Summary
Hier presenteren we protocollen voor het verzamelen en microinjecting precellular westelijke maïs rootworm embryo's bestemd voor de uitoefening van functionele-genomic assays zoals germline transformatie en CRISPR/Cas9-genoom bewerken.
Abstract
De westerse maïswortelboorder (WCR) is een belangrijke plaag van maïs en staat bekend om zijn vermogen om snel aanpassen aan de pest beheersstrategieën. RNA-interferentie (RNAi) is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie van de WCR gebleken, heeft maar zijn beperkingen. Specifiek, RNAi zelf voorbijgaande aard is (d.w.z. niet leidt tot een langdurige Mendelian inheritance van het bijbehorende fenotype), en het vereist de opeenvolging van DNA van het doel-gen weten. De laatste kan worden beperkt als het fenotype van belang wordt gecontroleerd door slecht bewaard gebleven, of zelfs nieuwe genen, omdat identificeren nuttige doelen zou worden uitdagend, zo niet onmogelijk. Dus, het aantal gereedschappen in de WCR genomic gereedschapset moet worden uitgebreid door de ontwikkeling van methoden die gebruikt kunnen worden maken van stabiele gemuteerde stammen en schakelen sequence-onafhankelijke onderzoeken van de WCR-genoom. Hierin, detailleren wij de methoden voor het verzamelen en microinject van de precellular WCR embryo's met nucleic zuren. Terwijl de hierin beschreven protocollen zijn gericht op het creëren van transgene WCR, kan CRISPR/Cas9-genoom bewerken ook worden uitgevoerd met behulp van dezelfde protocollen, met het enige verschil is de samenstelling van de oplossing die is geïnjecteerd in de embryo's.
Introduction
Westerse maïswortelboorder (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, is een belangrijke plaag van maïs1. Interessant, WCR lijkt te overwinnen van de controle maatregelen sneller dan meest agrarische plagen omdat ze niet alleen fysiologisch maar ook gedragsgestoorde2,3,4,5, passen 6. het afgelopen decennium, RNA-interferentie (RNAi), een krachtige functioneel genomisch tool, heeft onderzocht als een potentiële beheermethode voor WCR7,8, en is ook gebruikt als een middel om te studeren gene functie9. Terwijl RNAi wordt vaak uitgevoerd door microinjection van double-stranded RNA (dsRNA) bij andere diersoorten, is injectie gebaseerde RNAi echter zeldzaam in WCR. In feite zijn er slechts enkele rapporten van RNAi via microinjection van dsRNA in WCR9. De reden is dat WCR hoge niveaus van gene vechtpartij via ingestie van dsRNA7,10 bereiken kan, zelfs het toelaat van de studie van embryonale effecten door dsRNA vervoederen aan de moeder11. Terwijl deze methode WCR een uitstekend onderwerp voor functionele genoom analyse via RNAi maakt, is het vooruitgang op de ontwikkeling van methodologieën voor embryonale microinjection in deze soort vertraagd.
Ondanks de kracht van RNAi zijn er een paar nadelen. Niet alle genen reageren bijvoorbeeld even op RNAi. Deze variabiliteit kunnen interpreteren van de resultaten van een functionele genomica assay moeilijker. Ook RNAi voorbijgaande aard is en genereert geen erfelijke mutaties. Aan de andere kant, kan germline transformatie, een ander functioneel genomisch hulpmiddel, erfelijke mutaties via het invoegen van een gemarkeerde transposons element in het genoom12,13genereren. Dit maakt germline transformatie een uitstekend hulpmiddel voor het maken van gemuteerde stammen voor gebruik in genetische langetermijnstudies. Transformatie kan ook worden gebruikt om te redden van een mutatie door het leveren van een functionele kopie van het gen tot een mutant genoom14. Bovendien is germline transformatie de hoeksteen van een grote verscheidenheid van moleculaire genetische technieken. Naast uitsparen en/of redden van de genfunctie, kan germline transformatie worden gebruikt voor enhancer overlapping15, gene overlapping16, ectopische expressie Gal4 gebaseerde17en genoom-brede mutagenese18.
