Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

Published: April 27, 2018 doi: 10.3791/57497
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Abstract

Rootworm תירס המערבי (WCR) המזיק חשוב של תירס והיא ידועה בשל יכולתו להסתגל במהירות אסטרטגיות ניהול בפשט. למרות התערבות ב RNA (RNAi) הוכיח להיות כלי רב עוצמה עבור לימוד הביולוגיה WCR, יש המגבלות. באופן ספציפי, RNAi עצמו הוא חולף (כלומר לא תגרום לטווח ארוך התורשה של פנוטיפ המשויך), וזה דורש לדעת את רצף ה-DNA של הגן היעד. האחרון יכול להיות הגבלת אם פנוטיפ עניין נשלטת על ידי גנים שנשמרת לקוי, או אפילו רומן, כי זיהוי מטרות שימושי להיות מאתגר, אם לא בלתי אפשרי. לכן, מספר כלים בארגז גנומית של WCR צריך ניתן להרחיב באמצעות פיתוח שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי ליצור זנים מוטציה יציב ולאפשר סקרים עצמאית רצף הגנום WCR. במסמך זה, אנחנו פירוט האמצעים שננקטו כדי לאסוף microinject precellular WCR עוברי עם חומצות גרעין. בעוד הפרוטוקולים המתוארים בזאת מכוונים היצירה של WCR מהונדס, עריכה CRISPR/Cas9-הגנום יכול גם להתבצע תוך שימוש באותם הפרוטוקולים, כאשר ההבדל היחיד הוא ההרכב של הפתרון מוזרק העוברים.

Introduction

תירס המערבית rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, היא הדברה חשובים של תירס1. מעניין, WCR מופיע כדי להתגבר על שליטה מודד במהירות רבה יותר מאשר מזיקים החקלאי ביותר מאז הם לא רק להתאים מבחינה פיזיולוגית, אלא גם בהתנהגותו2,3,4,5, 6. בעשור האחרון, RNA הפרעה (RNAi), כלי רב-עוצמה פונקציונלי גנומית נחקר כשיטה בקרה פוטנציאליים עבור7,WCR8, ו גם שימש כאמצעי ללמוד ג'ין פונקציה9. אולם, בעוד RNAi מבוצע לעתים קרובות על ידי microinjection של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) בחיות אחרות, מבוססת על הזרקת RNAi הוא נדיר WCR. למעשה, ישנם רק כמה דיווחים של RNAi באמצעות microinjection של dsRNA לתוך WCR9. הסיבה היא כי WCR יכולים להשיג גבוהה-רמות של ג'ין תמונות ציפורים באמצעות בליעה של dsRNA7,10, אפילו המתיר את חקר תופעות עובריים מאכילים dsRNA אמא11. בעוד ששיטה זו עושה WCR נושא מצוין עבור אנליזה גנומית פונקציונלית ויה RNAi, זה הואטה ההתקדמות על פיתוח מתודולוגיות עובריים microinjection במין זה.

למרות כוחו של RNAi, ישנם כמה חסרונות. לדוגמה, לא כל הגנים להגיב באותה מידה RNAi. ההשתנות יכול להפוך לפרש את התוצאות של לסיבי assay קשה יותר. בנוסף, RNAi הוא חולף, אינו יוצר מוטציות heritable. מצד שני, germline טרנספורמציה, עוד כלי גנומית תפקודית, ניתן ליצור מוטציות heritable באמצעות החדרת טרנספוזון מסומן לתוך הגנום12,13. זה עושה את השינוי germline כלי מצוין ליצירת זנים מוטציה לשימוש במחקרים גנטיים לטווח ארוך. השינוי יכול לשמש גם כדי להציל מוטציה על ידי מסירת עותק פונקציונלי של הגן הגנום מוטציה14. יתר על כן, השינוי germline היא אבן הפינה של מגוון רחב של טכניקות גנטיות מולקולריות. בנוסף לדפוק ו/או הצלת תפקוד הגן, טרנספורמציה germline יכול לשמש משפר השמנה15, ג'ין השמנה16, המבוסס על Gal4 ביטוי חוץ רחמי17של הגנום כולו מוטגנזה מכוונת18.

