Summary
Aqui nós apresentamos protocolos para coletando e microinjecting precellular milho ocidental embriões repele com a finalidade de realizar ensaios funcionais-genômica como germline transformação e edição de CRISPR/Cas9-genoma.
Abstract
Repele o milho (RPT) é uma importante praga do milho e é conhecida por sua capacidade de rapidamente se adaptar às estratégias de manejo de pragas. Embora o RNA de interferência (RNAi) provou para ser uma poderosa ferramenta para estudar Biologia WCR, tem suas limitações. Especificamente, RNAi em si é transitório (ou seja, não resulta em longo prazo mendeliana do fenótipo associado), e exige saber a sequência de DNA do gene alvo. Este último pode ser um fator limitante se o fenótipo de interesse é controlado por genes mal conservados, ou mesmo romance, porque identificar alvos úteis ia ser um desafio, se não impossível. Portanto, o número de ferramentas caixa de ferramentas genômicas do WCR deve ser expandido pelo desenvolvimento de métodos que pode ser usada para criar cepas mutantes estáveis e permitir pesquisas independentes de sequência do genoma WCR. Neste documento, detalhamos os métodos usados para coletar e microinjeção precellular WCR os embriões com ácidos nucleicos. Enquanto os protocolos descritos visam a criação de transgénico WCR, edição de CRISPR/Cas9-genoma poderia também ser realizada utilizando os mesmos protocolos, com a única diferença é a composição da solução injetada os embriões.
Introduction
Repele do milho ocidental (RPT), Diabrotica virgifera virgifera, é uma praga importante do milho1. Curiosamente, WCR aparece superar o controle mede mais rapidamente do que as pragas mais agrícolas, desde que eles não só se adaptar fisiologicamente mas também comportamentalmente2,3,4,5, 6. na última década, o RNA de interferência (RNAi), uma poderosa ferramenta de genômica funcional, foi investigado como um método de controle potencial para WCR7,8e também tem sido usado como um meio para o estudo de função do gene9. No entanto, enquanto RNAi é frequentemente realizada por microinjeção de RNA double-stranded (dsRNA) em outras espécies, baseado na injeção de RNAi é raro em WCR. Na verdade, existem apenas alguns relatos de RNAi através de microinjeção de dsRNA em WCR9. A razão é que WCR pode atingir alto-níveis de gene "knockdown" através de ingestão de dsRNA7,10, mesmo permitindo o estudo dos efeitos embrionários alimentando dsRNA para a mãe11. Enquanto este método torna WCR um excelente assunto para análise genômica funcional via RNAi,-retardou o progresso no desenvolvimento de metodologias para o embrionário microinjection nesta espécie.
Apesar do poder de RNAi, existem alguns inconvenientes. Por exemplo, nem todos os genes respondem igualmente a RNAi. Esta variabilidade pode fazer a interpretação dos resultados de um ensaio de genómica funcional mais difícil. Além disso, RNAi é transitória e não gera mutações hereditárias. Por outro lado, a transformação da linha germinal, outra ferramenta genômica funcional, pode gerar mutações hereditárias através de inserção de um elemento marcado transponíveis no genoma12,13. Isto faz a transformação do germline uma excelente ferramenta para a criação de cepas mutantes para uso em estudos de genéticos a longo prazo. Transformação também pode ser usada para resgatar uma mutação, entregando uma cópia funcional do gene de um genoma mutante14. Além disso, a transformação do germline é a pedra angular de uma grande variedade de técnicas de genéticas moleculares. Além de bater para fora e/ou resgatar a função do gene, germline transformação pode ser usada para realçador de armadilhagem15, gene armadilhagem16, expressão ectópica baseada em Gal417e mutagênese genoma-largo18.
