Summary
Здесь мы представляем протоколы для сбора и microinjecting precellular Западный кукурузный rootworm эмбрионов для целей выполнения функциональных геномной анализы как микрофлорой преобразования и редактирования ТРИФОСФАТЫ/Cas9-генома.
Abstract
Rootworm Западный кукурузный (WCR) является важным вредителей кукурузы и хорошо известна своей способностью быстро приспосабливаться к стратегиям управления вредителей. Хотя система РНК-интерференции (RNAi) оказалась мощным инструментом для изучения биологии WCR, он имеет свои ограничения. Конкретно, РНК-интерференции, сам является несохраняемым(т.е. не привести к долгосрочной Менделевское наследование связанных фенотип), и он требует, зная последовательность ДНК гена целевого объекта. Последний может иметь ограничения если фенотип интерес контролируется плохо сохраняется, или даже Роман генов, потому что будет сложной задачей выявления полезной цели, если не невозможно. Таким образом количество инструментов WCR в геномной панели инструментов должен быть расширен путем разработки методов, которые могут быть использованы для создания стабильной мутантных штаммов и включения последовательности независимые обследования WCR генома. Здесь мы подробно методы, используемые для сбора и microinject precellular WCR эмбрионов с нуклеиновыми кислотами. В то время как протоколы, описанные здесь, направлены на создание трансгенных WCR, ТРИФОСФАТЫ/Cas9-геном редактирования может также быть выполнена с использованием тех же протоколов, с той лишь разницей, что состав раствора вводят в эмбрионы.
Introduction
Западный кукурузный rootworm (WCR), под эгидой эгидой, является важным вредитель кукурузы1. Интересно, что, как представляется, преодолеть управления WCR меры более быстрыми темпами, чем большинство сельскохозяйственных вредителей, поскольку они не только адаптировать физиологически, но и поведенчески2,3,4,5, 6. за последнее десятилетие, РНК-интерференции (RNAi), мощный функциональный геномной инструмент, исследована как потенциальный метод управления WCR7,8и также был использован как средство для изучения функции гена9. Однако хотя интерференции часто производится путем микроинъекции двуцепочечной РНК (dsRNA) в других видов, РНК-интерференции на основе инъекций встречается редко в ВЦС. В самом деле есть лишь несколько сообщений о RNAi через микроинъекции двуцепочечной ДНК в ВЦС9. Причина что WCR может достичь высокого уровня генов нокдаун через проглатывание dsRNA7,10, даже позволяя исследования эмбриональных эффекты кормления двуцепочечной ДНК матери11. Хотя этот метод делает WCR отличная тема для функционального геномного анализа через РНК-интерференции, он замедлился прогресс в разработке методологий для эмбриональных микроинъекции в этот вид.
Несмотря на мощь интерференции есть несколько недостатков. Например не все гены одинаково реагировать на РНК-интерференции. Эта изменчивость может сделать интерпретации результатов функциональной геномики пробирного сложнее. Кроме того РНК-интерференции является временным и не создавать наследственные мутации. С другой стороны микрофлорой трансформации, другой функциональной геномной инструмент, может генерировать наследственные мутации через вставки элемента заметно транспонированная в геном,12-13. Это делает преобразование микрофлорой отличным инструментом для создания мутантных штаммов для использования в долгосрочных генетических исследований. Преобразование может также использоваться для спасения мутация, обеспечивая функциональную копию гена мутант генома14. Кроме того преобразование микрофлорой является краеугольным камнем широкий спектр молекулярно-генетических методов. Помимо выбивания и/или спасать функции гена, микрофлорой преобразование может использоваться для enhancer треппинга15, Джин треппинга16, на основе Gal4 внематочная выражение17и генома общесистемной мутагенеза18.
