Summary
여기 우리가 수집 하 고 microinjecting precellular 서쪽 옥수수에 대 한 프로토콜 rootworm 배아 생식 변환 및 CRISPR/Cas9-게놈 편집과 같은 게놈 기능 분석을 수행 하기 위해 제시.
Abstract
서양 옥수수 rootworm (WCR) 옥수수의 중요 한 해충 이며, 해충 관리 전략에 빠르게 적응 하는 능력으로 잘 알려져 있다. RNA 간섭 (RNAi) WCR 생물학 공부를 위한 강력한 도구가 될 수 입증 하고있다, 그것은 한계가 있다. 특히, RNAi 자체는 일시적 (즉 귀착되 지 않는다 관련 된 표현 형의 장기 Mendelian 상속), 그것은 대상 유전자의 DNA 순서를 알고 필요 합니다. 후자 수 수 제한 관심의 표현 형이 제대로 보존 하 고, 또는 심지어 새로운 유전자에 의해 제어 되는 경우 유용한 목표 식별 도전 될 것 이라고, 때문에 불가능. 따라서, 안정적인 돌연변이 체 긴장을 만들고 WCR 게놈의 순서에 관계 없이 조사를 활성화 하는 데 사용할 수 있는 방법의 개발에 의해 WCR의 게놈 도구 상자에서 도구 수를 확장 한다. 여기, 우리가 수집 하 고 핵 산와 precellular WCR 배아를 microinject 하는 데 사용 하는 방법 자세하게. 여기에 설명 된 프로토콜은 유전자 변형 WCR의 생성을 위한, 그러나 CRISPR/Cas9-게놈 편집 수 또한 수행 유일한 차이 배아에 주입 하는 솔루션의 구성 되 고 동일한 프로토콜을 사용 하 여.
Introduction
서 부 옥수수 rootworm (WCR) Diabrotica virgifera virgifera, 옥수수1의 중요 해충 이다. 흥미롭게도, WCR 제어를 극복 하기 위해 표시 됩니다 그들은 뿐만 아니라 적응 뿐만 아니라 순수 행동2,3,,45, 이후 가장 농업 해충 보다 더 빠르게 측정 6. 지난 10 년간, RNA 간섭 (RNAi), 강력한 기능 게놈 도구 WCR7,8에 대 한 잠재적인 제어 방법으로 조사 되 고 유전자 기능9공부 하는 수단으로도 사용 되었습니다. 그러나, RNAi 다른 종에서 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 microinjection에 의해 자주 수행 하는 동안 주입 기반 RNAi WCR에 드문 경우입니다. 사실, 몇 가지 보고서만 RNAi 통해 microinjection dsRNA의 WCR9에 있다. 이유는 심지어 어머니11dsRNA를 먹이로 미 발달 효과의 연구를 허용 하 게 되는 높은-수준의 유전자 때 려 눕 힘 을 통해 섭취 dsRNA7,10, WCR에 달성할 수 있다. 이 방법을 만드는 동안 WCR 기능 게놈 분석 통해 RNAi를 위한 우수한 주제, 그것은 배아 microinjection이 수이 종에 대 한 방법론의 개발 진행을 둔화 했다.
RNAi의 힘에도 불구 하 고 몇 가지 단점이 있다. 예를 들어 모든 유전자 RNAi를 동등 하 게 응답합니다. 이 변화는 더 어려운 기능 유전체학 시험의 결과 해석 할 수 있습니다. 또한, RNAi는 일시적 이며 상속 돌연변이 생성 하지 않습니다. 다른 한편으로, 생식 변환, 다른 기능 게놈 도구, 상속 돌연변이 통해 삽입 표시 transposable element의 게놈12,13으로 생성할 수 있습니다. 이것은 생식 변환 장기 유전 연구에 사용 하기 위해 돌연변이 종자를 만들기 위한 훌륭한 도구. 변환 돌연변이 게놈14에 유전자의 기능 복사본을 제공 하 여 돌연변이 구출 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 생식 변환 다양 한 분자 유전 기법의 초석입니다. 밖으로 노크 및 유전자 기능 구조, 뿐만 아니라 생식 변환 증강 트래핑15, 유전자 트래핑16, Gal4 기반 소성 식17, 및 게놈 넓은 mutagenesis18사용할 수 있습니다.