Mais recentemente, foram desenvolvidas ferramentas que permitem a edição sofisticada do genoma. Essas ferramentas incluem transcrição Activator-Like Effector Nucleases (TALEN) e o sistema CRISPR/Cas9-nuclease19,20. A vantagem dessas novas ferramentas é que eles oferecem a capacidade de induzir uma quebra de DNA dupla-hélice em quase qualquer local dentro de quase qualquer genoma para pesquisadores. Uma vez que induzida, estas quebras podem ser reparadas através das extremidades não-homóloga juntar-se, que podem apresentar deleções ou inserções no gene alvo, ou através de reparação homologia-dirigido, que na presença de uma construção projetada, pode catalisar a substituição de genes inteiras ou regiões genéticas21,22. No entanto, esses métodos exigem microinjeção de DNA, RNA e/ou proteína em embriões muito jovens.
Importante, ao contrário do dsRNAs usado para RNAi, os ácidos nucleicos e proteínas usadas para germline transformação e edição de genoma não podem facilmente cruzar as membranas celulares. Portanto, microinjeção de DNAs plasmideo, mRNAs e/ou proteínas deve ser efectuada durante a fase de Drosophila sincicial (ou seja, antes do embrião inseto cellularizes). Isso faz com que o timing de injeções um fator crítico. Por exemplo, em Drosophila melanogaster, embriões precisam ser injetado dentro de duas horas depois de ovo colocar12. Portanto, desenvolvimento de um protocolo bem sucedido microinjeção embrionárias para WCR deve levar em conta as melhores condições para a colocação de óvulo feminino, assim como o melhor método para coletar uma quantidade suficiente de embriões precellular.
Um esforço para trazer uma ampla gama de ferramentas de genéticas moleculares sobre Biologia WCR requer desenvolver métodos de recolha e microinjecting precellular embriões WCR. Aqui nós fornecemos instruções detalhadas, juntamente com dicas e truques, para ajudar os outros a usar técnicas baseadas em transformação na pesquisa WCR. Além de estender as tecnologias transgênicas para WCR para uso em estudos de genômicos funcionais, estas técnicas também permitem poderosas novas estratégias de controle de pragas tais como gene unidade23,24 a ser testado neste economicamente importante pragas.
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Protocol
1. nível de colônia de criação dos adultos WCR
- Obter uma quantidade suficiente de adultos WCR (500-1.000) de um laboratório confiável de empresa ou de pesquisa (ver Tabela de materiais para obter um exemplo) e coloque em uma gaiola de3 30 cm.
Nota: O uso de uma cepa não-diapausing é altamente recomendado. - Preparar a dieta artificial WCR, seguindo o protocolo do fabricante e despeje uma camada de 1 cm de espessura em um recipiente de 38 oz (ver Tabela de materiais). Após a mistura, armazene dieta não utilizada a 4 ° C por até 2 meses.
- Colocar uma placa de Petri (100 x 15 mm) com dieta adulta (10-15 g) em uma gaiola de3 30 cm. Adicione mais dieta quando a comida é baixo ou seco.
- Colocar um balão (300 mL) com água, coberta com uma bola de algodão, que é usada para segurar no lugar de um rolo de algodão (6 "x 3/8"), para servir como uma fonte de água. Mude a água quando ele é executado baixo.
- Manter WCR a 26 ° C, com 60% de humidade e um 14:10 luz do ciclo em um inseto incubadora de criação.
2. alinhamento e colheita de embriões
- Fazer uma câmara de coleta de ovos usando ágar de 1% em água estéril 100 x 15 mm2 placa de Petri. Armazenar a 4 ° C, após o ágar solidifies.
- Para coletar ovos recém-estabelecidas, coloque uma camada de papel de filtro, seguido de 4 camadas de gaze (cada corte ao tamanho) na superfície do ágar (figura 1A).
Nota: Gaze pode ser reutilizado, depois de ser lavado em água sanitária e esterilizada, mas não é necessário fazer isso para a primeira utilização. Papel de filtro não deve ser reutilizado e não precisa ser esterilizado. - Coloque a placa de coleção de ovo na gaiola WCR mais tarde no dia possível (final do dia de trabalho) e cobrir com uma tenda de papel alumínio. Deixe durante a noite.