Совсем недавно были разработаны инструменты, которые позволяют редактирования сложных генома. Эти инструменты включают транскрипции Activator-Like эффектор Nucleases (TALEN) и ТРИФОСФАТЫ/Cas9-нуклеиназы системы19,20. Преимуществом этих новых инструментов является, что они предлагают исследователям возможность побудить двуцепочечной ДНК перерыв в практически в любом месте в течение почти любой генома. После индуцированного, эти перерывы могут быть отремонтированы, не гомологичных концах прихода, который можно ввести, удаления или вставки в целевых генов, или через ориентированные на гомологии ремонт, который в присутствии инженерных конструкции, могут катализировать Замена всего генов или генетических регионах21,22. Однако эти методы требуют микроинъекции ДНК, РНК и белков в очень молодых эмбрионов.
Важно отметить, что в отличие от двуцепочечных РНК, используемые для RNAi, нуклеиновых кислот и белков, используемые для микрофлорой преобразования и изменения генома не может пересекать легко клеточных мембран. Таким образом микроинъекции плазмида ДНК, мРНК и/или белки должны осуществляться на этапе-синцитиальный бластодермы (т.е. до cellularizes насекомых эмбриона). Это делает время инъекции решающим фактором. Например в Drosophila melanogaster, эмбрионы должны вводиться в течение двух часов после того, как яйца откладывают12. Таким образом Разработка успешной эмбриональных микроинъекции протокола для WCR должны учитывать наилучшие условия для женщин яиц, а также лучший метод для сбора достаточного количества precellular эмбрионов.
Попытка привлечь широкий спектр молекулярных генетических инструменты на WCR биологии требует разработка методов для сбора и microinjecting precellular WCR эмбрионов. Здесь мы предоставляем подробные инструкции, наряду с советы и уловки, чтобы помочь другим использовать методы на основе преобразования в ВЦС исследования. Помимо предоставления WCR трансгенные технологии для использования в функциональных геномных исследований, эти методы также позволяют мощных новых стратегий управления вредителей как ген диск23,24 должны быть опробованы в этом экономически важных Пешт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. колонии уровень воспитания WCR взрослых
- Получить достаточное количество WCR взрослых (500-1000) от надежной компании или научно-исследовательских лаборатории (см. Таблицу материалов для примера) и место в клетке3 30 см.
Примечание: Настоятельно рекомендуется использовать не diapausing штамма. - Подготовить WCR искусственные диеты после производителя протокол и налить слоем 1 см толщиной в 38 oz контейнер (см. Таблицу материалы). После смешивания, Храните неиспользованные диета при температуре 4 ° C на срок до 2 месяцев.
- Поместите чашку Петри (100 x 15 мм) с Взрослый диета (10-15 g) в клетке3 30 см. Добавьте больше диеты, когда еда низким или сухой.
- Поставьте колбу (300 мл) с водой, покрытые ватный шарик, который используется для хранения на месте рулоне хлопок (6 "x 3/8"), чтобы служить в качестве источника воды. Меняйте воду, когда она не хватает.
- В насекомое воспитания инкубатор поддерживать WCR на 26 ° C при влажности воздуха 60% и свет 14:10.
2. эмбриона коллекции и выравнивание
- Сделайте яйцо коллекции камеру, с использованием 1% агар в воде в стерильных 100 x 15 мм2 Петри. Хранить при 4 ° C, после того, как агар затвердевает.
- Чтобы собрать недавно установленными яйца, место одного слоя фильтровальной бумаги, а затем 4 слоя Марли (каждого разреза на размер) на поверхности агара (Рисунок 1A).
Примечание: Марлю может быть повторно, после того, как мыть отбеливателя и газобетона, но это не нужно делать это для первого использования. Фильтр бумага не должна быть повторно и не нужно стерилизовать. - Место коллекции плита яйцо в клетке WCR в в конце дня как можно скорее (конец рабочего дня) и накрыть фольги палатку. Оставьте на ночь.
