पेंड, ३३ µ एल पीएफए (4%), और बर्फ पर या स्टोर 4 ° c पर प्रवाह cytometric विश्लेषण तक जोड़ें ।
    6. चित्रा 2में प्रतिनिधि चित्रण के अनुसार गेटिंग रणनीति की व्यवस्था करें । निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रवाह cytometer ( सामग्री की तालिकादेखें) पर नमूने चलाएँ.
  2. मीर-transfected CD133+ SCs के लक्षण वर्णन
    नोट: प्रयुक्त अनलेबल्ड प्रणेता मीर के साथ ही नॉन transfected CD133+ SCs फ्लो cytometry कंट्रोल गेट्स के लिए ।
    1. एक अलग १.५ मिलीलीटर ट्यूब में एक अच्छी तरह से ले लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    2. चरण १.२ में वर्णित के रूप में गेटिंग रणनीति का उपयोग करें ।
  3. सिम द्वारा अभिकर्मक परिसरों के intracellular वितरण की परीक्षा
    1. परिसरों को तैयार करें और अनुभाग 2 और अनुभाग 3 में वर्णित कक्षों को transfect ।
    2. 18 ज अभिकर्मक के बाद, एक अलग १.५ मिलीलीटर ट्यूब में एक अच्छी तरह से इकट्ठा । पंजाब के ५०० µ एल के साथ एक बार अच्छी तरह से धो लें और अच्छी तरह से संबंधित ट्यूब में धोने हस्तांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    3. supernatant त्यागें और 2% पंजाब में भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 1 मिलीलीटर में प्राप्त गोली reसस्पेंड, धीरे निलंबन मिश्रण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    4. supernatant त्यागें, १०० µ में प्राप्त गोली reसस्पेंड पंजाबियों के एल, और जोड़ें ३३ µ l पीएफए 20 मिनट के लिए (4%) ।
    5. एक नया 24-संस्कृति बाँझ कांच coverslips युक्त प्लेट में सेल निलंबन स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. supernatant को छोड़ें और पंजाब के ५०० µ l को जोड़ें । धीरे से प्लेट हिला और पंजाबियों को त्याग दें ।
    7. पर तैयार coverslips जगह जलीय बढ़ते मध्यम प्रतिदीप्ति बनाए रखने के लिए और आर टी सी के लिए उंहें नीचे से कम 1 एच के लिए शुष्क का उपयोग कर स्लाइड पर ।
    8. एक 100X तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर छवियां प्राप्त । सिम सेटिंग्स: ४०५, ४८८, ५६१, और ६३३ एनएम उत्तेजना और जेड के लिए लेजर लाइनों 3 कोणों पर एक 16 बिट गहराई के साथ, 3 चरणों, 4 औसत के साथ, लेजर लाइन प्रति ग्रिड: 23 µm – ४०५, ३४ µm – ४८८, ४२ µm – ५६१, ५१ µm – ६३३ ।

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Representative Results

प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक मैनुअल अलगाव और मानव बीएम के चुंबकीय संवर्धन-व्युत्पंन CD133+ SCs एक बाद वायरस स्वतंत्र सेल इंजीनियरिंग रणनीति के साथ का वर्णन, के लिए एक गैर इनवेसिव प्रौद्योगिकी के रूप में इन विट्रो सेल हेरफेर में और vivo निगरानी उपकरण ।

यह तीन कदम अलगाव प्रौद्योगिकी पूर्व से MNCs की जुदाई की अनुमति देता है, घनत्व ढाल केंद्रापसारक के माध्यम से कठोर बीएम पचा । बाद में, एक CD133+ कोशिका अंश चुंबकीय रूप से उपयुक्त अलगाव प्रौद्योगिकी का उपयोग कर समृद्ध किया जा सकता है । यह CD133+ SCs की एक व्यवहार्यता और ८०% से अधिक शुद्धता, जो प्रवाह cytometry (चित्रा 1) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है के साथ एक संवर्धन की अनुमति देता है । इसके बाद, आवश्यकताओं से मेल खाने वाले केवल अनुसूचित जाति के उत्पादों को आगे के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया ।