Nota: Tendo as luzes de 10:00 a postura de ovos 12 A.M. (14 h) atrasos, facilitando assim a recolha dos ovos mais jovens para o microinjection sem a necessidade de pessoal de laboratório colocar a câmara de recolha na gaiola à noite. - Remova a câmara de recolha de ovos em torno de 8 ou 09:00
- Use fórceps para pegar 1 camada de gaze em tempo e lugar num copo (500 mL) de água. Lave os ovos de gaze agitando suavemente (figura 1B e 1C).
- Use uma pipeta de bulbo para transferir os ovos para outro copo (500 mL) de água. Repita 2-3 x para limpar os ovos.
- Use a pipeta de bulbo para transferir ovos em papel de filtro (Figura 1), minimizando a quantidade de transferência de água.
- Corte papel filtro preto em tiras tão largas como uma lâmina de vidro e a fita firmemente para o slide para certificar-se o papel fixa plana (Figura 2A).
Nota: Papel filtro preto ajuda a melhorar a visibilidade sob o microscópio, reduzindo a quantidade de luz refletida. - Aplicar a cola não-tóxica (ver Tabela de materiais para obter um exemplo) para o papel de filtro em linhas finas (Figura 2B). Manter as linhas de cola mais fino do que o diâmetro de um ovo de modo a evitar os ovos revestidos em cola.
- Use um pincel fino para mover suavemente WCR os ovos um a um de seu papel de filtro para a linha de cola. Para colocar os ovos na cola antes de secar para fora e tentar manter distância de pelo menos um ovo entre cada ovo.
- Maximize a eficiência de injeção, colocando várias linhas de ovos no slide um papel de filtro (Figura 3).
- Depois que todos os ovos para fora o papel de filtro, espere até que toda a cola secar antes de microinjeção.
Nota: Para transformação do germline e genoma CRISPR/Cas9-mediada edição, injete todos os embriões do meio-dia (12:00) para que o embrião mais velho é velho não mais de 19 h. No entanto, para RNAi, não há nenhuma limitação de tempo porque, em WCR, dsRNA pode mover entre as células. Na verdade, para RNAi, embriões de envelhecimento podem resultar em melhores taxas de sobrevivência.
3. preparação de DNAs plasmideo e agulhas de injeção
- Prepare-se alta qualidade supercoiled Plasmídeo usando um comercial livre de endotoxinas kit (veja a Tabela de materiais para obter um exemplo).
- Para preparar a solução de injeção, verifique a concentração de cada plasmídeo e então combinar auxiliar do plasmídeo (concentração final de 250 ng / µ l), doador do plasmídeo (concentração final de 750 ng / µ l) e buffer de vermelho de fenol (20% de concentração final). Vórtice brevemente a solução e centrifugar para 3 min na velocidade máxima para precipitar partículas que podem entupir a agulha.
- Puxe agulhas de vidro de borosilicato (O.D. 1 mm, identificação 0,58 mm, comprimento de 10 cm) usando um extrator de micropipeta tipo flamejante/marrom. Para armazenamento, secure agulhas puxadas na fita adesiva dupla-face em uma placa de Petri ou outro recipiente transparente.
Nota: Para o sistema extrator de micropipeta, as configurações usadas foram: calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Aterramento a agulha de injeção, usando um microcarregador de ponta (ver Tabela de materiais) para pipetar 0,5 - 1,0 µ l para baixo dentro da agulha, perto da extremidade pontiaguda. Remova as bolhas da ponta da agulha se ocorrer qualquer um.
- Introduza o suporte da agulha, a agulha de injeção.
- Abra a ponta da agulha suavemente rompendo com um belo par de pinças, ou suavemente tocar/arrastando a ponta no slide lamela ou vidro.
Nota: O objetivo é ter a menor abertura que ainda permite a combinação de injeção para sair (aberturas menores geralmente requerem maior pressão de injeção). Agulhas chanfradas não exigem este passo desde já estão abertas.