Примечание: Имея огни на 10: 00 до 12: 00 (14 ч) задержки откладки яиц, способствуя коллекции молодых яиц для микроинъекции без необходимости персонал лаборатории для место коллекции камеру в клетке поздно ночью. - Снимите камеру сбора яиц около 8 или 9 часов.
- Используйте пинцет, чтобы забрать 1 слой марли на время и место в стакан (500 мл) воды. Мыть яйца офф марлю, осторожно помешивая (рис. 1B и 1 C).
- Используйте лампы пипетки для передачи яйца в другой стакан (500 мл) воды. Повторяйте 2-3 x очистить яйца.
- Используйте лампы пипетку для передачи яйца на фильтровальную бумагу (рис. 1 d) при сведении к минимуму количество воды переноса.
- Вырезать черный фильтровальную бумагу на полоски шириной ленты и стекла слайд твердо на слайд, чтобы убедиться, документ закладывает плоский (рисунок 2A).
Примечание: Черный фильтр бумага помогает улучшить видимость под микроскопом, снижая количество отраженного света. - Применить нетоксичный клей (см. Таблицу материалов для примера) на фильтровальную бумагу в тонких линий (рис. 2B). Храните клей линии тоньше, чем диаметр яйца, чтобы избежать попадания яйца, покрытая клеем.
- Используйте осторожно двигаться WCR яйца по одному из их фильтр-бумаги к линии клей тонкой кистью. Попробуйте положить яйца на клею, прежде чем оно высыхает и держать по крайней мере одно яйцо расстояние между каждой яйцо.
- Максимизировать эффективность инъекции, поместив несколько строк яиц на слайд один фильтр-бумаги (рис. 3).
- После того, как все яйца выкладываются на фильтровальной бумаге, подождите, пока все клей высохнет перед микроинъекции.
Примечание: Для преобразования микрофлорой и ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной генома редактирования, привнести все эмбрионы, полдень (12: 00) так, что старый эмбриона не более чем 19 h старый. Однако для RNAi, существует без ограничения времени, потому что в ВЦС, малым интерферирующим РНК могут перемещаться между ячейками. В самом деле для RNAi, старение эмбрионов может привести к лучшей выживаемости.
3. Подготовка плазмида ДНК и инъекций иглами
- Подготовить высокого качества supercoiled плазмида ДНК с помощью эндотоксинов свободный коммерческих комплект (см. Таблицу материалов для примера).
- Подготовить инъекционного раствора, проверьте концентрацию каждого плазмиды и затем объединить вспомогательные плазмида (250 нг/мкл конечная концентрация), доноров плазмида (750 нг/мкл конечная концентрация) и фенола Красного буфера (20% конечной концентрации). Вихревой решение кратко и центрифуги для 3 минуты на максимальной скорости, чтобы осадить частицы, которые могут засорить иглы.
- Тянуть боросиликатного стекла иглы (O.D. и.д. 0,58 мм, длина 10 см, 1 мм) с использованием съемник микропипеткой типа Flaming/коричневый. Для хранения безопасной вытащил иглы на двухсторонний скотч в чашке Петри или других очистить контейнер.
Примечание: Для системы съемник микропипеткой, параметры, используемые были: тепла = 335, FIL = 4, VEL = 40, дель = 200, пул = 100. - Засыпки инъекционной иглы с помощью микро погрузчик Совет (см. Таблицу материалы) для пипетки 0.5 - 1.0 мкл вниз внутри иглу, вблизи остроконечный конец. Удалите пузыри от кончика иглы при возникновении любого.
- Вставьте иглу в иглодержателя.
- Откройте кончик иглы нежно с парой тонкой щипцами, или нежно прикасаясь к/перетаскивания кончик на слайде coverslip или стекла.
Примечание: Цель должна иметь наименьшее отверстие, которое по-прежнему позволяет инъекции микс выйти (меньшие отверстия обычно требуется более высокое давление впрыска). Среза иглы не требуют этого шага, так как они уже открыты.
