Summary
Nous présentons ici des protocoles pour la collecte et microinjecting maïs precellular embryons de la chrysomèle des racines du afin d’effectuer des analyses génomiques fonctionnelles telles que la transformation de la lignée germinale et CRISPR/Cas9-génome édition.
Abstract
La chrysomèle des racines du maïs (BFR) est un important ravageur du maïs et est bien connu pour sa capacité à s’adapter rapidement aux stratégies de lutte antiparasitaire. Bien que l’interférence ARN (ARNi) s’est avéré pour être un outil puissant pour étudier la biologie de la région des Caraïbes, il a ses limites. Plus précisément, Arni elle-même est transitoire (c'est-à-dire n’entraîne pas une hérédité mendélienne à long terme du phénotype associé), et il exige la connaissance de la séquence d’ADN du gène cible. Ce dernier peut être limitant si le phénotype d’intérêt est contrôlé par des gènes mal conservés, ou encore roman, parce que l’identification des cibles utiles serait difficile, voire impossible. Par conséquent, le nombre d’outils dans la boîte à outils génomique de WCR devrait être élargi par le développement de méthodes qui pourraient être utilisés pour créer des souches mutantes stables et activer les sondages indépendants de séquence du génome du BFR. Dans les présentes, nous détaillons les méthodes utilisées pour recueillir et microinject des embryons de WCR precellular avec les acides nucléiques. Alors que les protocoles décrits dans les présentes visent à la création de WCR transgénique, CRISPR/Cas9-génome réaliser un montage pourrait aussi en utilisant les mêmes protocoles, avec la seule différence étant la composition de la solution injectée dans les embryons.
Introduction
La chrysomèle du maïs (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, est un important ravageur du maïs1. Fait intéressant, WCR semble surmonter contrôle mesure plus rapidement que les parasites agricoles plus car ils ont non seulement s’adapter physiologiquement, mais aussi sur le plan comportemental2,3,4,5, 6. au cours de la dernière décennie, l’interférence ARN (ARNi), un outil puissant de la génomique fonctionnel, a été étudiée comme une méthode de contrôle possibles pour WCR7,8et a également été utilisé comme un moyen pour étudier les gènes fonction9. Cependant, alors que l’ARNi est fréquemment effectuée par microinjection d’ARN double brin (dsRNA) chez d’autres espèces, Arni axée sur l’injection est rare dans la région des Caraïbes. En fait, il y a seulement quelques rapports d’Arni par microinjection d’ARNdb dans WCR9. La raison en est que WCR peut atteindre des hauts niveaux de gène knockdown par ingestion de dsRNA7,10, permettant même l’étude des effets embryonnaires en se nourrissant de dsRNA à la mère de11. Tandis que cette méthode rend WCR un excellent sujet pour l’analyse génomique fonctionnelle par Arni, il a ralenti le progrès sur l’élaboration de méthodologies pour la microinjection embryonnaire chez cette espèce.
Malgré la puissance de l’ARNi, il y a quelques inconvénients. Par exemple, pas de tous les gènes répondent également à Arni. Cette variabilité peut faire interpréter les résultats d’un essai de génomique fonctionnelle plus difficile. En outre, Arni est transitoire et ne génère pas de mutations héréditaires. En revanche, la transformation de cellules germinales, un autre outil génomique fonctionnelle, peut générer des mutations héréditaires par insertion d’un élément transposable marqué dans le génome12,13. Cela rend la transformation de la lignée germinale un excellent outil pour la création de souches mutantes pour utilisation dans les études génétiques à long terme. Transformation peut également être utilisée pour secourir une mutation en remettant une copie fonctionnelle du gène d’un génome mutant14. En outre, la transformation de la lignée germinale est la pierre angulaire d’une grande variété de techniques de génétique moléculaire. En plus assommant et/ou la fonction du gène de sauvetage, transformation de la lignée germinale peut être utilisée pour enhancer piégeage15, gène piégeage16, axée sur la famille Gal4 l’expression ectopique17et pangénomique mutagénèse18.