4. microinjection e cuidados pós-injeção
- Usando um pincel fino, cuidadosamente molhe a superfície de 1-3 ovos com água estéril, introduza a agulha e injetar a solução. Injete cada ovo antes que seque a superfície. Olha para a aparência uma pequena quantidade de cor vermelha dentro dos ovos durante a injeção para indicar a microinjeção de sucesso. Esmagar ou remover todos os ovos que está danificado, vazio, ou caso contrário não podem ser injetados.
Nota: Embora a pressão de injeção varia de acordo com o tamanho de furo de agulha, 10-13 psi é um bom ponto de partida. - Depois que todos os ovos são injetados, remova a lâmina de vidro o papel de filtro.
- Coloque o papel de filtro sobre a superfície de um prato de 1% de ágar (descrito acima).
- Use filme plástico parafina para selar o prato e coloque em um inseto de 26 ° C criação de incubadora durante 12 dias.
Nota: O filme de parafina ajudará a evitar a contaminação cruzada do molde entre pratos. No entanto, qualquer outro tratamento para evitar mofo e crescimento bacteriano poderia reduzir a sobrevivência dos embriões injetados.
5. cultivo e incubação de embriões
- Comece a verificar injeção após 12 dias de embriões para larvas recém-eclodidas e continuar diariamente para as próximas 2 semanas.
- Transferência de larvas, usando um pincel fino, para uma caixa de criação com milho germinado e solo.
Nota: Molde pode crescer no prato agar, mas as larvas eclodem ainda na maioria dos casos. Procure larvas cuidadosamente dentro do molde para pegá-los todos. Algumas larvas podem passar para a tampa do prato e podem ficar preso a condensação. - Larvas a 26 ° C, seguindo o padrão WCR criação métodos25de trás.
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Representative Results
Uma consideração importante ao desenvolver este protocolo foi palco do desenvolvimento embrionário no momento da microinjeção. Especificamente, o germline transformação requer microinjeção de DNAs antes celularização embrionária. Isso ocorre porque o DNAs facilmente não podem atravessar as membranas celulares. Tenta visualizar os estágios do desenvolvimento embrionário WCR, usando uma mancha nuclear não tiveram sucesso porque dechorionation de embriões WCR essencialmente dissolve todas as membranas protetoras responsáveis pela integridade do embrião. No entanto, esta linha de investigação foi suplantada por outra dificuldade – aquisição de quantidades suficientes de embriões em tempo hábil. No campo, WCR fêmeas põem seus ovos no solo, assim não deve ser nenhuma surpresa que no laboratório, as fêmeas só colocam ovos no escuro. Isto dificulta a coleções de dia curtas (2-4 h). Para superar esse problema, uma único ovo durante a noite na cama foi realizada e foi encontrada para produzir grandes quantidades de embriões. Embora o processo de coleta (Figura 1) e layout de embriões (Figura 2) para o microinjection é um pouco trabalhoso, se feito rapidamente este protocolo permite microinjeção de embriões que são entre 2-19 h velho no momento da injeção e não mais de 24 h se injeções são realizadas no final do dia. Comparação dos tempos de desenvolvimento, entre outras espécies e WCR sugere que embriões WCR ainda devem ser precellular em 24h post ovo leigos (ver discussão).