4. микроинъекции и впрыск Уход
- С помощью тонкой кистью, тщательно мокрой поверхности 1-3 яйца с стерильной водой, вставить иглу и внедрить решение. Придать каждое яйцо, прежде чем поверхность высыхает. Посмотрите на внешний вид небольшое количество красного цвета внутри яйца во время инъекции для обозначения успешного микроинъекции. Подавить или удалить все яйца, которые выглядят повреждения, пустой, или иным образом не может быть введен.
Примечание: Хотя давление впрыска зависит от размера отверстия иглой, 10-13 psi является хорошей отправной точкой. - После того, как все яйца вводят, удалите фильтр бумага из стеклянное скольжение.
- Поместите документ фильтр на поверхности агара 1% блюдо (описанные выше).
- Используйте пластиковые парафин фильм печать блюдо, и положить в 26 ° C насекомых, воспитание инкубатор на 12 дней.
Примечание: Парафин фильм поможет предотвратить перекрестное загрязнение плесень между блюдами. Однако любое другое лечение для предотвращения плесени и бактерий может уменьшить выживания вводят эмбрионов.
5. культивирование и инкубационные эмбрионов
- Начать проверку эмбрионов 12 дней после инъекции для недавно вылупившихся личинок и продолжают ежедневно в течение 2 нед.
- Переноса личинок, с помощью тонкой кистью, в воспитании коробку с проросшие зерна и почвы.
Примечание: Плесень может расти в агар блюдо, но в большинстве случаев по-прежнему вылупятся личинки. Ищите личинки тщательно в форму, чтобы поймать их всех. Некоторые личинки могут перейти к крышке блюдо и может застрять в конденсации. - Задние личинок на 26 ° C, после стандартных WCR воспитания методы25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Важным соображением при разработке этого протокола был стадии эмбрионального развития в то время микроинъекции. В частности преобразование микрофлорой требует микроинъекции НОО до эмбриональных cellularization. Это потому, что НОО не может пересекать легко клеточных мембран. Попытки визуализировать на этапах эмбрионального развития WCR с использованием ядерных пятно были неудачными, потому что dechorionation WCR эмбрионов по существу растворяет все защитные мембраны, ответственность за целостность эмбриона. Однако это направление расследования был заменены другой трудности – приобретение достаточного количества эмбрионов своевременно. В поле WCR самки откладывают яйца в почве, поэтому она должна быть не удивительно, что в лаборатории, самки только откладывают яйца в темноте. Это затрудняет коротких дневных коллекций (2-4 ч). Чтобы преодолеть эту проблему, один на ночь кладут яйцо была выполнена и нашли уступить большое количество эмбрионов. Хотя процесс сбора (рис. 1) и прокладки (рис. 2) эмбрионов для микроинъекции является довольно трудоемким, если сделано быстро этот протокол позволяет микроинъекции эмбрионов, которые находятся между 2-19 h во время инъекции и нет старше 24 h если инъекции выполняются в тот же день. Сравнение времени разработки между WCR и других видов предполагает, что WCR эмбрионов по-прежнему должны быть precellular на 24 ч после яйца заложить (см. обсуждение).