לאחרונה, פותחו כלים המאפשרים עריכה מתוחכמת הגנום. כלים אלה כוללים שעתוק Activator-Like אפקטור Nucleases (TALEN), CRISPR/Cas9-נוקלאז מערכת19,20. היתרון של כלים חדשים אלה הוא בכך שהם מציעים החוקרים את היכולת לגרום להפסקה DNA גדילי כפול כמעט בכל מקום בתוך כמעט בכל הגנום. ברגע המושרה, הפסקות אלה ניתן לתקן באמצעות אחד מהקצוות שאינם הומולוגיים הצטרפות, אשר יכול להציג מחיקות או הוספות בגן יישוב, או באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה, אשר בנוכחות לבנות מהונדסים, יכולים לעודד החלפה של גנים כולו או אזורים גנטיים21,22. עם זאת, שיטות אלה דורשים microinjection של ה-DNA, RNA או החלבון לתוך עוברי צעיר מאוד.

חשוב, בניגוד dsRNAs המשמש RNAi, חומצות גרעין וחלבונים המשמשים germline שינוי ועריכה הגנום לא יכול בקלות לחצות קרום התא. לכן, microinjection של פלסמיד DNAs, mRNAs, ו/או חלבונים חייב להתבצע במהלך השלב syncytial blastoderm (דהיינו לפני העובר חרקים cellularizes). זה הופך התזמון של זריקות גורם קריטי. לדוגמה, ב- דרוזופילה melanogaster, העוברים צריך להיות מוזרק בתוך שעתיים אחרי ביצה שכבה12. לפיכך, פיתוח פרוטוקול microinjection עובריים מוצלח עבור WCR חייב לקחת בחשבון את התנאים הטובים ביותר להטלת הביצית, כמו גם השיטה הטובה ביותר לאיסוף כמויות מספיקות של עוברי precellular.

מאמץ להביא מגוון רחב של כלים גנטיים על ביולוגיה WCR דורש פיתוח שיטות איסוף של microinjecting precellular WCR עוברי. כאן אנו מספקים הוראות מפורטות, יחד עם טיפים וטריקים, לעזור לאחרים להשתמש בטכניקות מבוססות-טרנספורמציה במחקר WCR. ומאריכים הטרנסגניים טכנולוגיות כדי WCR לשימוש פונקציונלי גנומית מחקרים, טכניקות אלו מאפשרים גם עוצמה אסטרטגיות שליטה חדשות המזיק כגון גנים נסיעה23,24 ייבדק בזה כלכלית המזיק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. המושבה ברמת לגידול של מבוגרים WCR

  1. בכמות ובאיכות של מבוגרים WCR (500-1000) ממעבדת החברה או מחקר אמין (ראו טבלה של חומרים לדוגמה) ומניחים בתוך כלוב3 30 ס מ.
    הערה: השימוש זן הלא-diapausing מומלץ בחום.
  2. הכנת מזון מלאכותי WCR ע פ הפרוטוקול של היצרן ויוצקים שכבה בעובי של ס מ 1 לתוך מיכל עוז 38 (ראה טבלה של חומרים). לאחר ערבוב, לאחסן דיאטה בשימוש ב 4 ° C עד 2 חודשים.
  3. לשים צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ) עם דיאטה למבוגרים (10-15 גרם) לתוך כלוב3 30 ס מ. הוסף עוד דיאטה כאשר המזון הוא נמוך או יבש.
  4. לשים בקבוקון (300 מ ל) עם מים, מכוסה עם כדור צמר גפן, אשר משמש כדי להחזיק במקום גליל כותנה (6 "x" 3/8), כדי לשמש כמקור מים. להחליף את המים כאשר הוא פועל נמוכה.
  5. לשמור על WCR בטמפרטורה 26 ° C עם 60% לחות, מחזור 14:10 אור חרק חממה לגידול.