Meer recentelijk, gereedschappen waarmee geavanceerde genoom bewerken zijn ontwikkeld. Deze tools omvatten transcriptie Activator-Like Effector nucleasen (TALEN) en de CRISPR/Cas9-nuclease systeem19,20. Het voordeel van deze nieuwe instrumenten is dat ze onderzoekers de mogelijkheid bieden voor het opwekken van een double-stranded DNA pauze op bijna elke plek binnen bijna elke genoom. Zodra geïnduceerde, deze onderbrekingen kunnen worden gerepareerd via niet-homologe weerszijden toe te treden, die kan introduceren verwijderingen of inserties in het beoogde gen, of via homologie geleide reparatie, die in het bijzijn van een gemodificeerde constructie, kan katalyseren de vervanging van de gehele genen of de genetische gebieden21,22. Echter, deze methoden vereisen microinjection van DNA, RNA en/of eiwit in zeer jonge embryo's.
Nog belangrijker is, in tegenstelling tot de dsRNAs gebruikt voor RNAi, nucleïnezuren en proteïnen gebruikt voor germline kruisen transformatie en genoom bewerken niet gemakkelijk celmembranen. Daarom, microinjection van de ANI van de plasmide, mRNAs, en/of eiwitten moet plaatsvinden tijdens de syncytieel blastoderm fase (dat wil zeggen voordat het insect embryo cellularizes). Dit maakt de timing van injecties een kritieke factor. Bijvoorbeeld bij Drosophila melanogastermoeten embryo's binnen twee uur na ei12 leggenworden geïnjecteerd. Daarom moet de ontwikkeling van een succesvolle embryonale microinjection protocol voor WCR rekening houden met de beste voorwaarden voor vrouwelijke leggen van eieren, evenals de beste methode voor het verzamelen van voldoende hoeveelheden van precellular embryo's.
Een poging om een breed scala aan moleculaire genetische hulpmiddelen te oefenen op WCR biologie vereist de ontwikkeling van methoden voor het verzamelen en microinjecting van de precellular WCR embryo's. Hier voorzien wij gedetailleerde instructies, samen met tips en trucs, om anderen transformatie gebaseerde technieken gebruiken in WCR onderzoek te helpen. Naast uitbreiding van transgene technologieën tot WCR voor gebruik in functionele genomic studies, deze technieken ook in staat stellen krachtige nieuwe pest controlestrategieën zoals gen station23,24 te worden getest in dit economisch belangrijke Pest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kolonie-niveau fokken van WCR volwassenen
- Verkrijgen van een voldoende hoeveelheid WCR volwassenen (500-1000) van een betrouwbare bedrijf of research laboratory (Zie Tabel van materialen voor een voorbeeld) en in een kooi van 30 cm3 plaatsen.
Opmerking: Gebruik van een niet-diapausing-stam wordt sterk aanbevolen. - Bereiden van kunstmatige voeding WCR volgens protocol van de fabrikant en giet een 1 cm dikke laag in een 38 oz-container (Zie Tabel van materialen). Na het mengen, opslaan van ongebruikte dieet bij 4 ° C voor maximaal 2 maanden.
- Zet een petrischaal (100 x 15 mm) met volwassen dieet (10-15 g) in een 30 cm3 kooi. Voeg meer dieet als het eten lage of droog is.
- Zet een kolf (300 mL) met water, bedekt met een katoenen bal, die wordt gebruikt om het op zijn plaats houden een katoen-roll (6 "x 3/8"), om te dienen als een waterbron. Het water veranderen wanneer het draait laag.
- WCR bij 26 ° C met 60% vochtigheid te handhaven en een 14:10-lichte fietsen in een insect fokken incubator.
2. de embryo's worden verzameld en uitlijning
- Maak een ei inzamelingskamer 1% agar in water met een steriel 100 x 15 mm2 petrischaal. Bewaren bij 4 ° C na de agar stolt.
- Nieuw vastgestelde eieren te verzamelen, plaats een enkellaags filtreerpapier, gevolgd door 4 lagen van kaasdoek (elke cut formaat) op het oppervlak van de agar (figuur 1A).
Opmerking: Kaasdoek kan worden hergebruikt, nadat hij gewassen in bleekmiddel en gesteriliseerde met autoclaaf, maar het is niet nodig om dit te doen voor het eerste gebruik. Filtreerpapier mogen niet worden hergebruikt en hoeft niet te worden gesteriliseerd. - Plaats van ei collectie plaat in WCR kooi zo laat in de dag mogelijk (einde van de werkdag) en bedek met een zilverpapier tent. Laat 's nachts.