Первые попытки преобразования микрофлорой WCR участие сопредседатель впрыска (рис. 3) вспомогательный (источник Транспозаза) и плазмид доноров (transposon) в precellular эмбрионов. Преобразования маркера для плазмида доноров был Зеленый флуоресцентный белок (EGFP) гена, движимый конститутивно активных промоутер от Tribolium castaneum (альфа тубулина промоутер26). Эмбриональных выживаемости были низкой (Таблица 1), но 26 G0 взрослых были восстановлены. Чтобы определить, если вставлен элемент доноров в любые клетки семенозачатка, G1 эмбрионы были экранированы для EGFP выражения. Хотя флуоресцентные потомства действительно были определены (рис. 4), скрининга эмбрионов WCR с интенсивным источником света оказалась смертельной27. Следующий раунд микрофлорой преобразования используются новым доноров плазмида, один обладающий Красного флуоресцирующего белка (DsRed) гена, движимый конститутивно активных промоутер от Drosophila melanogaster (теплового шока белок 70 промоутер28 ). В то время как показатели выживаемости были значительно улучшен (Таблица 1), живых взрослых только производства одной личинки DsRed позитивные (рис. 5). Однако эти эксперименты были особенно информативным в двух отношениях. Во-первых, было обнаружено, что микроинъекции вызвали задержки в развитии, в результате длительного времени к люк. Вместо того, чтобы все эмбрионы инкубационные в течение 2 недель эмбрионы вводят вылупились между 12 и 26 дней поста микроинъекции, таким образом, требует продолжительного мониторинга чтобы убедиться, что все детеныши были собраны. Во-вторых было отмечено, что недавно вылупившихся личинок были достаточно активны. Они просканированы на крышку, где они бы получить застрял и иногда бежал из агар блюдо. Эти вопросы были преодолены путем запечатывания чашки Петри с пленкой парафина и изучение крышки и агар тщательно для молодь.
Окончательный вариант этого протокола инъекции был проверен microinjecting WCR эмбрионов с буфером только, или с помощником и глаз promotor (3xP329) отмечены доноров ДНК плазмиды. Как дополнительный элемент управления, другой набор эмбрионов были обрабатываются одинаково, но не были microinjected. Четыре комплекта эмбрионов вводили с либо инъекционного раствора. В общей сложности 485 эмбрионы были введены с буфером и тех, 148 вылупился (Люк ставка = 30,5%, Таблица 1). От 1450 эмбрионы вводят с плазмида ДНК, 289 вылупился (ставка = 26,8%). Интересно, что 470 эмбрионов, которые прошли те же условия яйцо обработки, но без микроинъекции, только 250 вылупился (ставка = 53.2%). Показатель выживаемости эмбрионов uninjected составляет 20% выше, чем выживаемости эмбрионов вводят ожидается ввиду неизбежных ущерб, причиненный микроинъекции. Однако, видели мало разницы между буфера инъекций и ДНК инъекция, которая показывает количество добавляемого ДНК является приемлемым для WCR (см. обсуждение). Эти результаты также показывают, что выживаемость улучшилась за предыдущие усилия. Успешное создание трансгенных линий, с помощью этого метода был другом сообщили27.
Рисунок 1: яичные сбора. A) яйцо коллекции камеру. B) заложить Zoomed в представлении раздела яйцо палаты после 24-h яйцо. Обратите внимание, что стрелки обозначают расположение нескольких яиц. C) мойки яйца с марлей. D) окончательный передачи WCR яиц. Обратите внимание, кронштейн указывает региона с плотно упакованных WCR эмбрионов (то есть минимальный воды). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: подготовка инъекции слайд. A) черный фильтровальная бумага лентой плотно к стандартной микроскопа. B) Zoomed в представление секции инъекции слайд в ходе процесса подготовки. Примечание, стрелка #1 указывает расположение строку яиц, частичное линия клея #2 и #3 PIN-код, используемый для распространения клей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: инъекций эмбрионов. Инъекции слайд с восемь рядов яиц. Из-за угла инъекционной иглы последующие строки эмбрионов может быть введен путем простого перемещения на стадии. Примечание красного красителя в инъекционной иглы значительно СПИДа визуализации инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Трансгенных G1 эмбриона. Эмбрионы от WCR взрослого, который был совместно вводили с piggyBac-на основе плазмид вспомогательный и доноров как раннего эмбриона. Яркие зеленые эмбриона является положительным для расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) выражение в то время как другие нет. EGFP выражение управляется Tribolium castaneum альфа тубулина промоутер26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Трансгенных G1 личинка. 