2. העובר אוסף ויישור

  1. להפוך תא איסוף ביצים באמצעות אגר 1% במים סטריליים 100 x 15 מ"מ2 פטרי. לאחסן ב 4 ° C לאחר עפור אגר.
  2. לאסוף ביצים הניח שזה עתה, מניחים שכבה אחת של נייר סינון, ואחריו 4 שכבות של גזה (כל חתך לגודל) על פני השטח של אגר (איור 1 א').
    הערה: גזה הניתנים לשימוש חוזר, לאחר שטף של אקונומיקה, בלוק, אבל זה לא הכרחי כדי לעשות את זה עבור השימוש הראשון. נייר סינון לא חוזר, אינו צריך להיות מעוקר.
  3. מניחים ביצה וספרייט לכלוב WCR מאוחר ביום ככל האפשר (בסוף יום העבודה) ולכסות עם אוהל נייר כסף. להשאיר למשך הלילה.
    הערה: נתקל האורות השעות 10:00 לביצה עיכובים 12 בבוקר (14 h) הנחת, למוצא האוסף של הצעיר ביצים עבור microinjection ללא צורך אנשי המעבדה למקם את האוסף קאמרית כלוב מאוחר בלילה.
  4. להסיר תא איסוף ביצים בסביבות 8 או 9 בבוקר
  5. להשתמש מלקחיים לאסוף שכבה 1 של גזה זמן ומקום ב גביע (500 מ"ל) מים. לשטוף ביצים ממני אריג מרושת על ידי בעדינות ערבוב (איור 1B וג 1).
  6. להשתמש על פיפטה הנורה כדי להעביר ביצים עוד גביע (500 מ"ל) מים. חזור על x 2-3 כדי לנקות את הביצים.
  7. להשתמש את הנורה פיפטה להעביר ביצים על גבי נייר סינון (איור 1D) תוך צמצום כמות המים carry-over.
  8. חתוך שחור מסנן נייר לרצועות רחב כמו שקופיות זכוכית ואת הסרט בחוזקה אל השקופית כדי לוודא הנייר מניח שטוח (איור 2 א).
    הערה: נייר סינון שחור מסייע לשפר את הראות תחת המיקרוסקופ על-ידי הפחתת כמות האור המוחזר.
  9. החלת דבק רעיל (לקבלת דוגמה, ראה טבלה של חומרים ) על נייר הסינון של קווים עדינים (איור 2B). שמור את הקווים דבק דק יותר הקוטר של ביצה. כדי להימנע מקבלת את הביצים מצופה דבק.
  10. השתמש במברשת בסדר כדי להניע בעדינות WCR ביצים אחת של נייר סינון שלהם לקו דבק. נסו להניח את הביצים על הדבק לפני וזה מייבש ולשמור על ביצה אחת לפחות של המרחק בין כל ביצה.
  11. למקסם יעילות הזרקת על ידי הצבת מספר שורות של ביצים בשקופית אחת נייר סינון (איור 3).
  12. לאחר כל הביצים נפרסות על נייר הסינון, המתן עד כל שהדבק מתייבש לפני microinjection.
    הערה: שינוי germline ולקבלת הגנום CRISPR/Cas9-מתווכת, עריכה, להזריק כל העוברים עד הצהריים (12 P.M.) כך העובר הבכור הוא בן יותר מ- 19 h. עם זאת, עבור RNAi, יש ללא מגבלה של זמן, כי ב- WCR, dsRNA יכול לעבור בין תאים. למעשה, עבור RNAi, העוברים יישון עשוי להתבטא טוב יותר שיעורי ההישרדות.

3. הכנת פלסמיד DNAs, מחטים הזרקת

  1. להכין דנ א פלסמיד supercoiled באיכות גבוהה תוך שימוש מסחרי ללא אנדוטוקסין קיט (לקבלת דוגמה, ראה טבלה של חומרים ).
  2. כדי להכין את הפתרון הזרקה, לבדוק את ריכוז כל פלסמיד ולאחר מכן לשלב המסייע פלסמיד (250 ריכוז סופי ng/µL), תורם פלסמיד (750 ריכוז סופי ng/µL), מאגר פנול אדום (ריכוז סופי של 20%). מערבולת הפתרון בקצרה, צנטריפוגה במשך 3 דקות במהירות המרבית, כדי לזרז חלקיקים יכול לסתום את המחט.
  3. משוך זכוכית בורוסיליקט מחטים (יתר 1 מ"מ, זיהוי 0.58 מ"מ, 10 ס מ אורך) באמצעות פולר micropipette סוג של חום/הבוערים. לאחסון, לאבטח מחטים משך דו-צדדית קלטת דביק צלחת פטרי או אחרים מיכל ברורה.
    הערה: עבור מערכת פולר micropipette, ההגדרות המשמשות היו: חום = 335, FIL = 4, ול = 40, דל = 200, דופק = 100.
  4. מילוי המחט הזרקת באמצעות מיקרו-העובדים עצה (ראה טבלה של חומרים) כדי pipet 0.5 - 1.0 µL למטה בתוך המחט, ליד הקצה מחודדות. הסר בועות קצה המחט אם כל להתרחש.
  5. הכנס את המחט הזרקה בעל מחט.
  6. פתח את קצה המחט על-ידי שבירת בעדינות עם זוג נאה מלקחיים, או בעדינות לגעת/גרירת הקצה בשקופית coverslip או זכוכית.
    הערה: המטרה היא המזח הקטן ביותר שמאפשר את התמהיל הזרקת לצאת החוצה (פתחים קטנים יותר בדרך כלל דורשות הזרקה בלחץ גבוה יותר). מחטים משופעים ואינם דורשים שלב זה מאז הם כבר פתוחים.