Opmerking: Met de lichten op van 10.00 tot 12 uur (14u) vertragingen ei leggen, waardoor de collectie van jongere eieren voor microinjection zonder lab personeel inzamelingskamer in kooi 's avonds laat plaatsen. - Verwijder de inzamelingskamer ei rond de 8 of 9 uur
- Gebruik pincet te halen 1 laag kaasdoek op een tijd en plaats in een bekerglas (500 mL) water. Het wassen van eieren af kaasdoek door zachtjes roeren (figuur 1B en 1 C).
- Gebruik een pipet lamp eieren overbrengen naar een andere bekerglas (500 mL) water. Herhaal 2-3 x om de eieren schoon te maken.
- Gebruik de pipet lamp overdracht van eieren op filterpapier (Figuur 1 d) terwijl het minimaliseren van de hoeveelheid water "Carry-over".
- Zwarte filtreerpapier snijd in reepjes zo breed als een glasplaatje en de tape stevig aan de dia om te controleren of legt het papier plat (figuur 2A).
Opmerking: Zwarte filtreerpapier verbetert zichtbaarheid onder de Microscoop door het verminderen van de hoeveelheid gereflecteerd licht. - Niet-toxisch lijmen (Zie Tabel van materialen voor een voorbeeld) om het koffiefilter in fijne lijntjes (figuur 2B). Houd de lijm lijnen dunner beeldscherm mogelijk dan de diameter van een ei te voorkomen dat je de eieren bedekt met lijm.
- Gebruik een fijne borstel zachtjes overstappen WCR eieren één voor één hun filtreerpapier op de lijn van de lijm. Probeer de om eieren te leggen op de lijm voordat het droogt uit en houden van ten minste één ei de afstand tussen elk ei.
- Injectie efficiëntie maximaliseren door het plaatsen van meerdere tekstregels eieren op een filtreerpapier dia (Figuur 3).
- Nadat alle eieren zijn neergelegd op het filtreerpapier, wacht u totdat alle de lijm voordat microinjection droogt.
Opmerking: Voor germline transformatie en voor CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerken, injecteren alle embryo's tegen de middag (12 uur) zodat de oudste embryo niet meer dan 19 uur oud is. Voor RNAi is er echter geen tijdslimiet omdat, in WCR, dsRNA kan verplaatsen tussen cellen. In feite, voor RNAi, zou kunnen veroudering embryo's resulteren in betere overlevingskans van de patiënt.
3. voorbereiding van de ANI van de plasmide en injectie naalden
- Bereiden van kwalitatief hoogwaardige supercoiled plasmide DNA met behulp van een endotoxine-vrije commerciële kit (Zie Tabel van materialen voor een voorbeeld).
- Ter voorbereiding van de oplossing voor injectie, de concentratie van elke plasmide controleren en deze vervolgens combineren helper plasmide (eindconcentratie is 250 ng/µL), donor plasmide (eindconcentratie is 750 ng/µL) en fenol red buffer (20% eindconcentratie). Vortex de oplossing kort en Centrifugeer gedurende 3 minuten op maximale snelheid te precipiteren deeltjes die de naald verstoppen kunnen.
- Trekken van borosilicaatglas naalden (od 1 mm, I.D. 0.58 mm, lengte 10 cm) met een trekker van de micropipet van het type van Flaming/bruin. Voor opslag, veilige getrokken naalden op dubbelzijdige plakband in een petrischaal of andere duidelijke container.
Opmerking: Voor de micropipet trekker systeem, de instellingen die worden gebruikt zijn: warmte = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Aanvulling funderingsput de naald van de injectie met behulp van een micro-loader tip (Zie Tabel van materialen) Pipetteer 0,5 - 1,0 µL neer binnen de naald, in de buurt van het tapse einde. Bubbels uit het topje van de naald verwijderen als een optreedt.
- Plaats de injectie naald in de kaarthouder van de naald.
- Open het puntje van de naald door zachtjes breken met een fijn paar pincet, of zachtjes raken/te slepen de tip op de dia dekglaasje aan of glas.
Opmerking: Het doel is om de kleinste opening waarmee nog de mix van de injectie te komen (kleinere openingen in het algemeen vereisen hogere druk van de injectie). Schuine naalden nodig niet deze stap omdat ze al open.