Plus récemment, des outils qui permettent le montage sophistiqué du génome ont été développés. Ces outils comprennent la Transcription Activator-Like effecteur nucléases (TALEN) et les CRISPR/Cas9-nucléase système19,20. L’avantage de ces nouveaux outils est qu’ils offrent aux chercheurs la capacité d’induire une rupture d’ADN double-brin à presque n’importe quel endroit dans presque n’importe quel génome. Une fois que l’induit, ces pauses peuvent être réparés par le biais de deux extrémités non homologue rejoindre, qui peuvent introduire des suppressions ou insertions dans le gène ciblé, ou réparation axés sur l’homologie, qui, en présence d’une construction machinée, peut catalyser la remplacement de gènes ensemble ou régions génétiques21,22. Cependant, ces méthodes nécessitent microinjection de DNA, RNA et/ou de protéine dans des embryons de très jeunes.
Ce qui est important, contrairement à l’ARN doubles brins utilisé pour Arni, les acides nucléiques et les protéines utilisées pour la lignée germinale transformation et la modification du génome ne peut pas franchir facilement les membranes cellulaires. Par conséquent, microinjection de plasmide DNAs, ARNm et/ou protéines doit avoir lieu pendant l’étape du blastoderme syncytial (c'est-à-dire avant que l’embryon insecte cellularizes). Ce qui rend le moment des injections un facteur critique. Par exemple, chez Drosophila melanogaster, embryons doivent être injectés dans les deux heures après que les oeufs poser12. Par conséquent, élaboration d’un protocole de microinjection embryonnaires réussie pour la région des Caraïbes doit tenir compte les meilleures conditions pour la pose d’ovule de la femme, ainsi que la meilleure méthode pour recueillir des quantités suffisantes d’embryons precellular.
Un effort pour apporter un large éventail d’outils génétiques moléculaires sur la biologie de la WCR exige l’élaboration de méthodes de collecte et de microinjecting precellular embryons WCR. Ici, nous fournissons des instructions détaillées, ainsi que des trucs et astuces, pour aider les autres à utiliser des techniques axées sur la transformation dans la recherche de la région des Caraïbes. En plus d’étendre des technologies transgéniques à WCR devant servir à des études de génomique fonctionnelles, ces techniques permettent aussi puissant nouvelles stratégies de contrôle de ravageurs comme gène lecteur23,24 à tester dans ce économiquement important lutte antiparasitaire.
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Protocol
1. colonie-niveau élevage des adultes de la région des Caraïbes
- Obtenir une quantité suffisante d’adultes de la région des Caraïbes (500-1 000) d’un laboratoire de recherche ou entreprise fiable (voir Table des matières pour obtenir un exemple) et les placer dans une cage de 30 cm3 .
Remarque : L’utilisation d’une souche non diapause est fortement recommandée. - Préparer l’alimentation artificielle WCR, suivant le protocole du fabricant et versez une couche de 1 cm d’épaisseur dans un récipient de 38 oz (voir Table des matières). Après avoir mélangé, stocker nourriture inutilisée, à 4 ° C pendant 2 mois.
- Mettre une boîte de Pétri (100 x 15 mm) avec alimentation adulte (10-15 g) dans une cage de 30 cm3 . Ajouter l’alimentation plus lorsque la nourriture est faible ou sec.
- Mettre un ballon (300 mL) avec de l’eau, recouvert d’une boule de coton, qui sert à maintenir en place un rouleau de coton (6 "x 3/8"), pour servir comme une source d’eau. Changez l’eau quand elle s’épuise.
- A 14:10 lumière cycle un insecte incubateur d’élevage et de maintenir WCR à 26 ° C avec une humidité de 60 %.
2. l’alignement et la collecte des embryons
- Faire une couveuse de collection à l’aide de 1 % d’agar dans de l’eau dans un stérile 100 x 15 mm2 boîte de Pétri. Conserver à 4 ° C après que l’agar se solidifie.
- Pour ramasser les œufs nouvellement posées, placer une seule couche de papier filtre, suivie de 4 couches d’étamine (chaque coupe à la taille) sur la surface de la gélose (Figure 1 a).
NOTE : Étamine peut être réutilisé, après avoir été lavé à l’eau de Javel et stérilisés à l’autoclave, mais il n’est pas nécessaire de procéder à la première utilisation. Papier filtre ne doivent pas être réutilisé et ne doit pas être stérilisé. - Placer les oeuf collection plaque en cage WCR plus tard dans la journée que possible (fin de journée de travail) et couvrir d’une tente de feuille d’étain. Laisser une nuit.