더 최근에, 정교한 게놈 편집 사용할 수 있는 도구 개발 되었습니다. 이러한 도구에는 전사 Activator-Like 이펙터 Nucleases (TALEN) 및 CRISPR/Cas9-nuclease 시스템19,20포함 됩니다. 이러한 새로운 도구의 장점은 그들은 거의 모든 게놈 내의 거의 모든 위치에서 이중 가닥 DNA 휴식을 유도 하는 능력 연구원을 제공. 삭제 또는 타겟된 유전자에 삽입 발생할 수 있습니다, 어느 비 동종 끝, 또는 상 동 감독 수리, 설계 구축 존재 촉매 수 있습니다 통해이 나누기를 복구할 수 있습니다 유발, 일단은 전체 유전자 또는 유전 지역21,22의 교체. 그러나, 이러한 방법을 사용 하려면 아주 어린 배아로 DNA, RNA 및 단백질의 microinjection.
중요 한 것은, RNAi, 핵 산 및 단백질 생식에 대 한 사용 사용 dsRNAs 달리 변환 및 게놈 편집 교차할 수 없습니다 쉽게 세포 막. 따라서, 플라스 미드 DNAs, mRNAs, 단백질의 microinjection syncytial blastoderm 단계 (즉 곤충 태아 cellularizes 전에) 자리를 차지할 해야 합니다. 이것은 주사의 타이밍 중요 한 요소. 예를 들어 초파리 melanogaster, 배아 달걀 누워12후 2 시간 이내에 주입을 해야 합니다. 따라서, 여성 달걀 누워, precellular 배아의 충분 한 수량을 수집 하기 위한 가장 좋은 방법에 대 한 최상의 조건 WCR에 대 한 성공적인 배아 microinjection 프로토콜의 개발 계정에 취해야 합니다.
다양 한 분자 유전 도구 WCR 생물학에 대 한 부담을가지고 노력 수집 및 microinjecting precellular WCR 배아에 대 한 방법을 개발 해야 합니다. 여기 우리 WCR 연구에서 변환 기반 기술을 사용 하 여 다른 사람들을 돕고 팁과 트릭, 함께 자세한 지침을 제공 합니다. 기능적 게놈 연구에 사용 하기 위해 유전자 변형 기술을 WCR 연장, 뿐만 아니라 이러한 기술 또한 테스트할이 경제적으로 중요 한 유전자 드라이브23,24 등 강력한 새로운 해충 제어 전략 사용 해충입니다.
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Protocol
1. 식민지 수준 WCR 성인의 양육
- 충분 한 양의 WCR 성인 구하는 (500-1000)에서 신뢰할 수 있는 회사 또는 연구 실험실 ( 테이블의 자료 에 대 한 참조 예) 30cm3 장에 배치.
참고: 비-diapausing 긴장의 사용이 좋습니다. - 제조 업체의 프로토콜을 따르고 WCR 인공 다이어트 준비 하 고 38 온스 컨테이너 1 cm 두꺼운 레이어를 붓고 ( 재료의 표참조). 혼합 후, 최대 2 개월까지 4 ° C에서 사용 하지 않는 다이어트를 저장 합니다.
- 30cm3 케이지에 성인 다이어트 (10-15 g) 페 트리 접시 (100 x 15 m m)를 넣어. 음식이 부족 하거나 건조 할 때 더 많은 다이어트를 추가 합니다.