4. microinjection en na injectie zorg
- Met behulp van een fijn penseel, zorgvuldig nat van het oppervlak van 1-3 eieren met steriel water, invoegen de naald en het injecteren van de oplossing. Injecteren elk ei voordat het oppervlak droogt. Kijk voor de verschijning een kleine hoeveelheid rood in eieren tijdens injectie om aan te geven van de succesvolle microinjection. Crush of verwijderen van alle eieren die kijken beschadigd, leeg, of anders niet kunnen worden geïnjecteerd.
Opmerking: Hoewel injectie druk op basis van boring breinaalden varieert, 10-13 psi is een goed uitgangspunt. - Nadat alle eieren worden geïnjecteerd, verwijder het koffiefilter uit het glasplaatje.
- Breng het filter op het oppervlak van een 1% agar schotel (zie hierboven).
- Gebruik plastic paraffine film te verzegelen van de schotel, en in een insect van de 26 ° C incubator fokken voor 12 dagen.
Opmerking: De paraffine film voorkomt kruisbesmetting van schimmel tussen gerechten. Iedere andere behandeling om te voorkomen dat schimmel en bacteriële groei kan echter het voortbestaan van de geïnjecteerde embryo's verminderen.
5. het kweken en broedeieren van embryo 's
- Starten van de controle van embryo's twaalf dagen na injectie voor de pas uitgekomen larven en blijven dagelijks voor de komende 2 weken.
- Overdracht van larven, met een fijne borstel, met een steigerend doos met gekiemde maïs en de bodem.
Opmerking: Schimmel kan groeien in de agar schotel, maar larven nog steeds in de meeste gevallen zal uitkomen. Kijk voor larven zorgvuldig binnen de mal om ze alle te vangen. Sommige larven kunnen bewegen om het deksel van de schotel en zou komen te zitten in de condensatie. - Larven bij 26 ° C na standaard WCR fokken methoden25aan de achterkant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een belangrijke overweging bij het ontwikkelen van dit protocol werd het stadium van de embryonale ontwikkeling ten tijde van microinjection. In het bijzonder vereist germline omzetting microinjection van ANI voorafgaand aan embryonale cellularization. Dit is omdat het DNAS-systeem niet gemakkelijk kruisen celmembranen. Pogingen om te visualiseren van de stadia van embryonale ontwikkeling WCR met behulp van een nucleaire vlek mislukten omdat dechorionation van WCR embryo's in wezen alle van de beschermende membranen die verantwoordelijk is voor de integriteit van het embryo oplost. Echter, deze lijn van onderzoek werd verdrongen door een ander probleem-het verwerven van voldoende hoeveelheden van embryo's in een tijdige wijze. In het veld WCR vrouwtjes leggen hun eieren in de bodem, dus het mag niet verbazen dat in het lab, vrouwtjes alleen eieren in het donker leggen. Dit bemoeilijkt korte overdag collecties (2-4 h). Om dit probleem te overwinnen, een enkele overnachting ei lay werd uitgevoerd en werd gevonden voor het opbrengen van grote hoeveelheden van embryo's. Hoewel het proces van het verzamelen van (Figuur 1) en (afbeelding 2) embryo's voor microinjection indelen enigszins moeizaam is, als snel gedaan kunnen dit protocol microinjection van embryo's die zich tussen 2-19 h oud op het moment van injectie, en Nee ouder zijn dan 24 h als injecties worden uitgevoerd later op de dag. Vergelijking van ontwikkelingstijd tussen WCR en andere soorten suggereert dat WCR embryo's nog precellular op 24 h post ei leggen worden moeten (zie discussie).