अभिकर्मक विधि यहां वर्णित इन हौसले से अलग मानव CD133 में मीर का एक अत्यंत प्रभावी परिचय+ SCs व्यवहार्य कोशिकाओं के लगभग ८०% (चित्रा 2)30के एक के साथ एक को ले अनुमति देता है । इसके अलावा, कोई महत्वपूर्ण साइटोटोक्सिक प्रभाव स्पष्ट 18 एच अभिकर्मक के बाद नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 2)30की तुलना में कर रहे हैं । इसके अलावा, अभिकर्मक परिसर यौगिकों (मीर, पी, और MNPs) के एक पर्याप्त वितरण और सामांय वितरण सिम (चित्रा 3) का उपयोग कर कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के भीतर मनाया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: CD133+ अनुसूचित जाति लक्षण वर्णन के लिए प्रतिनिधि बूलियन गेटिंग रणनीति । (A-E) सेल व्यवहार्यता और पृथक CD133 की शुद्धता का सख्त मूल्यांकन के लिए एक 5-कदम चयन रणनीति का चित्रण+ अनुसूचित जाति के रूप में अच्छी तरह के रूप में (एफ) CD133 isotype नियंत्रण उचित इलाज बीएम नमूना का उपयोग कर । (a) एक आगे में बरकरार सेल जनसंख्या से मलबे को छोड़कर/साइड स्कैटर (FSC/एसएससी) डॉट भूखंड, के उत्तराधिकारी चयन के बाद (ख) CD45+ सेल जनसंख्या, (ग) व्यवहार्य CD45+ सेल जनसंख्या, (घ) व्यवहार्य डबल सकारात्मक CD45+/CD34+ सेल जनसंख्या, और (ई) व्यवहार्य ट्रिपल सकारात्मक CD45+/CD34+/CD133+ सेल जनसंख्या । नारंगी: CD45+/CD34+/CD133+ कक्ष प्रत्येक चयन चरण में हाइलाइट किया गया है । लीजेंड: APC-Cy7: विरोधी CD45, FITC: विरोधी CD34, FSC: फॉरवर्ड स्कैटर चैनल, पीई: विरोधी CD133, एसएससी: साइड स्कैटर चैनल, 7-AAD: 7-aminoactinomycin. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: मीर गेटिंग के मूल्यांकन के लिए प्रतिनिधि रणनीति और अभिकर्मक परिसर के cytotoxicity दक्षता । (क, ख) के गेटिंग रणनीतियाँ transfected CD133+ SCs के साथ ही (ग, घ) गैर-transfected CD133+ SCs के िरा के लिए (क, ग) Cyanine3 डाई लेबल के प्रणेता-miRNA की दक्षता ( लाल: व्यवहार्य Cy3+ कोशिकाओं) और (बी, डी) अभिकर्मक प्रक्रिया के साइटोटोक्सिक प्रभाव एक अमीन प्रतिक्रियाशील डाई द्वारा चिह्नित रहने और मृत कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए (नीला: मृत कोशिकाओं). लेजेंड: SSC: साइड स्कैटर चैनल, केवल कोशिकाएं: non-transfected CD133+ SCs, miRNA/बेई/िं: CD133+ SCs transfected with Cy3-त्यसपछि मीर कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अभिकर्मक परिसर के Intracellular दृश्य । CD133+ SCs तीन रंग के साथ transfected थे लेबल मीर/पी/िं परिसर (मीर: 20 pmol, पी: N/P अनुपात ७.५, िं: 3 µ g/एमएल) । प्रतिनिधि दृश्य संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग अभिकर्मक के बाद 18 एच प्रदर्शन किया गया था. मीर Cyanine5 डाई (लाल), एक चमकदार हरे प्रतिदीप्ति डाई (हरे रंग) के साथ पी के साथ लेबल था, और MNPs rhodamine डाई संयुग्मित के साथ (पीला) बायोटिन, और नाभिक counterstained के साथ DAPI (नीला) था । स्केल बार = 5 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नमूना FCR अवरुद्ध रिएजेंट [µ l] एमएसीएस बफर [µ एल] एंटीबॉडी [µ एल] कुल [µ l]
संख्या नमूना कक्ष [µ l] CD133-पे isotype CD133-पे CD34-FITC CD45-APC-Cy7 जोड़ें
1 Bm 10 10 १२.५ 5 - 5 २.५ 5 ५०
2 Bm 10 10 १२.५ - 5 5 २.५ 5 ५०
3 CD133+ (1x104) 10 १२.५ - 5 5 २.५ 5 ५०