3 instar личинки, родитель которого был совместно вводили с piggyBac-на основе плазмид вспомогательный и доноров как раннего эмбриона. Красный светящийся личинка на левой стороне является положительным для выражения DsRed, в то время как личинка на право не является. DsRed выражение управляется Drosophila melanogaster теплового шока 70 промоутер28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Эксперимент | Лечение | Яйца | Вылупился | Люк курс |
| Exp. #1 | ΑtubEGFP донор | 910 | 57 | 6,3% |
| Exp. #2 | hsp70DsRed-донор | 1580 | 211 | 13,4% |
| Exp. #3 | 3xP3EGFP-донор | 1450 | 389 | 26,8% |
| Буфер | 485 | 148 | 30,5% | |
| No инъекций | 470 | 250 | 53,2% |
Таблица 1: данные микроинъекции. Люк ставки от трех микроинъекции экспериментов на WCR эмбрионов, показывая общее количество яиц вводили, общее количество личинок, которые успешно вылупились и уровень штриховки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя микроинъекции WCR с двуцепочечных РНК с целью RNAi сообщил9, это первый протокол к внедрению наилучшей практики для microinjecting precellular WCR эмбрионов, критический процесс для проведения преобразования микрофлорой и/или Геном ТРИФОСФАТЫ/Cas9 редактирования в этот вид. Успешный микроинъекции WCR эмбрионов зависит от многих факторов, как эффективность преобразования. Ниже некоторые из основных вопросов отражаются итоги использования этого протокола для преобразования микрофлорой в этот жук.
Получение precellular эмбрионов
Как упоминалось выше, ДНК не крест клеточных мембран, что путь РНК может. Это означает, что это важно что ДНК, мРНК и/или белки вводиться перед cellularization. Потому, что сроки проведения инъекций имеет решающее значение, важно определить вероятность окно для успешного микроинъекции, основанный на сколько времени он принимает nondiapausing WCR штамм30 для завершения эмбриогенеза. Это была рассчитана на основе подробных исследований о сроках-синцитиальный бластодермы стадии в другой жука, Tribolium castaneum. В Triboliumcellularization происходит ~ 8 h 30 ° C31должность яйцо лежит. Поскольку он занимает дней ~3.5 для Tribolium для завершения эмбриогенеза при 30 ° C, cellularization занимает место десятую часть пути в этот процесс. Так как эмбрионы WCR занять почти 2 недели, чтобы развивать, cellularization не может произойти до тех пор, пока второй день пост яйца лежали. Таким образом предполагается, что окно для успешного микроинъекции является длиной, по крайней мере 24 часа, который является полезным, поскольку WCR требуют ночи откладки яиц для обеспечения достаточного количества яиц для микроинъекции. Хотя этот метод был использован для успешного трансгенез27, это мыслимо, что результаты можно было бы улучшить путем инъекций младший эмбрионов, условии обработки очень ранних эмбрионов не повредить их.
Качество ДНК и концентрация
Это не удивительно, что концентрации ДНК играет ключевую роль в успешной трансформации. Долго думал, что необходимо, чтобы избежать потенциальной токсичности эмбрионы вводят32сохраняя конечная концентрация плазмидной ДНК ниже 1 мг/мл. Хотя в настоящее время неясно, если токсичности вопросы прошлого были вызваны самой ДНК или были вместо этого в результате загрязнений, перенесенных из процесса очищения плазмиды, это правило было твердо придерживается на протяжении двух десятилетий. Однако мы недавно обнаружил, что превышает 1 мг/мл предел был не только возможной, но и что это можно достичь более высоких темпов трансформации, ведущей к спекуляции, что отсутствие яйцо токсичность может быть из-за достижения в наборы очищения плазмиды, в результате чего меньше загрязнений. Учитывая время, необходимое для задних WCR, любое увеличение темпов трансформации полезно, даже если это приводит к несколько более высокие показатели смертности.