Remarque : Avoir les lumières de 10:00 à 12 h 00 (14 h) retards de Ponte, ce qui facilite la collecte des oeufs plus jeunes pour microinjection sans exiger du personnel de laboratoire d’y placer la chambre de collection cage tard dans la nuit. - Supprimer la couveuse de collection autour de 8 ou de 09:00
- Utiliser forceps pour ramasser 1 couche de gaze en temps et lieu dans un bécher (500 mL) d’eau. Laver les œufs hors de fromage en remuant doucement (Figure 1 b et 1c).
- Utiliser une pipette de l’ampoule pour transférer les oeufs dans un autre bécher (500 mL) d’eau. Répéter 2-3 x pour nettoyer les oeufs.
- Utilisez la pipette de l’ampoule pour transférer des oeufs sur papier filtre (Figure 1) tout en minimisant le montant du report de l’eau.
- Couper le papier filtre noir en lanières larges comme une lame de verre et de la bande fermement sur la diapositive pour s’assurer que le document repose à plat (Figure 2 a).
NOTE : Papier filtre noir permet d’améliorer la visibilité sous le microscope en réduisant la quantité de lumière réfléchie. - Appliquez de la colle non toxique (voir Table des matières pour obtenir un exemple) pour le papier filtre dans les ridules (Figure 2 b). Garder les lignes de colle plus mince que le diamètre d’un ovule afin d’éviter les œufs recouvert de colle.
- Utilisez un pinceau fin pour déplacer doucement les oeufs WCR un de leur papier de filtre à la ligne de colle. Essayez du pondre sur la colle avant il se dessèche et garder distance au moins un œuf entre chaque oeuf.
- Maximiser l’efficacité de l’injection en plaçant plusieurs lignes d’oeufs sur un papier filtre diapositive (Figure 3).
- Une fois tous les oeufs sont disposés sur le papier filtre, attendez jusqu'à ce que toute la colle sèche avant microinjection.
Remarque : Pour transformation de la lignée germinale et génome CRISPR/Cas9-mediated édition, injecter tous les embryons avant midi (12:00) afin que le plus ancien embryon est vieux de pas plus de 19 h. Toutefois, pour RNAi, il n’y a aucun délai de prescription parce que, dans la région des Caraïbes, dsRNA peut se déplacer entre les cellules. En fait, pour RNAi, meilleurs taux de survie peuvent entraîner des embryons de vieillissement.
3. préparation du plasmide DNAs et aiguilles d’Injection
- Préparer l’ADN de plasmide surenroulé haute qualité à l’aide d’une endotoxine-free FM commerciale nécessaire (voir la Table des matières pour obtenir un exemple).
- Pour préparer la solution injectable, vérifier la concentration de chaque plasmide et ensuite combiner plasmides d’assistance (concentration finale de 250 ng/µL), plasmide donneur (concentration finale de 750 ng/µL) et tampon rouge de phénol (concentration finale de 20 %). Vortex la solution brièvement et centrifuger pendant 3 min à la vitesse maximale à précipiter les particules qui peuvent boucher l’aiguille.
- Tirez sur les aiguilles de verre borosilicate (D.I. 0,58 mm, longueur 10 cm, 1 mm de diamètre extérieur) à l’aide d’un extracteur de micropipette de type Flaming/Brown. Pour le stockage, fixer les aiguilles a tiré sur la bande adhésive double-face dans une boîte de Pétri ou autre contenant transparent.
Remarque : Pour le système d’extracteur de micropipette, les paramètres utilisés ont été : chaleur = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Remblayez l’aiguille d’injection à l’aide d’un micro-chargeur Astuce (voir Table des matières) pour pipette 0,5 - 1,0 µL vers le bas à l’intérieur de l’aiguille, près de l’extrémité effilée. Enlever les bulles de la pointe de l’aiguille si un quelconque se produit.
- Insérer l’aiguille d’injection dans le porte aiguille.
- Ouvrir la pointe de l’aiguille en coupant délicatement avec une belle paire de pinces, doucement toucher/glisser la pointe sur la lame de verre ou de la lamelle couvre-objet.