तालिका 1: CD133 के लक्षण वर्णन के लिए Pipetting लेआउट + SCs ।

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Discussion

हाल के वर्षों में, CD133+ SCs अनुसूचित जाति आधारित चिकित्सा के लिए एक होनहार सेल जनसंख्या के रूप में कई चरण मैं, द्वितीय द्वारा सबूत के रूप में उभरा है, और III नैदानिक परीक्षण४३,४४,४५,४६, ४७ , ४८ , ४९ , ५० , ५१ , ५२ , ५३ , ५४. यहां, हम मानकीकृत मैनुअल शुद्धि और मानव स्टर्नल बीएम से इन कोशिकाओं के प्रवाह cytometric लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । वर्णित एमएसीएस-आधारित आइसोलेशन प्रक्रिया एक अत्यंत शुद्ध और व्यवहार्य टेम अनुसूचित जाति अंश प्राप्त करने के लिए एक सौंय, तेज, और कुशल रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है । अच्छी अनुकूलता के तेजी से गिरावट के साथ संयुक्त-इंजेक्शन एमएसीएस सेल छंटाई के लिए इस्तेमाल किया MicroBeads पहले हमारे समूह द्वारा प्रदर्शन किया गया है५५,५६।

इस अलगाव प्रक्रिया एक स्रोत सामग्री के रूप में मानव स्टर्नल बीएम का उपयोग कर विकसित किया गया था, और इसलिए, प्रोटोकॉल वर्तमान में गैर में उपयोग के लिए इरादा टेम SCs की शुद्धि-नैदानिक अनुसंधान में सक्षम बनाता है । यदि CD133+ SCs अंय ऊतकों से अलग कर रहे है (जैसे, बीएम श्रोणि शिखा से प्राप्त) ऐसे एंजाइमी ऊतक पाचन और घनत्व केंद्रापसारक के रूप में प्रोटोकॉल के कई कदम अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । नैदानिक सेल आवेदन के लिए, हमारे समूह आगे एक स्वत: प्रणाली का उपयोग करने के लिए नैदानिक जरूरतों५७की ओर से अतिरिक्त मांगों को पूरा करने के लिए एक जीएमपी अनुरूप पर साइट विनिर्माण प्रक्रिया की स्थापना की ।

अपने आवेदन करने से पहले SCs के इंजीनियरिंग कम सेल प्रतिधारण और बड़े पैमाने पर सेल मौत सहित अनुसूचित जाति चिकित्सा में कुछ बाधाओं को दूर करने के लिए एक उपंयास रणनीति है । वर्तमान प्रोटोकॉल एक वायरल मुक्त बहुआयामी अभिकर्मक branched MNPs के लिए बाध्य पी और CD133+ SCs30में अपने कुशल परिचय के आधार पर प्रणाली के उत्पादन के लिए निर्देश शामिल हैं । इस प्रणाली के आवेदन आनुवंशिक कोशिका संशोधन, चुंबकीय नियंत्रित सेल मार्गदर्शन, और एमआरआई या MPI30,31,४०,४२,५८ के माध्यम से गैर इनवेसिव सेल अनुरेखण सक्षम बनाता है , ५९ , ६०.