4. microinjection והטיפול שלאחר הזרקה

  1. שימוש במכחול בסדר, בזהירות רטוב המשטח של 1-3 ביצים עם מים סטריליים את המחט, להזריק את הפתרון. להזריק כל ביצה לפני השטח מתייבש. חפשו את המראה כמות קטנה של צבע אדום בתוך ביצים במהלך ההזרקה כדי לציין את microinjection מוצלח. לרסק או להסיר את כל הביצים נראה פגוע, ריק, או אחרת לא יכול להיות מוזרק.
    הערה: למרות הזרקה בלחץ משתנה בהתבסס על גודל נשא מחט, 10-13 psi הוא נקודת התחלה טובה.
  2. לאחר כל הביצים מוזרקים, להסיר את נייר סינון השקופית זכוכית.
  3. מניחים נייר הסינון על פני השטח של צלחת אגר 1% (המתואר לעיל).
  4. השתמש פרפין פלסטיק הסרט החותם את המנה, ותשים חרק 26 ° C לגידול חממה במשך 12 יום.
    הערה: הסרט פרפין תסייע למנוע זיהום עובש בין הצלחות. עם זאת, כל טיפול אחר למניעת התפתחות חיידקים ולעצב יכול להפחית את ההישרדות של העוברים מוזרק.

5. culturing וגדלים של עוברי

  1. הפעלת בדיקת העוברים 12 ימים שלאחר הזרקת עבור הזחלים שזה עתה בקעו ולהמשיך מדי יום במשך השבועיים.
  2. להעביר את הזחלים, בעזרת מברשת בסדר, לתיבת rearing עם נבט התירס ואדמה.
    הערה: עובש יכול לגדול לתוך המנה אגר, אך הזחלים יבקעו עדיין ברוב המקרים. חפשו את הזחלים בזהירות בתוך כייר לתפוס את כולם. הזחלים קצת אולי להעביר המכסה של המנה, אולי נתקע עיבוי.
  3. אחורי הזחלים בטמפרטורה 26 ° C בעקבות תקן WCR לגידול בשיטות25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיקול חשוב בעת פיתוח פרוטוקול זה היה השלב של התפתחות בזמנו של microinjection. באופן ספציפי, טרנספורמציה germline דורש microinjection של DNAs לפני cellularization עובריים. זה בגלל DNAs לא יכול בקלות לחצות את קרום התא. ניסיונות כדי להמחיש את שלבי ההתפתחות עובריים WCR בעזרת כתם גרעיני היו לא מוצלח כי dechorionation של העוברים WCR במהותה מתמוסס כל בקרום מגן אחראי השלמות של העובר. עם זאת, קו חקירה זה היה הללו על ידי קושי נוסף – רכישת כמויות מספיקות של עוברי מבעוד. בשדה, WCR הנקבות מטילות את ביציהן בקרקע, וכך זה צריך להיות לא מפתיע כי במעבדה, הנקבות רק מטילות ביצים בחושך. זה הופך את האוספים בשעות היום קצר (2-4 h) קשה. כדי להתגבר על בעיה זו, זיון הביצה לילה יחיד בוצע, נמצאה להניב כמויות גדולות של העוברים. למרות תהליך איסוף (איור 1), לפרוס (איור 2) העוברים על microinjection הוא קצת מייגעת, אם נעשה במהירות פרוטוקול זה מאפשר microinjection של העוברים שבין 2-19 h הישן בזמנו של הזרקת, ולא שגילן עולה על 24 שעות, אם ההזרקה מתבצעת בהמשך היום. השוואה של פיתוח פעמים בין WCR לבין מינים אחרים מצביע על כך WCR עוברי צריך עדיין להיות precellular 24 h פוסט ביצה שכבה (ראה דיון).