Remarque : L’objectif est d’avoir l’ouverture plus petite qui permet encore le mélange de l’injection de sortir (petites ouvertures exigent généralement la pression d’injection plus élevée). Biseauté aiguilles ne nécessitent pas cette étape car ils sont déjà ouverts.
4. la microinjection et soins après l’injection
- À l’aide d’un pinceau fin, soigneusement mouiller la surface de 1 à 3 oeufs à l’eau stérile, introduire l’aiguille et injecter la solution. Injecter chaque œuf avant que la surface ne sèche. Vous recherchez l’apparence une petite quantité de couleur rouge à l’intérieur des oeufs pendant l’injection pour indiquer la microinjection réussie. Écraser ou supprimer des œufs qui semblent endommagés, vide, ou dans le cas contraire, ne peut pas être injectés.
Remarque : Bien que la pression d’injection varie en fonction de l’aiguille perce, 10-13 psi est un bon point de départ. - Après que tous les oeufs sont injectés, retirez le papier filtre la lame de verre.
- Placer le filtre en papier sur la surface d’un plat de 1 % d’agar (décrit ci-dessus).
- Film plastique paraffine permet de sceller le plat et mettre dans un insecte de 26 ° C, incubateur d’élevage pendant 12 jours.
NOTE : Le film de paraffine afin de prévenir la contamination croisée des moisissures entre les plats. Cependant, tout autre traitement pour empêcher la croissance bactérienne pourrait réduire la survie des embryons injectées.
5. mise en culture et l’éclosion des embryons
- Commencez à regarder les embryons 12 jours après l’injection pour les larves nouvellement écloses et continuer tous les jours pendant les 2 prochaines semaines.
- Le transfert de larves, à l’aide d’une brosse fine, à une boîte d’élevage avec maïs germé et le sol.
NOTE : Moule peut s’étendre dans le plat d’agar, mais les larves écloront encore dans la plupart des cas. Recherchez les larves délicatement dans le moule pour les attraper tous. Certaines larves peuvent déplacer dans le couvercle du plat et pourraient se coincer dans la condensation. - Arrière des larves à 26 ° C, suivant la norme WCR élevage méthodes25.
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Representative Results
Une considération importante lors de l’élaboration de ce protocole était le stade de développement embryonnaire à l’époque de microinjection. Transformation de la lignée germinale exige expressément, microinjection d’ADN avant cellularisation embryonnaire. C’est parce que l’ADN ne peut facilement traverser les membranes cellulaires. Tentatives pour visualiser les étapes du développement embryonnaire de BFR en utilisant un colorant nucléaire ont échoué parce que les dechorionation d’embryons WCR essentiellement dissout toutes les membranes de protection responsables de l’intégrité de l’embryon. Cependant, cette ligne d’enquête fut supplantée par une autre difficulté – acquisition des quantités suffisantes d’embryons en temps opportun. Dans le domaine, WCR femelles pondent leurs œufs dans le sol, donc il n’est pas surprenant que dans le laboratoire, les femelles seulement pondent des œufs dans l’obscurité. Cela complique collections durant la journée courtes (2-4 h). Pour surmonter ce problème, une nuit unique oeuf laïc a été réalisée et a été trouvé pour donner de grandes quantités d’embryons. Bien que le processus de collecte (Figure 1) et l’aménagement des embryons de microinjection (Figure 2) est un peu laborieux, si fait rapidement ce protocole permet la microinjection d’embryons qui se situent entre âgées au moment de l’injection de 2 à 19 h et non plus de 24h si les injections sont effectuées plus tard dans la journée. Comparaison des temps de développement entre la région des Caraïbes et d’autres espèces suggère que les embryons WCR devraient toujours être precellular à 24h post oeuf laïcs (voir Discussion).