De eerste pogingen tot germline transformatie van WCR betrokken co injectie (Figuur 3) van helper (Bron: transposase) en donor (transposon) plasmiden in precellular embryo's. De markering van de transformatie voor de donor plasmide was een gen van de groen fluorescente proteïne (EGFP) aangedreven door een constitutively actieve promotor van Tribolium castaneum (alpha-tubuline promotor26). Embryonale overlevingscijfers waren laag (tabel 1), maar 26 G0 volwassenen werden teruggevonden. Om te bepalen als het donor-element ingevoegd in elk kiemcellen, G1 embryo's werden onderzocht op de expressie van EGFP. Hoewel fluorescerende nakomelingen waren inderdaad aangetroffen (Figuur 4), screening van WCR embryo's met de intense lichtbron bleek dodelijk27. De volgende ronde van germline transformatie gebruikt een nieuwe plasmide van de donor, een bezitten een rode fluorescerende eiwit (DsRed) gen, aangedreven door een constitutively actieve promotor van Drosophila melanogaster (heat shock protein 70 promotor28 ). Terwijl de overlevingskans van de patiënt waren dat veel verbeterd (tabel 1), de overlevende volwassenen alleen geproduceerd een enkele DsRed-positieve larve (Figuur 5). Deze experimenten waren echter in twee opzichten bijzonder informatief. Eerst, werd ontdekt dat microinjection veroorzaakt vertragingen in de ontwikkeling, wat resulteert in een langere tijd-aan-hatch. In plaats van alle embryo's broedeieren binnen 2 weken, uitgebroed ingespoten embryo's tussen 12 en 26 dagen post microinjection, waarvoor derhalve een uitgebreide periode voor congestiecontrole om ervoor te zorgen dat alle hatchlings werden verzameld. Ten tweede, er werd gemerkt dat pas uitgekomen larven tamelijk actief waren. Ze kroop op het deksel waar ze zou krijgen vast, en soms ontsnapt uit de agar schotel. Deze kwesties werden overwonnen door afdichten petrischaaltjes met een paraffine-film en deksels en agar zorgvuldig voor hatchlings te onderzoeken.
De definitieve versie van dit protocol injectie werd getest door microinjecting WCR embryo's met buffer alleen, of helper en oog-promotor (3xP329) gemarkeerd donor DNA-plasmiden. Als een extra controle, een andere set van embryo's identiek waren behandeld, maar waren niet microinjected. Vier sets van embryo's werden ingespoten met een oplossing voor injectie. Een totaal van 485 embryo's werden ingespoten met buffer en die, 148 uitgekomen (hatch tarief = 30.5%, tabel 1). Van 1.450 embryo's geïnjecteerd met plasmide Ani, 289 uitgekomen (tarief = 26,8%). Interessant is dat van de 470 embryo's die onderging dezelfde ei aangestuurde voorwaarden, maar zonder microinjection, slechts 250 uitgekomen (tarief = 53,2%). Dat de overlevingskansen van uninjected embryo's 20% hoger dan de overlevingskans van de patiënt voor ingespoten embryo's is naar verwachting als gevolg van de onvermijdelijke schade veroorzaakt door microinjection. Echter weinig verschil tussen buffer injectie en DNA injectie, hetgeen suggereert de hoeveelheid DNA wordt toegevoegd is aanvaardbaar voor WCR wordt gezien (zie discussie). Deze resultaten tonen ook aan dat de overlevingskans van de patiënt in eerdere pogingen verbeterd. Succesvolle invoering van transgene lijnen met behulp van deze methode is gemeld elders27.
Figuur 1: ei collectie. A) ei inzamelingskamer. B) Zoomed-in weergave van een gedeelte van een ei kamer na 24u ei leggen. Opmerking, pijlen geven de locatie van een paar eieren. C) wassen van eieren uit kaasdoek. D) de definitieve overdracht van WCR eieren. Opmerking, beugel geeft de regio met dicht opeen gepakte WCR embryo's (dat wil zeggen minimaal water). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: voorbereiding van de dia van een injectie. A) zwart filter papier geplakt is strak aan een standaard microscoopglaasje. B) Zoomed-in weergave van een gedeelte van een injectie glijden tijdens het voorbereidingsproces. Opmerking, #1 pijl geeft de locatie van een rij van eieren, #2 gedeeltelijke lijn van lijm en #3 de pin gebruikt om te verspreiden van de lijm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: injecteren van embryo's. De dia van een injectie met acht rijen van eieren. Als gevolg van de hoek van de injectie naald, kunnen opeenvolgende rijen van embryo's worden geïnjecteerd door gewoon het podium te bewegen. Opmerking de rode kleurstof in de injectie naald aids sterk visualisatie van de injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Transgene G1 embryo. Embryo's uit een WCR volwassene die mede ingespoten met piggyBac was-op basis van helper en donor plasmiden als een vroege embryo. De helder groene embryo is positief voor verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) expressie, terwijl de anderen niet. Expressie van EGFP wordt aangedreven door de Tribolium castaneum alpha-tubuline promotor26. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Transgene G1 larve. 3e-instar-larven waarvan de bovenliggende mede ingespoten met piggyBac was-op basis van helper en donor plasmiden als een vroege embryo. De larve van de rood gloeiende aan de linkerkant is positief voor de expressie van de DsRed, terwijl de larve aan de rechterkant niet is. DsRed expressie wordt gedreven door de Drosophila melanogaster warmte schok 70 promotor28. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Experiment | Behandeling | Eieren | Gearceerde | Hatch tarief |
| Exp. #1 | ΑtubEGFP-donor | 910 | 57 | 6.3% |
| Exp. #2 | hsp70DsRed-donor | 1580 | 211 | 13,4% |
| Exp. #3 | 3xP3EGFP-donor | 1450 | 389 | 26,8% |
| Buffer | 485 | 148 | 30,5% | |
| No-injectie | 470 | 250 | 53,2% |
Tabel 1: gegevens van Microinjection. Vanaf drie microinjection experimenten op WCR embryo's, toont het totale aantal eieren geïnjecteerd en het totale aantal larven die met succes uitgebroed het broedsel tarief uitkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel microinjection van WCR met dsRNAs met het oog op RNAi gerapporteerde9, dit is het eerste protocol bij het vaststellen van beste praktijken voor het microinjecting van de precellular WCR embryo's, een kritische proces voor het uitvoeren van germline transformatie en/of CRISPR/Cas9 genoom bewerken in deze soort. Succesvolle microinjection van WCR embryo's is afhankelijk van vele factoren, zoals transformatie efficiëntie. Hieronder besproken zijn enkele van de belangrijke kwesties invloed op het resultaat van het gebruik van dit protocol voor germline transformatie in deze kever.
Verkrijgen van precellular embryo 's
Zoals hierboven vermeld, doet DNA celmembranen die de manier dsRNA kan niet overschrijden. Dit betekent dat het van cruciaal belang dat DNA, mRNA en/of eiwitten worden geïnjecteerd voordat cellularization optreedt. Omdat de timing van de injectie is van cruciaal belang, was het belangrijk om te bepalen een waarschijnlijk venster voor succesvolle microinjection gebaseerd op hoe lang de nondiapausing WCR stam30 duurt te voltooien embryogenese. Dit werd berekend op basis van gedetailleerde studies van de timing van het werkgebied syncytieel blastoderm in een andere kever, Tribolium castaneum. In Triboliumkomt cellularization ~ 8 h post ei leggen op 30 ° C31. Aangezien het duurt ~3.5 dagen voor Tribolium volledige embryogenese bij 30 ° C, plaatsvindt cellularization een tiende van de weg in het proces. Aangezien WCR embryo's bijna 2 weken nemen te ontwikkelen, kan de cellularization niet optreden totdat de tweede dag post ei leggen. Daarom werd aangenomen dat het venster voor succesvolle microinjection ten minste 24 uur lang, dat handig is, is omdat WCR nodig 's nachts ei leggen om te voorzien in voldoende hoeveelheden eieren microinjection. Hoewel deze methode werd gebruikt voor succesvolle Transgenese27, is het denkbaar dat resultaten kunnen worden verbeterd door het injecteren van jongere embryo's, mits behandeling zeer vroege embryo's niet hen schade veroorzaken.
DNA kwaliteit en concentratie
Het is niet verwonderlijk dat DNA concentratie een cruciale rol in de succesvolle transformatie speelt. Het is lang gedacht dat het houden van de uiteindelijke concentratie van plasmide DNA lager dan 1 mg/mL nodig was om te voorkomen dat potentiële toxiciteit voor de ingespoten embryo's32. Hoewel het is nu onduidelijk als de toxiciteit problemen uit het verleden te wijten aan het DNA zelf waren of in plaats daarvan het gevolg waren van verontreinigingen uit het plasmide zuiveringsproces overgedragen, deze vuistregel standvastig is vasthouden aan voor twee decennia. Echter ontdekt we onlangs dat meer dan de 1 mg/mL limiet was niet alleen mogelijk, maar ook dat doet kan bereiken hogere tarieven van de transformatie, wat leidt tot speculatie dat de afwezigheid van ei toxiciteit veroorzaakt door de vooruitgang in de uitrustingen van de reiniging van de plasmide worden kan, wat resulteert in minder verontreinigende stoffen. Gezien de tijd die nodig aan achterzijde WCR, is een stijging van de tarieven van de transformatie nuttig, zelfs als het resulteert in een iets hogere sterftecijfers.