הניסיונות הראשונים germline טרנספורמציה של WCR מעורב הזרקת שיתוף (איור 3) המסייע (מקור transposase), פלסמידים התורם (transposon) לתוך עוברי precellular. הסמן טרנספורמציה של פלסמיד התורם היה גן חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) מונע על ידי יזם צורונים פעילים Tribolium castaneum (אלפא-טובולין יזם26). שיעורי ההישרדות עובריים היו נמוכים (טבלה 1), אבל 26 G0 מבוגרים ששוחזרו. כדי לקבוע אם הרכיב התורם מוכנס לתוך כל תא נבט, G1 עוברי הוקרנו על הביטוי EGFP. למרות רומא פלורסנט אכן זוהו (איור 4), הקרנת WCR עוברי עם מקור אור חזק התבררה קטלני27. הסיבוב הבא של טרנספורמציה germline מנוצל על פלסמיד תורם חדש, אחד אחזקת גנים חלבון פלואורסצנטי אדום (DsRed) מונע על ידי יזם צורונים פעילים דרוזופילה melanogaster (חלבון הלם חום 70 יזם28 ). בעוד שיעורי ההישרדות היו שהשתפר (טבלה 1), מבוגרים ששרדו הפיק רק זחל DsRed-חיוביות יחיד (איור 5). עם זאת, ניסויים אלה היו בעיקר אינפורמטיבי לגבי שני. ראשית, התגלה microinjection הזה גרם לעיכובים בהתפתחות, וכתוצאה מכך המורחבת זמן כדי-. לזה אני קורא. במקום כל העוברים הבקיעה בתוך 2 שבועות, העוברים מוזרק שנרקמה בין microinjection פוסט ימים 12 ו- 26, וכך מצריכים ניטור תקופה ארוכה כדי להבטיח כל הוולדות שנאספו. שנית, זה היה שם לב כי הזחלים סס לאחרונה היו פעילים למדי. . הם זחלו על גבי המכסה איפה מקבל תקוע והם לפעמים ברח מן המנה אגר נושאים אלה היו להתגבר על ידי איטום צלחות פטרי עם סרט פרפין ובדיקת בשלמותם, אגר בקפידה עבור הוולדות.

הגרסה הסופית של פרוטוקול זה הזרקת נבחנה ע י microinjecting WCR עוברי עם מאגר לבד, או עם עוזר ו עין-promotor (3xP329) מסומן התורם DNA פלסמידים. בתור פקד נוספים, קבוצה נוספת של עוברי שטופלו באופן זהה, אבל לא היו microinjected. ארבע קבוצות של עוברי הוזרק גם פתרון הזרקה. סך של עוברי 485 הוזרקו עם מאגר ועל אלה, 148 בקעו (הריבית = 30.5%, טבלה 1). העובר 1,450 הזריק פלסמיד DNAs, בקעו 289 (שיעור = 26.8%). מעניין, העוברים 470 שעברו ביצה-טיפול באותם התנאים, אך ללא microinjection, ורק 250 בקעו (שיעור = 53.2%). כי שיעור ההישרדות של העוברים uninjected הוא 20% גבוה יותר מאשר שיעורי ההישרדות של עוברי מוזרק הוא צפוי בשל הנזק נמנע שנגרם על ידי microinjection. עם זאת, נראה הבדל קטן בין הזרקת מאגר DNA הזרקה, אשר מציע כמות ה-DNA להתווסף מקובל WCR (ראה דיון). תוצאות אלה גם מראים כי שיעורי ההישרדות שיפרה על המאמצים קודמות. להקמתה המוצלחת של קווי הטרנסגניים בשיטה זו היה דיווח במקום27.

Figure 1
איור 1: ביצה אוסף. A) ביצה אוסף קאמרית. B) שכב Zoomed בתצוגה של מקטע של תא ביצה אחרי ביצה 24 שעות ביממה. שימו לב, חיצים מציינים את המיקום של. כמה ביצים. C) שטיפת ביצים את גזה. D) ההעברה הסופית של WCR ביצים. הערה, סוגריים מציינת את האזור עם WCR בצפיפות עוברי (קרי מים מינימלית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הכנת שקופית של הזרקה. A) שחור מסנן נייר מודבקות בחוזקה על שקופית מיקרוסקופ רגיל. B) Zoomed בתצוגה של מקטע של זריקה שקופית בתהליך ההכנה. הערה, חץ #1 מציין המיקום של שורה של ביצים, #2 קו חלקית של דבק ו- #3 ה-pin נעשה שימוש כדי להפיץ את הדבק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הזרקת עוברי. הזרקה שקופיות עם שמונה שורות של ביצים. בגלל הזווית של המחט הזרקה, שורות רצופות של עוברי יכול להיות מוזרק פשוט על ידי הזזת השלב. הערה צבע אדום במחט הזרקת מסייע מאוד ויזואליזציה של הזריקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: G הטרנסגניים1 העובר. עוברי של מבוגר WCR שהיה שותף מוזרק עם piggyBac-מבוסס פלסמידים העוזר ושל התורמים כמו העובר מוקדם. העובר ירוק בהיר הוא חיובי לביטוי משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) וחלקן לא. EGFP הביטוי הוא מונע על ידי יזם Tribolium castaneum אלפא-טובולין 26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: G הטרנסגניים1 זחל. הזחלים 3-לחלל שההורה שלו היה שותף מוזרק עם piggyBac-מבוסס פלסמידים העוזר ושל התורמים כמו העובר מוקדם. הזחל זוהר אדום בצד השמאל הוא חיובי עבור ביטוי DsRed, בעוד הזחל בצד הימין הוא לא. DsRed הביטוי הוא מונע על ידי יזם דרוזופילה melanogaster חום הלם 70 28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ניסוי טיפול ביצים בקעו הריבית
הוצאה #1 ΑtubEGFP-תורם 910 57 6.3%
הוצאה #2 hsp70DsRed-תורם 1580 211 13.4%
הוצאה #3 3xP3EGFP-תורם 1450 389 26.8%
מאגר 485 148 30.5%
לא-הזרקה 470 250 53.2%