Les premières tentatives de transformation de la lignée germinale de WCR impliqué coinjection (Figure 3) d’assistance (source transposase) et plasmides donneur (transposon) dans des embryons de precellular. Le marqueur de transformation pour le plasmide donneur était un gène de la protéine fluorescente verte (EGFP) conduit par un promoteur constitutivement actif de Tribolium castaneum (alpha-tubuline promoteur26). Les taux de survie des embryons étaient faible (tableau 1), mais 26 G0 adultes ont été récupérés. Pour déterminer si l’élément donneur inséré dans les cellules germinales, G1 embryons ont été examinés pour l’expression EGFP. Progéniture fluorescente ont été identifiés en effet (Figure 4), dépistage des embryons de WCR avec la source de lumière intense s’est avérée mortelle27. Le prochain cycle de transformation de la lignée germinale utilisé un nouveau plasmide donneur, un possédant un gène de la protéine fluorescente rouge (DsRed) chassé par un promoteur constitutivement actif de Drosophila melanogaster (protéine de choc thermique 70 promoteur28 ). Alors que le taux de survie ont été que nettement améliorée (tableau 1), les adultes survivants ne produit qu’une seule larve DsRed positive (Figure 5). Toutefois, ces expériences ont été particulièrement instructives à deux égards. Tout d’abord, on a découvert que la microinjection a entraîné des retards dans le développement, résultant en une temps-à-trappe étendue. Plutôt que de tous les embryons d’incubation dans les 2 semaines, injectés embryons éclosent entre 12 et 26 jours après microinjection, ce qui nécessite une longue période de surveillance pour s’assurer que tous les nouveau-nés ont été recueillis. Deuxièmement, on a remarqué que les larves nouvellement écloses sont assez actifs. Ils ont rampant sur le couvercle, où ils seraient obtenir coincés et parfois ont fui le plat d’agar. Ces questions ont été surmontées en étanchéité Pétri d’une pellicule de paraffine et en examinant les couvercles et agar soigneusement pour les nouveau-nés.
La version finale du présent protocole d’injection a été testée par microinjecting embryons WCR avec tampon seul, ou d’assistance et oeil-promoteur (3xP329) marquée des plasmides d’ADN donneur. Comme un contrôle supplémentaire, une autre série d’embryons ont été traités identiquement mais n’étaient ne pas micro. Quatre ensembles d’embryons ont été injectés avec une solution injectable. Un total de 485 embryons ont été injectés avec du tampon et de la ces, 148 éclos (taux d’éclosion = 30,5 %, tableau 1). Des embryons 1 450 injectés avec le plasmide DNAs, 289 éclos (taux = 26,8 %). Fait intéressant, des 470 embryons qui a subi les mêmes conditions de traitement des oeufs, mais sans la microinjection, seulement 250 éclos (taux = 53,2 %). Que le taux de survie des embryons non est 20 % plus élevé que le taux de survie des embryons injectées doit être prévu en raison des dommages inévitables causés par microinjection. Cependant, il est vu peu de différence entre l’injection de tampon et ADN, ce qui suggère la quantité d’ADN étant ajouté est acceptable pour la région des Caraïbes (voir Discussion). Ces résultats montrent également que les taux de survie améliorée au cours de précédents efforts. Mise en place réussie des lignées transgéniques à l’aide de cette méthode a été signalée ailleurs27.
Figure 1 : collecte d’oeufs. A) couveuse de la collection. B) Zoomed-en vue d’une section d’une couveuse après 24 h oeufs poser. Remarque, les flèches indiquent l’emplacement de quelques oeufs. C) lavage des oeufs au large de l’étamine. D) le transfert final des œufs de la région des Caraïbes. Remarque, support indique la région avec des embryons de WCR des (c.-à-d. l’eau minimale). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : préparer une diapositive d’injection. A) noir filtre papier collée solidement sur une lame de microscope ordinaire. B) Zoomed-en vue d’une section d’une injection de glisser pendant le processus de préparation. Remarque, flèche #1 indique l’emplacement d’une ligne d’oeufs, 2 # ligne partielle de colle et #3 l’axe utilisé pour étendre la colle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : injection d’embryons. Une diapositive d’injection avec huit rangées d’oeufs. En raison de l’angle de l’aiguille d’injection, les lignes successives d’embryons peuvent être injectés en déplaçant simplement la scène. Remarque la teinture rouge dans l’aiguille d’injection facilite grandement visualisation de l’injection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Embryon de1 G transgéniques. Embryons provenant d’un adulte WCR qui a été injecté conjointement avec piggyBac-base de plasmides d’assistance et de bailleurs de fonds comme un embryon précoce. L’embryon vert vif est positif pour l’expression de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) tandis que les autres ne le sont pas. Expression de EGFP est entraînée par le promoteur de Tribolium castaneum alpha-tubuline 26. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Larve de transgéniques G1 . 3e stade larvaire dont le parent a été injecté conjointement avec piggyBac-base de plasmides d’assistance et de bailleurs de fonds comme un embryon précoce. La larve rouge brillant sur la gauche est positive pour l’expression de DsRed, tandis que la larve sur la droite n’est pas. Expression de DsRed est entraînée par le promoteur de choc thermique de Drosophila melanogaster 70 28. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Experiment | Traitement | Oeufs | Éclos | Taux d’éclosion |
| Exp. #1 | ΑtubEGFP-donateurs | 910 | 57 | 6.3 % |
| Exp. #2 | hsp70DsRed-donateurs | 1580 | 211 | 13,4 % |
| Exp. #3 | 3xP3EGFP-donateurs | 1450 | 389 | 26,8 % |
| Mémoire tampon | 485 | 148 | 30,5 % | |
| Non-injection | 470 | 250 | 53,2 % |
Tableau 1 : données de Microinjection. A partir de trois expériences de microinjection sur des embryons WCR, montrant le nombre total de œufs injecté, le nombre total de larves qui éclosent avec succès et le taux d’éclosion de l’éclosion.