- 물 소스로 봉사 하 면 롤 (6 "x 3/8"), 장소에서 개최 하는 데 사용 되는 면봉으로 덮여 물 플라스 크 (300 mL)을 넣어. 그것은 부족 하면 물을 변경 합니다.
- WCR 습도 60%와 26 ° C에서 유지 하 고 14:10 빛 인큐베이터 양육 곤충에 주기.
2. 배아 수집 및 정렬
- 1% 한 천은 물에을 사용 하 여 살 균 100 x 15 m m2 페 트리 접시에에서 달걀 수집 챔버를 확인 합니다. agar 굳은 후 4 ° C에서 저장 합니다.
- 새로 놓인된 달걀을 수집, 필터 종이, 한 천 (그림 1A)의 표면에 투박한 (크기 각 컷)의 4 층에 의해 다음의 단일 레이어를 놓습니다.
참고: 투박한 다시 사용할 수 있습니다, 후 표 백제에 세척 하 고 압력가, 하지만 그것은 처음 사용을 위해 이것을 할 필요가 없습니다. 필터 종이 재사용 되지 않을 하 고 살 균 될 필요는 없습니다. - 계란 컬렉션 접시 WCR으로 가능 (작업 일의 끝)으로 하루에 늦게 놓고 은박지 텐트와 함께 커버 합니다. 하룻밤 둡니다.
실험실 직원으로 늦은 밤 컬렉션 챔버를 필요 없이 microinjection에 대 한 젊은 계란의 수집을 촉진 따라서 참고: 데 불 오전 10 시에서 오전 12 시 (14 h) 지연 달걀 누워. - 약 8 또는 오전 9 시부터 계란 수집 약 실 제거
- 집게를 사용 하 여 투박한의 1 층의 물 비 커 (500ml)에 장소와 시간에 데리 러. 부드럽게 (그림 1B 및 1 C) 교 반에 의해의 투박한 계란을 세척.
- 전구 피 펫을 사용 하 여 다른 비 커 (500ml) 물에 계란을 전송. 계란을 청소 2-3 배를 반복 합니다.
- 필터 종이 (그림 1D)에 계란을 전송 전구 피 펫을 사용 하 여 물 수행의 양을 최소화 하면서.
- 단단히 되도록 슬라이드에 검은 필터 종이 테이프를 유리 슬라이드 너비 스트립으로 잘라 종이 평면 (그림 2A) 낳는다.
참고: 검은 필터 종이 반사 된 빛의 양을 줄여 현미경 가시성을 향상 도움이 됩니다. - 비-독성 접착제를 적용 (예를 들어에 대 한 재료의 표 참조) 단서 (그림 2B)에 필터 종이에. 접착제 라인 유지 되지 않도록 접착제 코팅 계란 달걀의 직경 보다 얇은.
- 좋은 브러시를 사용 하 여 부드럽게 이동 WCR 계란 하나에 의해 그들의 필터 종이에서 접착제 라인. 접착제에는 알을 낳 기 전에 그것을 밖으로 건조 하 고 각 계란 사이 적어도 1 개의 계란의 거리를 유지.
- 하나의 필터 종이 슬라이드 (그림 3)에 계란의 여러 줄을 배치 하 여 주입 효율을 극대화 합니다.
- 후 모든 계란 필터 종이에 뻗어 있다, 모든 접착제 microinjection 전에 건조 때까지 기다립니다.
참고: 생식 변환 및 편집 CRISPR/Cas9-중재 게놈 주사 모든 배아 정오 (12 시)에 의해 가장 오래 된 배아는 19 h 더 이상. 그러나, RNAi에 대 한 제한은 없는 시간 WCR에 dsRNA 셀 사이 이동할 수 있기 때문 에입니다. 사실, RNAi, 노화 배아 더 나은 생존 율에서 발생할 수 있습니다.
3. 플라스 미드 DNAs와 주사 바늘의 준비
- 내 무료 광고를 사용 하 여 높은-품질 supercoiled 플라스 미드 DNA 준비 키트 (예에 대 한 재료의 표 참조).