טבלה 1: נתוני Microinjection. קווקוו המחירים מ- 3 ניסויים microinjection על העוברים WCR, מציג את המספר הכולל של ביצים מוזרק, המספר הכולל של הזחלים זה בהצלחה בקעו, ואת קצב הפתח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות microinjection של WCR עם dsRNAs לצורך RNAi כבר דווח על9, זהו הפרוטוקול הראשון להקים מומלצות microinjecting precellular WCR עוברי, תהליך קריטי עבור ניצוח germline שינוי ו/או הגנום CRISPR/Cas9 עריכה של מין זה. Microinjection מוצלחת של WCR עוברי הוא תלוי בגורמים רבים, וכן יעילות טרנספורמציה. בהמשך הם בחלק מן הנושאים העיקריים להשפיע על התוצאה של שימוש בפרוטוקול זה לשינוי germline לחיפושית הזאת.

קבלת עוברי precellular
כפי שהוזכר לעיל, ה-DNA לא עובר קרום התא שיכול dsRNA הדרך. משמעות הדבר היא כי יש חשיבות קריטית כי ה-DNA, ה-mRNA, ו/או חלבונים להיות מוזרק לפני cellularization מתרחשת. בגלל העיתוי של הזרקת הוא קריטי, היה חשוב לקבוע חלון סביר עבור microinjection מוצלח מבוסס על מה זמן לוקח nondiapausing WCR זן30 להשלמת מופרה. זה היה מחושב בהתבסס על מחקרים מפורטת העיתוי של השלב syncytial blastoderm חיפושית אחרת, Tribolium castaneum. ב- Tribolium, cellularization מתרחשת שכב ביצה פוסט ~ 8 h ב- 30 מעלות צלזיוס31. מאז לוקח ימים ~3.5 Tribolium כדי להשלים מופרה ב 30 מעלות צלזיוס, cellularization מתקיים עשירית הדרך לתוך התהליך. מאז WCR עוברי לקחת כמעט שבועיים לפתח, cellularization עלולים להופיע עד הביצה פוסט יום השני. לכן, ההנחה היתה כי החלון עבור microinjection מוצלח הוא לפחות 24 שעות ארוכות, אפשרות שימושית, מכיוון WCR דורשים ביצה לילה הנחת לספק כמויות מספיקות של ביצים microinjection. אמנם שיטה זו שימש transgenesis מוצלח27, זה מתקבל על הדעת כי תוצאות יכולים להשתפר על ידי הזרקת עוברי הצעיר, בתנאי טיפול עוברי מוקדם מאוד לא לגרום להם נזק.

איכות ה-DNA, ריכוז
. זה לא מפתיע כי ריכוז ה-DNA ממלא תפקיד מרכזי בשינוי מוצלח. זה זמן רב כבר חשבה כי שמירה על הריכוז הסופי של פלסמיד DNA מתחת 1 מ"ג/מ"ל היה נחוץ למנוע רעילות פוטנציאלית עוברי מוזרק32. למרות זאת הוא עכשיו לא ברור אם בעיות רעילות של העבר היו בגלל ה-DNA עצמו או היו במקום זאת התוצאה של מזהמים כמשימות מתהליך טיהור פלסמיד, הכלל של האגודל היה בנחישות דבקה במשך שני עשורים. עם זאת, לאחרונה התגלה לנו כי חריגה של 1 מ"ג/מ"ל מגבלת לא רק אפשרי, אלא גם שהביטול ניתן להשיג שיעור גבוה יותר של שינוי, שמוביל ספקולציות זה העדר של רעילות ביצה יכול להיות בגלל ההתקדמות ערכות טיהור פלסמיד, וכתוצאה מכך פחות מזהמים. בהתחשב את הזמן הנדרש כדי האחורי WCR, כל עלייה בשיעורי השינוי הוא מועיל, גם אם התוצאה היא שיעורי התמותה הגבוה מעט.