Размягчение поверхности яйца перед микроинъекции
В отличие от Triboliumвнешний большинство поверхности (Хорион) WCR эмбриона должны смягчил перед микроинъекции. Это важный шаг, даже при использовании кварц иглы. В идеале вода должна применяться к одного эмбриона непосредственно перед инъекцией, но может применяться к группам 2-3 эмбрионов в то время, если микроинъекции может быть достигнуто до chorions reharden. Без этого шага иглы вообще не будет проникать хориона, вызывая тем самым инъекции попытка завершится и потенциально опасные кончик иглы. Кроме того если иглы происходит успешно проникнуть сухой хориона, инъекционного раствора обычно просачивается обратно из-за давления внутри эмбриона, выше, чем атмосферное давление. Это, однако, легко отличить сухой мокрой (размягченного) эмбрионов. В частности, когда сухой, эмбрионы имеют собственный грузовик, круглой формы, в то время как добавление воды заставляет их терять их сферически вид. Размягчения не только позволяет иглы легко проникать хориона, но также снижает давление внутри эмбриона достаточно что инъекционного раствора не утечки.
Влажность и плесень
Эмбрионы вводят проходят в теплой, влажной среды всей эмбриогенеза. Эти условия не только обеспечивают идеальную среду для развития WCR, но также стимулировать рост плесени. В течение этого двух недельного периода плесень часто растет на блюда агар, жилье WCR эмбрионов. К сожалению эмбрионы требуют высокой влажности, и попытки сократить это привело к гораздо более низкие ставки люк. Интересно, что присутствие плесени вообще имел незначительное влияние на люк ставок, с большинство эмбрионов, штриховки без проблем. Кроме того противогрибковые лечения являются вредными для WCR эмбрионов, поэтому лучший способ уменьшить рост плесени, как представляется, чтобы избежать загрязнения; Очистка инструментов, контейнеры и микроинъекции системы перед использованием и пытается держать время, проведенное microinjecting к минимуму, так как споры плесени являются распространенными во многих лабораторных средах.
Выводы
Этот протокол предназначен для включения больше исследователей использовать трансгенные технологии в их исследованиях WCR и надеюсь поможет в разработке дополнительных мутация-технологий для использования в этом насекомых. Сложные мутация-на основе экспериментов, проведенных в Tribolium потенциально может быть адаптирован для WCR, включая мутагенез33 и основанный ТРИФОСФАТЫ генома, редактирования34. Потому что эти методы требуют микроинъекции precellular эмбрионов, этот протокол будет полезен не только на основе transposon функциональных геномных исследований и/или ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной изменения генома но также для стратегий управления на основе генетики Пешт 35 , 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грант от Монсанто кукурузы Rootworm знаний исследовательская программа, предоставить номер AG/1005 (в леях и МК) и запуск средства MDL от NCSU. ФК была поддержана от грантов от Монсанто кукурузы Rootworm знание программы исследований (AG/1005) и национального научного фонда, предоставьте номер MCB-1244772 (MDL). Авторы заявляют не конкурирующие интересы. ФК и MDL задумана и разработана экспериментов; FC, PW и SP выполненных экспериментов; ФК и MDL проанализированы результаты; и ФК, нг и MDL написал рукопись. Мы благодарим Тереза о ' Лири, Уильям Klobasa и Стефани Горски за их квалифицированную помощь в скрининг WCR. Мы также благодарим д-р французский Уэйд (USDA-ARS, север центральной сельскохозяйственных научно-исследовательская лаборатория, Брукингс, SD) для поставок яиц для создания лаборатории колоний и обеспечения воспитания протоколы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).
- Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
- Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
- Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
- Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
- Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
- Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
- Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162 (2010).
- Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
- Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
- Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
- Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
- O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
- Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Jeggo, P. A.
- Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
- Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
- Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
- Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
- Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
- Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
- Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
- Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
- Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11 (2007).
- Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).