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Discussion
Même si la microinjection de WCR avec ARN doubles brins aux fins de l’ARNi a été signalé9, il s’agit du premier protocole à établir des pratiques exemplaires pour microinjecting precellular embryons WCR, un processus essentiel pour mener la transformation de la lignée germinale et/ou CRISPR/Cas9 génome de montage chez cette espèce. Microinjection réussie d’embryons WCR est tributaire de nombreux facteurs, comme c’est l’efficacité de la transformation. Ci-dessous sont quelques-unes des principales questions ayant une incidence sur le résultat de l’utilisation de ce protocole pour la transformation de la lignée germinale dans cet insecte.
Obtention d’embryons precellular
Comme mentionné ci-dessus, ADN ne traverse pas les membranes cellulaires que peut l’ARNdb de manière. Cela signifie qu’il est d’une importance cruciale que les ADN, ADN messagère et/ou protéines être injectés avant cellularisation se produit. Parce que le timing de l’injection est critique, il était important de déterminer une fenêtre susceptible de microinjection succès basée sur combien de temps il faut la diapause WCR souche30 pour terminer l’embryogenèse. Ceci a été calculé selon des études détaillées de la synchronisation de la scène du blastoderme syncytial dans un autre insecte, Tribolium castaneum. Tribolium, cellularisation survient environ 8 h post oeuf lay à 30 ° C31. Car il faut ~3.5 jours pour Tribolium d’embryogenèse complet à 30 ° C, cellularisation déroule un dixième de la manière dans le processus. Étant donné que les embryons WCR prennent près de 2 semaines à développer, cellularisation peut se produire pas jusqu'à jeter le deuxième oeuf de poste de jour. Par conséquent, on a supposé que la fenêtre de microinjection réussie est au moins 24 h, qui est utile, puisque le WCR ont besoin au jour le jour de ponte pour fournir des quantités suffisantes d’oeufs pour la microinjection. Cette méthode a été utilisée pour la transgénèse réussie27, mais il est concevable que les résultats pourraient être améliorées en injectant plus jeunes embryons, autant la manipulation des embryons très tôt eux ne cause pas un préjudice.
Concentration et la qualité de l’ADN
Il n’est pas surprenant que la concentration d’ADN joue un rôle essentiel dans la réussite de la transformation. On a longtemps pensé qu’il était nécessaire pour éviter la toxicité potentielle pour les embryons injecté32de garder la concentration finale d’ADN plasmidique inférieures à 1 mg/mL. Bien qu’il soit désormais difficile de savoir si les problèmes de toxicité du passé étaient dus à l’ADN lui-même ou sont plutôt le résultat des contaminants induite par le processus de purification de plasmide, cette règle n’a été fermement respecté depuis deux décennies. Cependant, nous avons récemment découvert que limite dépassant le 1 mg/mL, est non seulement possible, mais aussi que cette opération peut atteindre des taux plus élevés de transformation, menant à la spéculation que l’absence de toxicité de le œuf peut être en raison des progrès dans les kits de plasmide de purification, ce qui entraîne moins de contaminants. Étant donné le temps nécessaire à l’arrière WCR, toute augmentation des taux de transformation est utile, même si elle aboutit à des taux légèrement plus élevés de mortalité.