ריכוך ביצת השטח לפני microinjection
בניגוד Tribolium, השטח החיצוני ביותר (chorion) של העובר WCR חייב להיות מרוכך לפני microinjection. זהו שלב קריטי אפילו בעת שימוש במחטים קוורץ. באופן אידיאלי, המים צריך להיות מוחל על עובר יחיד מיד לפני ההזרקה, אך ניתן להחיל על קבוצות של 2-3 העוברים במועד אם microinjection יכול להתבצע לפני chorions reharden. ללא שלב זה, מחטים תיכשל בדרך כלל לחדור את chorion, ובכך לגרום הזרקת הניסיון נכשל ו ולהערך קצה המחט. יתר על כן, אם המחט יקרה לחדור בהצלחה chorion יבש, הפתרון הזרקה בדרך כלל ידלוף בחזרה בשל הלחץ בתוך העובר להיות גבוה יותר ללחץ הסביבתי. היא, לעומת זאת, קל להבחין יבש מעוברים (מרוככת) רטוב. באופן ספציפי, כאשר יבש, העוברים יש נפרדות נוקשה, סיבוב הצורה, בעוד התוספת של מים גורם להן לאבד את המראה הכדורית שלהם. ריכוך לא רק מאפשר את המחט לחדור בקלות את chorion אלא גם מפחית את הלחץ בתוך העובר מספיק זה הפתרון הזרקה לא ידלוף החוצה.

לחות ועובש
עוברי מוזרק מתקיימים בסביבה חם, לח ברחבי מופרה. תנאים אלה לא רק לספק את הסביבה המושלמת להתפתחות WCR אלא גם לקדם הצמיחה של עובש. במהלך תקופה זו שבועיים, עובש לעתים קרובות גדל על המנות אגר דיור העוברים WCR. למרבה הצער, העוברים דורש לחות גבוהה, וכתוצאה ניסיונות כדי לצמצם את זה המחירים נמוכים בהרבה לבקוע. מעניין, הנוכחות של עובש בדרך כלל הייתה השפעה מועטה על הפתח קצבי, עם רוב העוברים הבקיעה ללא בעיות. יתר על כן, טיפולים נגד פטריות הם מזיקים WCR עוברי, לכן הדרך הטובה ביותר להפחית עובש צמיחה שנראה כדי למנוע זיהום; ניקוי כלים, מכולות ומערכת microinjection לפני השימוש, מנסה לשמור את הזמן המושקע microinjecting למינימום היות עובש נבגים ונפוצים בסביבות מעבדה רבות.