- 주입 솔루션을 준비 하려면 각 플라스 미드의 농도 확인 하 고 도우미 플라스 미드 (250 ng / µ L 최종 농도), 기증자 플라스 미드 (750 ng / µ L 최종 농도) 및 페 놀 레드 버퍼 (최종 농도 20%)를 결합 합니다. 소용돌이 솔루션 짧게 하 고 바늘을 방해할 수 있는 입자 침전을 최대 속도에서 3 분 동안 원심 분리기.
- 붕 규 산 유리 바늘 (마약 1 mm, 아이디 0.58 m m, 10 cm 길이)를 당겨 불타 는/브라운 유형 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여. 저장, 페 트리 접시 또는 다른 분명 컨테이너에 이중 면 끈끈한 테이프에 가져온된 바늘을 보안 합니다.
참고: micropipette 끌어당기는 시스템에 대 한 설정을 사용 했다: 열 335, FIL = = 4, 벨 = 40, 델 = 200, 풀 = 100. - 백필 마이크로 로더를 사용 하 여 주사 바늘 팁 ( 테이블의 자료를 참조) 피펫으로 0.5-1.0 µ L 아래로 테이퍼 끝부분 바늘 내부. 발생 하는 경우는 바늘의 팁에서 거품을 제거 합니다.
- 바늘 홀더에 주사 바늘을 삽입 합니다.
- 부드럽게 집게의 좋은 쌍을 함께 하거나 부드럽게 터치/드래그 coverslip 또는 유리 슬라이드에 팁으로 바늘의 팁을 엽니다.
참고:는 목표는 아직도 주입 혼합 밖으로 나올 수 있도록 작은 개방 (작은 구멍 일반적으로 더 높은 주입 압력을 필요로). 이후 그들은 이미 열려 경사진된 바늘이이 단계를 필요 하지 않습니다.
4. microinjection 및 포스트 주입 치료
- 좋은 페인트 브러시를 사용 하 여 신중 하 게 살 균 물으로 1-3 계란의 표면에 젖은, 바늘, 넣고 솔루션을 주입 합니다. 표면 건조 하기 전에 각 계란을 주사. 찾습니다 모양 달걀 안에 붉은 색의 작은 금액을 성공적인 microinjection을 가리키도록 주입 하는 동안. 분쇄 또는 손상, 빈, 또는 그렇지 않으면 주입 수 없습니다 모든 계란을 제거 합니다.
참고: 비록 사출 압력 바늘 구멍 크기에 따라 다릅니다, 10-13 psi 좋은 출발점입니다. - 모든 계란은 주입 후 유리 슬라이드에서 필터 용지를 제거 합니다.
- (위에서 설명한) 1% 한 천은 접시의 표면에 필터 종이 놓습니다.
- 플라스틱 파라핀 영화를 사용 하 여 요리를 봉인 하 고 12 일 동안 인큐베이터 양육 26 ° C 곤충에 넣어.
참고: 파라핀 영화 요리 사이 형의 교차 오염을 방지 도움이 됩니다. 그러나, 금형 및 박테리아의 성장을 방지 하기 위해 다른 치료는 주입 된 배아의 생존을 줄일 수 있습니다.
5. 배양 및 배아의 부 화
- 태아 12 일 후 주입 새로 부 화 애벌레에 대 한 검사를 시작 하 고 2 주 동안 매일 계속.
- 애벌레, 부 화 한 옥수수와 토양 양육 상자에 좋은 브러쉬를 사용 하 여 전송 합니다.
참고: 형 한 접시에 성장 수 있습니다 하지만 애벌레 여전히 대부분의 경우에 해치 것입니다. 신중 하 게 모든 그들을 잡으려고 금형 내에서 애벌레를 찾고 있습니다. 일부 애벌레 수 접시의 뚜껑을 이동한 결로에 갇혀 얻을 수 있습니다. - 다음 표준 WCR 양육 방법2526 ° C에서 애벌레 후면.