Surface de le œuf avant microinjection de ramollissement
À la différence de Tribolium, la surface de la plus externe (chorion) d’un embryon de WCR doit être adoucie avant microinjection. Il s’agit d’une étape essentielle lorsqu’on utilise des aiguilles quartz. Idéalement, l’eau doit être appliqué à un seul embryon immédiatement avant l’injection, mais peut être appliquée à des groupes de 2 à 3 embryons à la fois si la microinjection peut être accomplie avant chorions reharden. Sans cette étape, les aiguilles échoue généralement à pénétrer dans le chorion, provoquant ainsi la tentative d’injection à l’échec et potentiellement endommager la pointe de l’aiguille. En outre, si l’aiguille arrive à pénétrer avec succès une chorion sèche, la solution injectable typiquement fuit retour en raison de la pression à l’intérieur de l’embryon étant supérieure à la pression ambiante. Toutefois, il est facile de distinguer sec humide embryonnaires (adoucie). Plus précisément, lorsqu’il est sec, les embryons ont une distincts rigide, forme, tandis que l’ajout d’eau fait perdre leur apparence sphérique ronde. Ramollissement permet non seulement l’aiguille pénétrer facilement dans le chorion mais réduit également la pression à l’intérieur de l’embryon assez que la solution injectable ne fuit pas dehors.
Humidité et moisissures
Embryons injectées se déroulent dans un environnement chaud et humide tout au long de l’embryogenèse. Ces conditions non seulement fournissent un environnement idéal pour le développement de la région des Caraïbes, mais également de promouvoir la croissance de moisissures. Au cours de cette période de deux semaines, le moule se développe fréquemment sur les plats d’agar abritant les embryons de BFR. Malheureusement, les embryons nécessitent une humidité élevée, et les tentatives de le réduire a donné lieu à beaucoup plus faibles taux d’éclosion. Fait intéressant, la présence de moisissure généralement avait peu d’impact sur le taux d’éclosion, avec la plupart des embryons d’incubation sans problèmes. Par ailleurs, les traitements antifongiques sont nocifs pour embryons WCR, donc le meilleur moyen de réduire la croissance de moisissures semble être d’éviter toute contamination ; nettoyage des outils, des récipients et système de micro-injection avant utilisation et essayant de garder le temps passé microinjecting au minimum, étant donné que les spores de moisissure sont répandus dans de nombreux environnements de laboratoire.
Conclusions
Ce protocole vise à permettre à davantage de chercheurs d’employer des technologies transgéniques dans leur recherche WCR et je l’espère aidera dans le développement des technologies transgéniques supplémentaires destinés à cet insecte. Sophistiquée axée sur la transgénèse des expériences réalisées au Tribolium pourraient être adaptées pour la région des Caraïbes, y compris la mutagénèse33 et axée sur les CRISPR génome édition34. Car ces techniques nécessitent la microinjection d’embryons precellular, ce protocole sera utile non seulement pour les études de génomique fonctionnelles axée sur le transposon et/ou CRISPR/Cas9-mediated génome édition mais aussi pour les stratégies de lutte antiparasitaire axée sur la génétique 35 , 36.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention du programme de recherche connaissances Corn Rootworm Monsanto, accorde un numéro AG/1005 (pour le MDL et YC) et fonds d’amorçage au MDL de NCSU. FC a été pris en charge par des subventions du programme de recherche de Monsanto Corn Rootworm connaissances (AG/1005) et la National Science Foundation, accorder numéro MCB-1244772 (au MDL). Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés. FC et MDL conçu et créé les expériences ; FC, PW et SP effectuaient les expériences ; FC et MDL ont analysé les résultats ; et FC, NG et le MDL a écrit le manuscrit. Nous remercions Teresa O'Leary, William Klobasa et Stephanie Gorski pour leur assistance d’experts en dépistage WCR. Nous remercions également m. Wade Français (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) pour des envois d’oeufs d’établir des colonies de laboratoire et en fournissant les protocoles d’élevage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
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