As primeiras tentativas de transformação do germline do WCR envolveram co injeção (Figura 3) de auxiliar (fonte transposase) e doadores (transposon) plasmídeos precellular embriões. O marcador de transformação para o plasmídeo doador era um gene da proteína verde fluorescente (EGFP) conduzido por um promotor constitutivamente ativo de Tribolium castaneum (alfa-tubulina promotor26). As taxas de sobrevivência embrionária foram baixos (tabela 1), mas 26 G0 adultos foram recuperados. Para determinar se o doador elemento inserido qualquer células germinativas, G1 embriões foram projectados para expressão EGFP. Apesar de progênie fluorescente de fato foram identificados (Figura 4), seleção de embriões WCR com a fonte de luz intensa mostrou-se letal27. A próxima rodada de transformação germline utilizou um plasmídeo de novos doadores, um possuindo um gene da proteína fluorescente vermelha (DsRed) conduzido por um promotor constitutivamente ativo de Drosophila melanogaster (proteínas de choque do calor 70 promotor28 ). Enquanto as taxas de sobrevivência foram que muito melhoradas (tabela 1), os sobreviventes adultos produziram apenas uma única larva DsRed-positivo (Figura 5). No entanto, estas experiências foram particularmente informativas em dois aspectos. Primeiro, foi descoberto que microinjeção causou atrasos no desenvolvimento, resultando em uma prolongado tempo-para-escotilha. Ao invés de todos os embriões dentro de 2 semanas de incubação, embriões injetados eclodiram entre post microinjeção de dias 12 e 26, exigindo assim um longo período de acompanhamento para assegurar que todos os filhotes foram recolhidos. Em segundo lugar, foi observado que as larvas recém-eclodidas foram bastante ativas. Arrastaram para a tampa onde eles ficar preso e às vezes escapou o prato de ágar. Esses problemas foram superados lacrar placas de Petri com uma película de parafina e examinando as tampas e ágar cuidadosamente para os filhotes.
A versão final do presente protocolo de injeção foi testada por microinjecting embriões WCR com buffer sozinho, ou com auxiliar e olho-promotor (3xP329) marcado plasmídeos de DNA do doador. Como um controle adicional, um outro conjunto de embriões foram manipulados de maneira idêntica, mas não foram injetadas. Quatro conjuntos de embriões foram injetados com qualquer solução de injeção. Um total de 485 embriões foram injetados com tampão e daqueles, 148 eclodidos (taxa de hachura = 30,5%, tabela 1). De 1.450 embriões injetados com plasmídeo DNAs, 289 eclodidos (taxa = 26,8%). Curiosamente, de 470 embriões submetidos às mesmas condições de manipulação de ovos, mas sem microinjeção, apenas 250 eclodidos (taxa = 53,2%). Que a taxa de sobrevivência de embriões uninjected é 20% maior do que as taxas de sobrevivência de embriões injetados é esperado devido aos danos inevitáveis causados pelo microinjection. No entanto, pouca diferença é vista entre buffer injeção e injeção de DNA, o que sugere que a quantidade de DNA sendo adicionado é aceitável para WCR (ver discussão). Esses resultados mostram também que as taxas de sobrevivência melhoraram durante os esforços anteriores. Criação bem sucedida de linhas transgénicas usando este método tem sido relatada em outro lugar,27.
Figura 1: coleção de ovos. A) câmara de recolha dos ovos. B) leigos Zoomed-em vista de uma seção de uma câmara de ovo após 24h ovo. Note que as setas indicam a localização de alguns ovos. C) lavar ovos fora gaze. D) a transferência final dos ovos WCR. Note que suporte indica a região com embriões WCR densamente (ou seja, água mínima). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: preparar um slide de injeção. A) papel filtro preto colado firmemente a um slide de microscópio padrão. B) Zoomed-em vista de uma seção de uma injeção deslize durante o processo de preparação. Nota, seta #1 indica a localização de uma fileira de ovos, #2 linha parcial de cola e #3 o pino usado para espalhar a cola. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: injetando embriões. Um slide de injeção com oito linhas de ovos. Devido ao ângulo da agulha da injeção, linhas sucessivas de embriões podem ser injetadas, simplesmente movendo o palco. Nota o corante vermelho com a agulha de injeção muito auxilia a visualização da injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Embrião de1 G de transgénicos. Embriões de um adulto WCR que foi co injetado com piggyBac-baseado plasmids auxiliar e doadores como um embrião. O embrião de verde brilhante é positivo para a expressão da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP), enquanto os outros não são. Expressão de EGFP é conduzido pelo promotor Tribolium castaneum alfa-tubulina 26. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Larva de1 transgénicos G. larvas de 3º ínstar, cujo pai era co injetado com piggyBac-baseado plasmids auxiliar e doadores como um embrião. A larva vermelha brilhante da esquerda é positiva para DsRed expressão, enquanto a larva da direita não é. DsRed expressão é conduzido pelo promotor choque do calor de Drosophila melanogaster 70 28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Experimento | Tratamento | Ovos | Hachurada | Taxa de escotilha |
| Exp. #1 | ΑtubEGFP-doador | 910 | 57 | 6,3% |
| Exp. #2 | hsp70DsRed-doador | 1580 | 211 | 13,4% |
| Exp. #3 | 3xP3EGFP-doador | 1450 | 389 | 26,8% |
| Buffer de | 485 | 148 | 30,5% | |
| Não-injeção | 470 | 250 | 53,2% |
Tabela 1: dados Microinjection. Tarifas a partir de três experiências de microinjeção em embriões WCR, mostrando o número total de ovos injetado, o número total de larvas que eclodiram com êxito e a taxa de escotilha de hachura.
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Discussion
Embora microinjection de WCR com dsRNAs com a finalidade de RNAi tem sido relatado9, este é o primeiro protocolo para estabelecer as melhores práticas para microinjecting precellular embriões WCR, um processo crítico para a realização da linha germinal transformação e/ou CRISPR/Cas9 genoma edição nesta espécie. Sucesso microinjeção de embriões WCR é dependente de muitos fatores, como eficiência de transformação. Discutidas a seguir estão algumas das principais questões impactando o resultado do uso deste protocolo para a transformação do germline neste besouro.
Obtenção de embriões precellular
Como mencionado acima, DNA não atravessa as membranas celulares que do dsRNA forma pode. Isto significa que é de importância crítica que DNA, mRNA e/ou proteínas ser injetada antes celularização ocorre. Porque o tempo de injeção é crítico, foi importante determinar uma provável janela para microinjeção de sucesso baseada em quanto tempo demora o nondiapausing WCR tensão30 para completar a embriogênese. Isto foi calculado com base em estudos detalhados do calendário do estágio no outro besouro, Tribolium castaneumDrosophila sincicial. Em Tribolium, celularização ocorre a postura de ovo post ~ 8 h em 30 ° C,31. Desde que leva ~3.5 dias para Tribolium embriogênese completa a 30 ° C, celularização tem lugar um décimo do caminho no processo. Desde embriões WCR levar quase 2 semanas para desenvolver, celularização pode não ocorrer até que o segundo ovo de post do dia deitar. Portanto, supunha-se que a janela para o sucesso microinjection é pelo menos 24 h de longo, que é útil, pois WCR exigem postura para fornecer quantidades suficientes de ovos para microinjeção de ovos durante a noite. Enquanto este método foi usado por transgênese bem sucedida27, é concebível que resultados poderiam ser melhorados através da injeção de embriões mais jovens, desde a manipulação de embriões muito cedo não prejudicá-los.
Concentração e qualidade do DNA
Não é surpreendente que concentração de DNA desempenha um papel crucial na transformação com êxito. Isso tem sido pensado que mantendo a concentração final de plasmídeo abaixo de 1 mg/mL foi necessária para evitar a potencial toxicidade para os embriões injetados32. Embora agora é claro se os problemas de toxicidade do passado foram devido o próprio DNA ou resultavam em vez de contaminantes do processo de purificação de plasmídeo, essa regra tem sido firmemente respeitados por duas décadas. No entanto, recentemente descobrimos que exceda a 1 mg/mL limite era não só possível mas também fazer aquele para que possa alcançar maiores taxas de transformação, levando à especulação de que a ausência de toxicidade de ovo pode ser devido aos avanços em kits de purificação de plasmídeo, resultando em menos contaminantes. Dado o tempo necessário para a parte traseira WCR, qualquer aumento nas taxas de transformação é útil, mesmo que isso resulte em ligeiramente maiores taxas de mortalidade.