Verzachtende ei oppervlak voordat microinjection
In tegenstelling tot Tribolium, moet het oppervlak van de buitenste-meeste (chorion) van een embryo WCR voordat microinjection worden afgezwakt. Dit is een cruciale stap, zelfs bij het gebruik van kwarts naalden. Idealiter, water moet worden toegepast op een enkel embryo onmiddellijk vóór injectie, maar kan worden toegepast op groepen van 2 tot en met 3 embryo's op een moment als microinjection voordat chorions reharden kan worden bereikt. Zonder deze stap zal naalden in het algemeen niet te dringen de chorion, waardoor de poging van de injectie te mislukken, en potentieel schadelijk het puntje van de naald. Bovendien, als de naald gebeurt te penetreren met succes een droge chorion, de injectie oplossing meestal lekt terug als gevolg van de druk binnen het embryo wordt hoger dan de omgevingsdruk. Het is echter eenvoudig te onderscheiden droog uit natte (onthard) embryo's. In het bijzonder wanneer droog, embryo's hebben een verschillende bakwagen, ronde vorm, terwijl de toevoeging van water hen te verliezen hun sferische verschijning veroorzaakt. Ontharden kunt niet alleen de naald te gemakkelijk penetreren de chorion maar vermindert ook de druk binnen het embryo genoeg dat de oplossing van de injectie doet niet uitlekken.
Vocht en schimmel
In een warme, vochtige omgeving tijdens de embryogenese worden ingespoten embryo's gehouden. Deze voorwaarden bieden niet alleen de perfecte omgeving voor WCR ontwikkeling maar ook de bevordering van de groei van de schimmel. Tijdens deze periode van twee weken groeit schimmel vaak op de gerechten van de agar huisvesting de WCR-embryo's. Helaas, de embryo's vereisen hoge luchtvochtigheid, en pogingen om het te verminderen resulteerde in veel lagere hatch. Interessant is dat de aanwezigheid van schimmel in het algemeen weinig impact gehad op gearceerde tarieven, met meeste embryo's broedeieren zonder problemen. Bovendien zijn antifungale behandelingen schadelijk voor WCR embryo's, dus de beste manier om schimmel groei lijkt te zijn om besmetting te voorkomen; schoonmaken van gereedschappen, recipiënten, en microinjection systeem vóór gebruik, en proberen te houden van de tijd doorgebracht microinjecting tot een minimum beperkt aangezien de schimmel sporen heersen veel laboratorium omgevingen.
Conclusies
Dit protocol is bedoeld om meer onderzoekers transgene technologieën in hun onderzoek WCR in dienst en zal hopelijk steun in de ontwikkeling van aanvullende transgenics gebaseerde technologieën voor gebruik in dit insect. Verfijnde transgenics gebaseerde experimenten uitgevoerd in Tribolium konden potentieel worden aangepast voor WCR, met inbegrip van de mutagenese33 en CRISPR gebaseerde genoom34bewerken. Omdat deze technieken microinjection van precellular embryo's vereisen, zullen dit protocol niet alleen nuttig voor transposon gebaseerde functioneel genomisch studies en/of CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerken maar ook voor de genetica gebaseerde pest beheersstrategieën 35 , 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Monsanto mais Rootworm kennis Research Program, nummer AG/1005 (aan MDL en YC) en start-up middelen verlenen aan MDL van NCSU. FC werd gesteund door subsidies van Monsanto's maïs Rootworm kennis Research Program (AG/1005) en de National Science Foundation, toekennen nummer MCB-1244772 (MDL). De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. FC en MDL bedacht en ontworpen van de experimenten; FC, PW en SP uitgevoerd de experimenten; FC en MDL geanalyseerd de resultaten; en FC, NG en MDL schreef het manuscript. Wij danken Teresa O'Leary en William Klobasa Stephanie Gorski voor hun deskundige hulp bij bevolkingsonderzoek WCR. Wij danken ook Dr. Wade French (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) voor de overbrenging van eieren lab kolonies en verstrekken van fokken protocollen vast te stellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).
- Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
- Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
- Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
- Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
- Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
- Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
- Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162 (2010).
- Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
- Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
- Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
- Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
- O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
- Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Jeggo, P. A.
- Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
- Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
- Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
- Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
- Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
- Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
- Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
- Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
- Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11 (2007).
- Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).