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Representative Results
이 프로토콜을 개발할 때 중요 한 고려 사항은 microinjection의 때에 미 발달 발달의 단계 이었다. 특히, 생식 변환 배아 cellularization 이전 DNAs의 microinjection를 요구 한다. DNAs 쉽게 세포 막을 교차할 수 없습니다 때문입니다. WCR 배아 개발 핵 얼룩을 사용 하 여 단계를 시각화 하는 시도 dechorionation WCR 배아의 기본적으로 모든 태아의 무결성에 대 한 책임 보호 막을 녹이 고 때문에 실패 했다. 그러나, 질문의이 라인은 다른 어려움-배아의 충분 한 수량을 적시에 취득에 의해 바 뀌. 필드에서 WCR 여성 토양에 자신의 알을 낳는, 따라서 그것은 놀랄 그 연구실에서 여성만 알을 어둠 속에서 이어야 한다. 이 어려운 짧은 낮 컬렉션 (2-4 h) 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 단일 하룻밤 달걀 누워 수행 하 고 많은 양의 태아를 발견 했다. (그림 1)를 수집 하 고 (그림 2) 배아 microinjection에 대 한 레이아웃의 과정이 다소 힘 드는, 신속 하 게 수행 하는 경우이 프로토콜 수 없고 2-19 h 주입의 시간에서 오래 된 사이 있는 태아의 microinjection 주사는 나중에 수행 하는 경우 24 시간 보다 나이가. WCR와 다른 종 사이의 개발 시간의 비교 WCR 배아 아직도 24 게시물 달걀 누워 (토론 참조) h precellular 해야 한다 건의 한다.
WCR의 생식 변화에 첫번째 시도 precellular 배아로 도우미 (transposase 소스)와 기부자 (transposon) 플라스 미드의 공동 주입 (그림 3) 참여. 기증자 플라스 미드에 대 한 변환 마커 녹색 형광 단백질 (EGFP) 유전자 Tribolium castaneum (알파-tubulin 발기인26)에서 constitutively 활동적인 발기인에 의해 구동 했다. 배아 생존 율은 낮은 (표 1), 하지만 26 G0 성인 회수 했다. 기증자 요소 어떤 세균 세포, G1 에 배아 삽입 확인 하려면 EGFP 식 상영 했다. 비록 형광 자손 실제로 확인 되었다 (그림 4), 치명적인27판명 WCR 배아 강렬한 광원으로 심사. 생식의 다음 라운드는 새로운 기증자 플라스 미드, 초파리 melanogaster (열 충격 단백질 70 발기인28에서에서 constitutively 활동적인 발기인에 의해 구동 하는 빨간 형광 성 단백질 (DsRed) 유전자를 보유 한 활용 ). 생존 율이 많이 향상 (표 1) 동안, 살아남은 성인 단 하나의 DsRed 양성 유 충 (그림 5) 생산. 그러나, 이러한 실험 두 안부에 특히 유익 했다. 첫째, 그것은 발견 되었다 그 microinjection는 확장된 시간-에-해치 결과 개발에서 지연 발생. 모든 태아는 2 주 안에 부 화, 보다는 오히려 주입된 태아 12 및 26 일 포스트 microinjection, 따라서 모든 파묻혀 수집 되도록 모니터링 장기간 필요 사이 부 화. 둘째, 그것은 새로 부 화 애벌레 상당히 활성화 되었다 발견 되었다. 그들은 어디 그들이 얻을, 하 고 때로는 한 천 요리에서 탈출 뚜껑에 크롤 링 합니다. 이러한 문제는 파라핀 영화와 접시를 씰링 하 고 뚜껑과 한 천 파묻혀 위해 신중 하 게 검사 하 여 극복 되었다.
이 주입 프로토콜의 최종 버전은 microinjecting WCR 배아 버퍼 혼자, 또는 도우미와 눈-promotor (3xP329) 표시 기증자 DNA 플라스 미드에 의해 시험 되었다. 추가 제어로 배아의 또 다른 세트는 동일 하 게 처리 했다 하지만 microinjected 하지 했다. 배아의 4 세트는 어느 주입 솔루션으로 주입 했다. 총 485 배아의 부 화 그, 148의 버퍼와 주입 했다 (해치 속도 = 30.5%, 표 1). 289 플라스 미드 DNAs 주사 1450 배아의 부 화 (속도 = 26.8%). 흥미롭게도, 수술 같은 달걀 처리 조건, 470 배아의 microinjection 하지 않고 있지만, 유일한 250 부 화 (속도 = 53.2%). Uninjected 배아의 생존 율은 20% 주입 된 배아의 생존 율 보다 높은 microinjection으로 인 한 피할 수 없는 손상으로 인해 예상 될 것입니다. 그러나, 작은 차이 버퍼 주입 및 DNA 주입, 추가 되 고 DNA의 양을 WCR 적합은 사이 볼 수 있다 (내용 참조). 이러한 결과 또한 생존 율 이전 노력 보다 향상 된 다는 것을 보여준다. 이 메서드를 사용 하 여 유전자 변형 라인의 성공적인 설립 되었습니다27다른 곳에서 보고.
그림 1: 계란 컬렉션. A) 계란 수집 약 실. B) Zoomed 보기 후에 24 h 계란 계란 챔버의 섹션의 하다. 참고, 화살표는 몇 알의 위치를 나타냅니다. C) 투박한에서 계란을 세척. D) WCR 계란의 최종 전송. 참고, 브래킷 밀도가 포장된 WCR 배아 (즉, 최소한의 물) 지역입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 주입 슬라이드 준비. A) 블랙 필터 종이 테이프로 단단히 표준 현미경 슬라이드를. B) Zoomed 뷰 주사의 섹션의 준비 과정에서 슬라이드. 참고, 화살표 #1 계란의 행, 접착제의 부분 선 #2 및 #3 핀 접착제를 확산 하는 데 사용의 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 배아 주입. 계란의 8 행 사출 슬라이드입니다. 주사 바늘의 각도 때문에 배아의 연속 행 단순히 스테이지를 이동 하 여 주입 수 있습니다. 참고 주사 바늘에 빨간 염료는 크게 주사의 시각화 에이즈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 유전자 변형 G1 태아 PiggyBac와 공동 주입 이었던 WCR 성인에서 배아-초기 배아로 도우미와 기증자 플라스 미드를 기반으로. 밝은 녹색 배아는 다른 하는 동안 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식에 대 한 긍정적 이다. EGFP 식26 Tribolium castaneum 알파-tubulin 발기인 의해 구동 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 유전자 변형 G1 유 충. 부모는 piggyBac와 공동 주입 3 탈피 애벌레-초기 배아로 도우미와 기증자 플라스 미드를 기반으로. 오른쪽에 유 충은 왼쪽에 붉은 빛나는 유 충 DsRed 식에 대 한 긍정적 이다. DsRed 식 초파리 melanogaster 열 충격 70 발기인28에 의해 구동 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 실험 | 치료 | 계란 | 부 화 | 해치 속도 |
| Exp #1. | ΑtubEGFP-기증자 | 910 | 57 | 6.3% |
| Exp #2. | hsp70DsRed-기증자 | 1580 | 211 | 13.4% |
| Exp #3. | 3xP3EGFP-기증자 | 1450 | 389 | 26.8% |
| 버퍼 | 485 | 148 | 30.5% | |
| 아니 주입 | 470 | 250 | 53.2% |
표 1: Microinjection 데이터. WCR 배아, 주입 하는 계란의 총 수, 성공적으로 부 화, 애벌레의 총 수 해치 속도 보여주는에 세 microinjection 실험에서 부 화 한다.
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Discussion
비록 dsRNAs RNAi 목적으로 WCR의 microinjection 보고9, 이것이 microinjecting precellular WCR 배아 생식 변환 수행을 위한 중요 한 과정에 대 한 우수 사례를 확립 하는 첫 번째 프로토콜 및 CRISPR/Cas9 게놈이이 종에서 편집입니다. WCR 배아의 성공적인 microinjection 변환 효율성은 여러 요소에 따라 달라 집니다. 아래는 몇 가지 주요 문제에 영향을이 프로토콜을 사용 하 여 생식 변혁이이 딱정벌레에 대 한 결과.
Precellular 배아를 얻기
위에서 설명 했 듯이, DNA는 세포 막 방법 dsRNA 수 교차 하지 않습니다. 즉, 그것이 중요 한 중요성의 DNA, mRNA, 또는 단백질 cellularization 발생 하기 전에 주입 수 있습니다. 주입의 타이밍은 중요 한, 때문에 embryogenesis 완료 하려면 nondiapausing WCR 스트레인30 걸리는 시간에 따라 성공적인 microinjection에 대 한 가능성이 윈도우를 확인 하는 것이 중요 했다. 이 다른 딱정벌레, Tribolium castaneum에 syncytial blastoderm 무대의 타이밍의 상세한 연구에 따라 계산 했다. Tribolium, cellularization ~ 8 h 게시물 달걀 누워 30 ° C31에서 발생합니다. 때문에 30 ° C에서 완전 한 embryogenesis에 Tribolium 에 대 한 일을 걸리는 cellularization 일어난다 10 분의 1 방법의 과정에. WCR 배아 개발에 거의 2 주 걸릴, 이후 두 번째 날 게시물 달걀 누워 때까지 cellularization 발생할 수 있습니다. 따라서, 그것은 성공적인 microinjection에 대 한 창 적어도 24 h, WCR 하룻밤 계란 계란의 충분 한 수량을 제공 하는 microinjection에 대 한 누워 필요 도움이 되는 간주 되었다. 이 메서드는 성공적인 transgenesis27에 사용 되었다, 그것은 생각할 수 있는 초기 배아를 처리 해 그들을 원인이 되지 않습니다 제공 결과 젊은 배아를 주입 하 여 향상 될 수 있습니다.
DNA 품질 및 농도
그것은 놀라운 DNA 농도 성공적인 변환에 중추적인 역할을 한다입니다. 그것은 오래 되었습니다 생각 아래 1 mg/mL 플라스 미드 DNA의 최종 농도 유지 했다32주입된 태아 잠재적인 독성을 방지 하는 데 필요한. 비록 지금은 과거의 독성 문제 때문에 자체 DNA 또는 플라스 미드 정화 과정에서이 월 하는 오염 물질의 결과 대신 했다,이 어림짐작은 되었습니다 steadfastly 준수 2 년간에 대 한 경우에 분명 하다. 그러나, 우리가 최근에 발견 1 mg/mL을 초과 제한 했다 가능한 뿐만 아니라 높은 변환 속도 달성할 수 있도록 그 일 계란 독성의 부재에 플라스 미드 정화 장비, 발전 될 수 있습니다 추측으로 이어지는 더 적은 오염 물질의 결과로. WCR에 필요한 시간을 감안할 때, 변환 속도 증가 도움이 됩니다, 경우에 그것은 약간 더 높은 사망 율에 있는 결과.
Microinjection 전에 계란 표면 연 화
Tribolium, 달리 WCR 배아의 가장 바깥쪽 표면 (chorion) microinjection 전에 부드럽게 해야 합니다. 이 석 영 바늘을 사용 하는 경우에 중요 한 단계입니다. 이상적으로, 물 주입, 직전 단일 배아에 적용 해야 하지만 적용할 수 2 ~ 3 배아의 그룹에 한 번에 microinjection chorions reharden 전에 달성 될 수 있다. 이 단계 없이 바늘 침투는 chorion, 주입 시도 실패, 그로 인하여 발생 하 고 잠재적으로 바늘 끝을 손상 하지 일반적으로. 또한, 건조 chorion에 성공적으로 침투 하는 바늘 경우 주입 솔루션 일반적으로 누수 다시 태아 주위 압력 보다 높은 내부 압력 때문에. 그러나 그것은,, 젖은 (부드럽게) 배아에서 건조 구분 하기 쉽습니다. 특히, 건조 하면, 배아가지고 뚜렷한 둥근 모양의 동안 물 추가 발생 하는 그들의 둥근 모습을 잃고 경직 된. 부드럽게 뿐만 아니라 쉽게 침투는 chorion 바늘을 허용 하지만 또한 주입 솔루션 밖으로 누출 되지 않습니다 충분히 배아 내부 압력을 감소.
습도 및 금형
주입 된 배아는 embryogenesis에 걸쳐 따뜻하고, 습 한 환경에서 개최 됩니다. 이러한 조건을 WCR 개발을 위한 완벽 한 환경을 제공 뿐만 아니라 또한 곰 팡이의 성장을 촉진. 이 2 주 기간 동안 형은 자주 WCR 배아 주택 한 천 요리에 성장 한다. 불행히도, 배아를 필요로 높은 습도, 그리고 훨씬 낮은 해치 속도 귀착되 었 다 그것을 줄이기 위해 시도. 흥미롭게도, 금형의 존재 일반적으로 했다 거의 영향을 미치지, 해치 속도에 대부분 배아 해칭 문제 없이. 또한, antifungal 치료 되므로 WCR 태아에 유해한 형 성장을 감소 시키는 가장 좋은 방법은 나타납니다을 피하기 위해 오염; 청소 도구, 용기, 및 microinjection 시스템을 사용 하기 전에, 그리고 곰 팡이 포자는 많은 실험실 환경에서 널리 퍼진 이후 최소 microinjecting 시간을 유지 하려고 합니다.
결론
이 프로토콜 WCR 연구에서 유전자 변형 기술 고용 더 많은 연구를 활성화 하기 위한 것입니다 그리고 잘하면이 곤충에 사용 하기 위해 추가 제 닉 기반 기술 개발에 도움이 됩니다. Tribolium 에서 실시 하는 정교한 제 닉 기반 실험 WCR, mutagenesis33 와34편집 CRISPR 기반 게놈을 포함 하 여에 맞게 수 수 있습니다. 있습니다 이러한 기술이 필요로 precellular 배아의 microinjection, 때문에이 프로토콜 transposon 기반 기능 게놈 연구 / CRISPR/Cas9-중재 게놈 유전자 기반 해충 관리 전략에 대 한 뿐만 아니라 편집을 위해 뿐만 아니라 도움이 될 것입니다. 35 , 36.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 몬산토 옥수수 Rootworm 지식 연구 프로그램에서 교부 금에 의해 지원 되었다, NCSU에서 MDL 번호 AG/1005 (MDL을 YC) 및 시작 자금 부여. FC 몬산토의 옥수수 Rootworm 지식 연구 프로그램 (AG/1005)와 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 부여 번호 MCB-1244772 (MDL). 저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다. FC 및 MDL 잉태와 설계 실험; FC, 비밀 번호 및 SP 수행 실험; FC 및 MDL 분석 결과; 그리고 FC, NG 및 MDL 원고를 썼다. 우리 감사 테레사 오리 어 리, 윌리엄 Klobasa, 그리고 스테파니 고르 WCR 심사에서 그들의 전문가 도움. 우리는 또한 양육 프로토콜을 제공 하 고 실험실 식민지를 설치 하는 계란의 출하에 대 한 박사 웨이드 프랑스어 (미국 농 무부-ARS, 북쪽 중앙 농업 연구소, 브루킹스, SD) 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
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