Superfície do ovo antes de microinjeção de amaciamento
Ao contrário de Tribolium, a superfície mais externa (córion) de um embrião WCR deve ser amaciada antes de microinjeção. Este é um passo crítico, mesmo quando usando agulhas de quartzo. Idealmente, a água deve ser aplicada a um único embrião imediatamente antes da injeção, mas pode ser aplicada a grupos de 2 a 3 embriões de cada vez se microinjeção pode ser realizada antes de chorions reharden. Sem esta etapa, agulhas geralmente não conseguirão penetrar o córion, causando assim a tentativa de injeção de falha e potencialmente danificar a ponta da agulha. Além disso, caso a agulha penetrar com sucesso um córion seco, a solução de injeção normalmente vaza volta devido a pressão no interior do embrião, sendo maior do que a pressão ambiente. É, no entanto, fácil de distinguir seco do molhado embriões (amolecidos). Especificamente, quando seca, os embriões têm um distinto rígida, forma, enquanto a adição de água faz com que perca sua aparência esférica redonda. Amaciamento não só permite a agulha penetrar facilmente o córion, mas também reduz a pressão no interior do embrião suficiente que a solução de injeção não vazar.
Umidade e mofo
Injetado embriões são realizados em um ambiente quente e úmido durante a embriogênese. Estas condições não só fornecem o ambiente perfeito para o desenvolvimento do WCR, mas também promovem o crescimento de molde. Durante este período de duas semanas, o molde cresce frequentemente sobre os pratos de ágar habitação os embriões WCR. Infelizmente, os embriões exigem alta umidade, e as tentativas de reduzi-la resultaram em taxas muito menores de escotilha. Curiosamente, a presença de fungos geralmente tinha pouco impacto sobre as taxas de escotilha, com a maioria dos embriões de incubação sem problemas. Além disso, tratamentos antifúngicos são prejudiciais aos embriões WCR, então a melhor maneira de reduzir o crescimento de fungos parece ser para evitar contaminação; limpeza de ferramentas, recipientes e sistema de microinjeção antes do uso e tentando manter o tempo gasto microinjecting ao mínimo, uma vez que esporos de mofo são prevalentes em muitos ambientes de laboratório.
Conclusões
Este protocolo destina-se a permitir aos investigadores mais empregam tecnologias transgênicas em suas pesquisas WCR e esperemos que ajudarão no desenvolvimento de tecnologias baseadas em transgenics adicionais para uso neste inseto. Sofisticado baseado em transgênicos experimentos realizados em Tribolium potencialmente poderiam ser adaptados para WCR, incluindo mutagênese33 e genoma CRISPR-baseado edição34. Porque estas técnicas exigem microinjeção de embriões precellular, este protocolo será útil não só para estudos de genômicos funcionais transposon-base e/ou CRISPR/Cas9-mediada genoma edição mas também para estratégias de manejo de pragas com base em genética 35 , 36.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do programa de pesquisa Monsanto milho Rootworm conhecimento, conceder número AG/1005 (ao MDL e YC) e fundos de start-up de MDL da NCSU. FC foi apoiado por subsídios do programa de pesquisa de conhecimento para repele de milho da Monsanto (AG/1005) e o National Science Foundation, conceda número MCB-1244772 (MDL). Os autores declaram não interesses concorrentes. FC e MDL concebido e desenhado os experimentos; FC, PW e SP realizaram os experimentos; FC e MDL analisaram os resultados; e FC, NG e MDL escreveram o manuscrito. Agradecemos a Teresa O'Leary, William Klobasa e Stephanie Gorski por sua assistência especializada em triagem WCR. Agradecemos também o Dr. Wade French (USDA-ARS, Laboratório Central de pesquisa agrícola do Norte, Brookings, SD) para remessas de ovos para estabelecer colônias de laboratório e proporcionando a criação de protocolos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
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