महत्वपूर्ण बात, वर्णित अभिकर्मक स्थितियों CD133 के क्षणिक आनुवंशिक संशोधन के लिए अनुकूलित किया गया है+ बीएम-व्युत्पंन SCs30। पिछले कार्यों में, यह अभिकर्मक प्रणाली भी सफलतापूर्वक अंय सेल प्रकार के लिए प्लाज्मिड डीएनए और मीर के वितरण के लिए लागू किया गया है31,४०,६०। इन प्रयोगों से यह दर्शाया गया है कि अभिकर्मक कार्यकुशलता के साथ ही cytotoxicity कोशिका प्रकार-निर्भर हैं. इसलिए, NAs, पी, और MNPs की इष्टतम रचनाओं प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए परिभाषित करने की आवश्यकता है ।

अपनी उच्च दक्षता के कारण, पी एक गैर वायरल आनुवंशिक सेल इंजीनियरिंग६१के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया पॉलिमर में से एक है । हालांकि, नैदानिक आवेदन६१,पी के६२ बहुत इसकी वजह से सामान्य विषाक्तता६१,६३की तारीख तक ही सीमित है. दिलचस्प है, हमारे समूह ने हाल ही में प्रदर्शन किया है कि MNPs पी विषाक्तता कम जब अभिकर्मक प्रणाली31,६०में शामिल थे । एक ही समय में, लौह ऑक्साइड आधारित नैनोकणों के संभावित विषाक्तता प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के उत्पादन की वजह से खुराक पर निर्भर है और superparamagnetic नैनोकणों के कई प्रकार एमआरआई६४,६५ के लिए अनुमोदित कर रहे हैं . हालांकि, ध्यान इन विट्रो और vivoमें प्रणाली की विषाक्तता के लिए भुगतान किया जाना चाहिए ।

कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल काफी जटिल है, कई महत्वपूर्ण कदम है कि बहुत ध्यान से संबोधित किया जाना चाहिए युक्त । इस प्रयोजन के लिए, हमने इन बिंदुओं को प्रोटोकॉल अनुभाग में नोट्स के साथ हाइलाइट किया है. विशेष रूप से, हम एक पूरी तरह से RNAse मुक्त पर्यावरण के महत्व को इंगित करना चाहते है और किसी भी प्रकाश जोखिम से परहेज जब लागू फ्लोरोसेंट रंजक हैंडलिंग ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की ।

Acknowledgments

यह काम शिक्षा और अनुसंधान जर्मनी के संघीय मंत्रालय (FKZ 0312138A और FKZ ३१६१५९) द्वारा समर्थित किया गया था, राज्य Mecklenburg-वेस्टर्न Pomerania के साथ यूरोपीय संघ संरचनात्मक कोष (ESF/IVWM-B34-0030/10 और ESF/IVBM-B35-0010/12), और DFG (DA1296/2-1), जर्मन हार्ट फाउंडेशन (F/01/12), BMBF (वीआईपी + ००२४०) और नम फाउंडेशन । इसके अलावा, F.H. और P.M. रॉस्टॉक यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (८८९००१) के FORUN प्रोग्राम द्वारा समर्थित हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

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References

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
  3. Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
  4. Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
  5. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023 (2015).
  6. Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
  7. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  8. Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
  9. Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
  10. Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
  11. Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
  12. Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
  13. Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
  14. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
  15. Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
  16. Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
  17. Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
  18. Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
  19. Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
  20. Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
  21. Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
  22. Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
  23. Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
  24. Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149 (2013).
  25. Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
  26. Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
  27. Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
  28. Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  29. Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
  30. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  31. Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
  32. Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
  33. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
  34. Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
  35. Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
  36. Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  37. Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  38. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
  39. Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
  40. Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154 (2014).
  41. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
  42. Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  43. Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
  44. King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700 (2015).
  45. Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
  46. Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
  47. Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
  48. Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
  49. Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342 (2015).
  50. Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
  51. Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
  52. Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
  53. Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
  54. Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
  55. Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
  56. Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
  57. Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33 (2017).
  58. Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
  59. Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  60. Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
  61. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  62. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023 (2016).
  63. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  64. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
  65. Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).

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-अभियांत्रिकी निर्गम १३६ स्टेम सेल CD133 आनुवंशिक संशोधन गैर वायरल अभिकर्मक microRNA चुंबकीय लक्ष्यीकरण चुंबकीय नैनोकणों polyethylenimine
वयस्क अस्थि मज्जा में MicroRNA हस्तांतरण के लिए प्रोटोकॉल-व्युत्पंन टेम स्टेम कोशिकाओं सेल इंजीनियरिंग चुंबकीय लक्ष्यीकरण के साथ संयुक्त सक्षम करने के लिए
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Hausburg, F., Müller, P., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting. J. Vis. Exp. (136), e57474, doi:10.3791/57474 (2018).

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