מסקנות
פרוטוקול זה נועדה לאפשר לחוקרים יותר להעסיק טכנולוגיות הטרנסגניים במחקר שלהם WCR, בתקווה יסייעו בפיתוח טכנולוגיות מבוססות-transgenics נוספים לשימוש המזיק הזה. מתוחכם מבוסס transgenics ניסויים שנערכו Tribolium העלולים להיות מותאם WCR, כולל מוטגנזה מכוונת33 ו גנום מבוססי CRISPR עריכה34. כי שיטות אלו דורשות microinjection של העוברים precellular, פרוטוקול זה יהיה שימושי לא רק עבור מבוססי transposon תפקודית גנומית מחקרים ו/או CRISPR/Cas9-מתווכת הגנום עריכה אלא גם עבור אסטרטגיות ניהול הדברה מבוססי-גנטיקה 35 , 36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של התוכנית מחקר מונסנטו ידע Rootworm תירס, מעניק מספר AG/1005 (ל MDL, שיקו לוי) וקרנות סטארט-אפ ל MDL מן NCSU. FC נתמכה על ידי מענקים של מונסנטו תירס Rootworm ידע תכנית המחקר (AG/1005), הקרן הלאומית למדע, להעניק מספר MCB-1244772 (MDL). המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים. FC ו- MDL נוצר ועוצב הניסויים; FC, PW ו- SP לבצע את הניסויים; FC ו- MDL ניתח את התוצאות; FC, נג ו- MDL כתב היד. אנו מודים תרזה אולירי, ויליאם Klobasa, סטפני גורסקי על סיוע מומחה שלהם הקרנה WCR. אנו מודים גם ד ר צרפתי וייד (USDA-ARS, צפון מעבדת המחקר החקלאי המרכזי, ברוקינגס, SD) עבור משלוחים ביצים להקים מושבות מעבדה, מתן פרוטוקולי גידול.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Qualitative Filter Paper (Black) Ahlstrom 8613-0900 For egg microinjection
1 oz Containers  Anny's Plastic Tableware ASET101 Egg container
Drosophila Agar Type II Apex 66-103 Substrate for WCR egg-laying dish
Featherweight Forceps  Bioquip 4748 Handling larvae and pupae 
Clorox Regular-Bleach1 Clorox 44600-30770 Wash corn and dishes
Trucker's Favorite Yellow Coor Farm Supply 502 Corn for feeding WCR
Microinjection System (Homemade) NA Parts & instructions available upon request Controls injection pressure (0-20 psi)
Elmer's Non-toxic Glue Elmer's Products, Inc. E304 Glue eggs on filter paper
epTIPS Microloader Tips Eppendorf C2554691 Backfilling needle loading tips
Falcon Tissue Culture Dishes Falcon 25383-103 Sprouting corn /150 x 25 mm
Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles Fisher Scientific S47576C Making agar dish for egg-lay/9cm
Sparkleen Fisher Scientific 04-320-4 Wash dishes
Plain Microscope Slides Fisher Scientific 12-549-3 Holding filter paper and eggs for microinjection
Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute Frontier Agricultural Sciences  F9766B WCR adult artificial diet
Cotton Balls, Large Genesee Scientific 51-101 Close the flask
Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes Globe Scientific 137035 Collect and transfer eggs
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope  Leica M165 FC  WCR screening
DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope Leica DSR Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm
EGFP filter Leica GFP2 Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm
BugDorm MegaView Science DP1000_5P Cage for adult colony
Miniature Paint Brush MyArtscape MAS-102-MINI Liner 2/0 
Joystick Micromanipulator Narishige MN-151 Micromanipulator and needle holder
Microscope XY Stage Olympus 265515 Microscope stage (adapted for use with stereoscope)
Grade 90 Cheesecloth Online Fabric Store CHEE90 For egg-lay
Plastic paraffin film  Pechiney Plastic Packaging PM-996 Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft
Percival Incubator Percival  I41VLH3C8 WCR growing chamber (insect rearing incubator)
Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks VWR 4980-300-PK Water container for adult colony 
Griffin Low Form Beakers VWR 1000-600-PK For egg wash
Braided Cotton Rolls Richmond Dental Cotton Co. 605-3599 Use in water supply for adult colony 
Petri Dishes (35x10mm) SIGMA CLS430588-500EA For diet plates
Phenol Red Sigma 143-78-8 Microinjection buffer
Laser-based Micropipiette Puller Sutter Instrument P-2000/G Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100
Premium Topsoil The Scotts Company 71130758 Soil for cron growing
Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags United States Plastic Corporation 48342 Bag agar dish after microinjection/5x7
Petri Dishes (100x15m) VWR 89038-968 Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm
6 oz Containers Webstaurantstore 128E506 WCR single pair mating chamber 
38 oz Containers Webstaurantstore 128NC888 Larvae rearing box/38 oz
ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container Webstaurantstore 128HRD16 Larvae rearing box/16 oz
Microinjection Scope  Wild Heerbrugg WILD-M8 Microinjection scope outfited with an XY stage
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4 Microinjection needles
Adult Western Corn Rootworms North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory Non-diapase strain Request from Dr. Bryan Wade French's lab
Plasmid DNA Midi Kit Qiagen 12143 Purification of injection-ready plasmid DNAs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
  2. Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).
  3. Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
  4. Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
  5. Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
  6. Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
  7. Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  8. Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
  9. Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162 (2010).
  10. Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
  11. Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
  12. Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
  13. Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
  14. Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
  15. O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
  16. Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
  17. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  18. Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
  19. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  20. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
  21. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  22. Jeggo, P. A. DNA breakage and repair. Adv Genet. 38, 185-218 (1998).
  23. Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
  24. Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
  25. Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
  26. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
  27. Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
  28. Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
  29. Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
  30. Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
  31. Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
  32. Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
  33. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
  34. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
  35. Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11 (2007).
  36. Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).

Tags

בביו-הנדסה בעיה 134 microinjection עובריים גנומיקה תפקודית germline טרנספורמציה transgenesis CRISPR/Cas9 הגנום עריכה תירס המערבי rootworm
Microinjection המערבי תירס Rootworm, <em>Diabrotica virgifera virgifera</em>, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S.,… More

Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing. J. Vis. Exp. (134), e57497, doi:10.3791/57497 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter