Summary
Presentamos aquí protocolos de recogida y microinjecting maíz occidental precellular embriones de gusano de la raíz con el fin de realizar análisis funcional genómica como transformación del germline CRISPR Cas9-genoma de edición.
Abstract
El rootworm occidental del maíz (RGC) es una plaga importante del maíz y es bien conocido por su capacidad para adaptarse rápidamente a estrategias de manejo de plagas. Aunque el ARN de interferencia (ARNi) ha demostrado para ser una poderosa herramienta para estudiar la biología de la región del gran Caribe, tiene sus limitaciones. Específicamente, ARNi sí mismo es transitorio (es decir, no resulta en la herencia mendeliana a largo plazo del fenotipo asociado), y requiere conocer la secuencia de ADN del gen objetivo. Este último puede ser limitante si el fenotipo de interés está controlado por genes mal conservados, o incluso novela, porque sería difícil identificar objetivos útiles, si no imposible. Por lo tanto, debería ampliarse el número de herramientas de herramientas genómicas de RGC por el desarrollo de métodos que podrían utilizarse para crear cepas mutantes estables y activar encuestas independientes de la secuencia del genoma del RGC. En este documento, se detallan los métodos utilizados para recoger y microinject precellular embriones WCR con ácidos nucleicos. Mientras que los protocolos descritos tienen como objetivo la creación de transgénico WCR, CRISPR Cas9-genoma edición podría también realizarse utilizando los mismos protocolos, con la única diferencia es la composición de la solución inyectada en los embriones.
Introduction
Rootworm occidental del maíz (RGC), Diabrotica virgifera virgifera, es una plaga importante del maíz1. Curiosamente, WCR parece superar el control de las medidas más rápidamente que las plagas agrícolas más ya que ellos no sólo adaptan fisiológicamente sino también su comportamiento2,3,4,5, 6. en la última década, ARN de interferencia (RNAi), una poderosa herramienta genómica funcional, ha sido investigada como un posible método de control RCM7,8y también se ha utilizado como un medio para el estudio de la función del gen9. Sin embargo, mientras que el ARNi es realizada con frecuencia por microinyección de ARN bicatenario (dsRNA) en otras especies, ARNi basada en inyección es raro en RGC. De hecho, hay solamente algunos informes de RNAi vía microinyección de dsARN en RGC9. La razón es que RCM puede alcanzar niveles altos de gene precipitación a través de la ingestión de dsARN7,10, permitiendo incluso el estudio de efectos embrionarios de dsRNA de alimentación a la madre11. Mientras que este método hace WCR un excelente tema para análisis genómico funcional mediante RNAi, ha ralentizado el progreso en el desarrollo de metodologías para la microinyección embrionario en esta especie.
A pesar del poder de RNAi, existen algunas desventajas. Por ejemplo, no todos los genes responden igualmente a ARNi. Esta variabilidad puede hacer interpretación de los resultados de un análisis de genómica funcional más difícil. Además, ARNi es transitoria y no genera mutaciones heredables. Por otro lado, la transformación del germline, otra herramienta genómica funcional, puede generar mutaciones heredables mediante inserción de un elemento marcado transponibles en el genoma12,13. Esto hace del germline transformación una excelente herramienta para la creación de estirpes mutantes para el uso en los estudios genéticos a largo plazo. Transformación puede utilizarse también para rescatar una mutación mediante la entrega de una copia funcional del gen a un genoma mutante14. Por otra parte, la transformación del germline es la piedra angular de una gran variedad de técnicas de genética molecular. Además de noquear o rescatar la función del gene, transformación de la línea germinal puede utilizarse para potenciador captura15, gen captura16, Gal4-basado de la expresión ectópica17y genoma mutagénesis18.
Más recientemente, han desarrollado herramientas que permiten la edición del genoma sofisticado. Estas herramientas incluyen la transcripción Activator-Like efectoras nucleasas (jugadores) y el sistema CRISPR/Cas9-nucleasa19,20. La ventaja de estas nuevas herramientas es que ofrecen a los investigadores la capacidad para inducir una rotura de ADN de doble hebra en casi cualquier ubicación a casi cualquier genoma. Una vez inducida, estas roturas pueden repararse a través de ambos extremos no homóloga unirse a, que pueden introducir supresiones o inserciones en el gen específica, o reparación dirigida por homología, que en presencia de una construcción de ingeniería, puede catalizar la reemplazo de genes enteros o regiones genéticas21,22. Sin embargo, estos métodos requieren microinyección de DNA, RNA o proteínas en embriones muy jóvenes.
Lo importante, a diferencia de los dsARNs utilizados para RNAi, ácidos nucleicos y proteínas utilizadas para germline transformación y la edición del genoma no pueden fácilmente cruzar las membranas celulares. Por lo tanto, microinyección de ADN plásmido, mRNAs y proteínas debe ocurrir durante la etapa del blastoderm sincitial (es decir, antes de que el embrión insecto cellularizes). Esto hace que la sincronización de las inyecciones de un factor crítico. Por ejemplo, en Drosophila melanogaster, embriones deban ser inyectado dentro de dos horas después de huevo ponga12. Por lo tanto, el desarrollo de un protocolo exitoso microinjection embrionario para RGC debe tener en cuenta las mejores condiciones para la colocación del óvulo, así como el mejor método para la recolección de suficientes cantidades de embriones precellular.
Un esfuerzo para traer una amplia gama de herramientas genéticas moleculares en biología de la región del gran Caribe requiere desarrollar métodos para la recogida y microinjecting precellular embriones de RGC. Aquí proporcionamos instrucciones detalladas, junto con consejos y sugerencias, para ayudar a otros a utilizar técnicas basadas en la transformación en la investigación de la región del gran Caribe. Además de extender Tecnologías transgénicas a RGC para su uso en estudios de genómica funcional, estas técnicas también permiten potentes nuevas estrategias de control de plagas como gen unidad23,24 a probarse en esta importancia económica plaga.
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Protocol
1. nivel de la colonia de cría de adultos de la región del gran Caribe
- Obtener una cantidad suficiente de los adultos de la región del gran Caribe (500-1.000) de un laboratorio de investigación o empresa confiable (véase Tabla de materiales por ejemplo) y colocar en una jaula de 30 cm3 .
Nota: Se recomienda uso de una cepa no diapausa. - Preparar la dieta artificial WCR siguiendo el protocolo del fabricante y vierta una 1 cm de espesor capa en un recipiente de 38 oz (véase Tabla de materiales). Después de mezclar, guarde dieta sin usar a 4 ° C hasta por 2 meses.
- Poner un plato de Petri (100 x 15 mm) con dieta adultos (10-15 g) en una jaula de 30 cm3 . Añadir más dieta cuando la comida sea baja o seca.
- Coloque un matraz (300 mL) con agua, cubierto con una bola de algodón, que se utiliza para mantener en su lugar un trozo de algodón (6 "x 3/8"), para servir como una fuente de agua. Cambie el agua cuando está baja.
- Mantener la región del gran Caribe a 26 ° C con una humedad de 60% y un 14:10 luz del ciclo de un insecto que se cría la incubadora.
2. alineación y la colección embrionaria
- Hacer una cámara de recogida del huevo utilizando agar al 1% en agua estéril de 100 x 15 mm2 caja de Petri. Almacenar a 4 ° C después de que el agar se solidifica.
- Para recoger los huevos recién puestos, coloque una sola capa de papel de filtro, seguido por 4 capas de Gasa (cada corte a tamaño) en la superficie del agar (figura 1A).
Nota: Estopilla se puede reutilizar, después de ser lavado en lejía y esterilizado, pero no es necesario hacer esto para el primer uso. Papel de filtro no debe ser reutilizado y no necesita ser esterilizado. - Coloque la placa de colección de huevo en jaula de la región del gran Caribe como tarde en el día como sea posible (final de la jornada de trabajo) y cubrir con una carpa de papel de estaño. Dejar durante la noche.
Nota: Tener las luces encendidas de 10:00 a la ponedora de retrasos de 12 de la mañana (14 h), facilitando así la recolección de huevos más jóvenes para microinyección sin necesidad de personal de laboratorio colocar cámara de recogida en jaula por la noche. - Retire la cámara de colección de huevo alrededor de 8 o 9:00
- Use pinzas para recoger 1 capa de estopilla en tiempo y lugar en un vaso de precipitados (500 mL) de agua. Lavar huevos de estopilla agitando suavemente (figura 1B y 1C).
- Use una pipeta de bulbo para transferir huevos otro vaso de precipitados (500 mL) de agua. Repetir 2-3 x para limpiar los huevos.
- Utilizar la pipeta de bulbo para transferir huevos en papel de filtro (figura 1) y reducir al mínimo la cantidad de remanente de agua.
- Cortar papel filtro negro tiras tan amplia como una diapositiva de cristal y cinta firmemente al portaobjetos para asegurarse de que el libro pone plana (figura 2A).
Nota: Papel filtro negro ayuda a mejorar la visibilidad en el microscopio al reducir la cantidad de luz reflejada. - Aplicar pegamento no tóxico (véase Tabla de materiales por ejemplo) para el papel de filtro en las líneas finas (figura 2B). Mantener las líneas de cola más delgada que el diámetro de un huevo para evitar que los huevos con pegamento.
- Utilizar un pincel fino para mover suavemente huevos WCR uno por uno desde su papel de filtro a la línea de pegamento. Trate de poner los huevos sobre el pegamento antes de se seca y mantener la distancia de por lo menos un huevo entre cada huevo.
- Maximizar la eficiencia de la inyección mediante la colocación de múltiples líneas de huevos en la diapositiva de un papel de filtro (figura 3).
- Después de todos los huevos se ponen hacia fuera en el papel de filtro, espere hasta que el pegamento se seque antes de microinyección.
Nota: Para la transformación de la línea germinal y para la edición genómica CRISPR/Cas9-mediada, inyectar todos los embriones al mediodía (12:00) para que el embrión más viejo es viejo no más de 19 h. Sin embargo, para RNAi, hay ninguna limitación de tiempo porque en RGC, dsRNA puede moverse entre células. De hecho, para RNAi, embriones envejecimiento podrían resultar en mejores tasas de supervivencia.
3. preparación de plásmido DNAs y agujas de inyección
- Preparación de ADN plasmídico superenrollado de alta calidad mediante un comercial libre de endotoxina kit (véase Tabla de materiales por ejemplo).
- Para preparar la solución de la inyección, Compruebe la concentración de cada plásmido y luego combinar plásmido helper (concentración final de 250 ng/μL), plásmido donante (concentración final de 750 ng/μL) y buffer de rojo de fenol (concentración final de 20%). Mezclar la solución brevemente y centrifugar durante 3 minutos en velocidad máxima para precipitar partículas que podrían obstruir la aguja.
- Tire las agujas de vidrio borosilicato (O.D. 1 mm I.D. 0,58 mm, longitud 10 cm) usando un extractor de micropipeta tipo llamas/marrón. Para el almacenamiento, asegurar agujas tiradas sobre la cinta adhesiva de doble cara en una placa de Petri u otro recipiente transparente.
Nota: Para el sistema de tirador de la micropipeta, los valores utilizados fueron: calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Relleno la aguja de inyección utilizando un cargador de micro punta (véase Tabla de materiales) de pipetear 0,5 - 1,0 μL abajo dentro de la aguja, cerca de la punta cónica. Elimine las burbujas de la punta de la aguja si se produce alguna.
- Inserte la aguja en el portaagujas.
- Abra la punta de la aguja rompiendo suavemente con un buen par de pinzas, o tocar/arrastrando suavemente la punta sobre el portaobjetos cubreobjetos o vidrio.
Nota: La meta es que la abertura más pequeña que permite la mezcla de inyección volver a salir (las aberturas más pequeñas generalmente requieren mayor presión de inyección). Agujas biseladas no requieren este paso puesto que ya están abiertas.
4. microinyección y el cuidado después de la inyección
- Con un pincel fino, humedezca la superficie de 1-3 huevos con agua estéril con cuidado Inserte la aguja e inyectar la solución. Inyectar cada huevo antes de que se seque la superficie. Busque la aparición una pequeña cantidad de color rojo dentro de huevos durante la inyección para indicar que la exitosa microinyección. Aplastar o eliminar los huevos que parecen dañados, vacío, o de lo contrario no inyectar.
Nota: Aunque la presión de la inyección varía dependiendo de tamaño de alesaje de la aguja, 10-13 psi es un buen punto de partida. - Después se inyectan todos los huevos, quitar el papel de filtro de lo portaobjetos de vidrio.
- Coloque el papel de filtro sobre la superficie de un plato de agar al 1% (ver arriba).
- Use película de parafina plástico para sellar el plato y poner en un insecto de 26 ° C la incubadora de cría durante 12 días.
Nota: La película de parafina le ayudará a evitar la contaminación del molde entre platos. Sin embargo, cualquier otro tratamiento para prevenir el crecimiento de bacterias y moho podría reducir la supervivencia de los embriones inyectados.
5. cultivo e incubación de embriones
- Iniciar control de embriones 12 días después de la inyección para las larvas recién nacidas y continuar diariamente durante 2 semanas.
- Transferencia de larvas, utilizando un pincel fino, a una caja de cría con germinado de maíz y el suelo.
Nota: Molde podría crecer en el plato de agar, pero las larvas eclosionan aún en la mayoría de los casos. Busque larvas cuidadosamente en el molde para cogerlos todos. Algunas larvas pueden pasar a la tapa del plato y pueden atascarse en la condensación. - Posterior de las larvas a 26 ° C siguiendo el estándar WCR cría métodos25.
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Representative Results
Una consideración importante en el desarrollo de este protocolo fue la etapa del desarrollo embrionario en el momento de microinyección. Transformación del germline requiere específicamente, microinyección de ADN antes de la cellularization embrionaria. Esto es porque el ADN no puede cruzar fácilmente las membranas celulares. Para visualizar las etapas del desarrollo embrionario de la región del gran Caribe mediante una tinción nuclear las tentativas eran fracasadas porque dechorionation de embriones WCR esencialmente disuelve todas las membranas de protección responsables de la integridad del embrión. Sin embargo, esta línea de investigación fue suplantada por otra dificultad – adquirir suficientes cantidades de embriones de manera oportuna. En el campo, RGC las hembras depositan sus huevos en el suelo, por lo tanto no debería ser ninguna sorpresa que en el laboratorio, las hembras sólo ponen huevos en la oscuridad. Esto dificulta la colecciones de día corto (2-4 h). Para resolver este problema, una endecha de huevo durante la noche solo se realizó y fue encontrada para producir grandes cantidades de embriones. Aunque el proceso de recolección (figura 1) y colocación de los embriones (figura 2) para microinyección es algo laborioso, si se hace rápidamente este protocolo permite la microinyección de embriones que son entre 2-19 h en el momento de la inyección y no más de 24 h si las inyecciones se realizan durante el día. Comparación de tiempos de desarrollo entre la región del gran Caribe y otras especies sugiere que embriones RGC deben estar precellular a las 24 h post huevo endecha (véase discusión).
Los primeros intentos de transformación del germline de WCR habían implicado coinyección (figura 3) de plásmidos de donantes (transposón) y ayudante (transposasa fuente) en embriones precellular. El marcador de la transformación para el plásmido donante era un gen de la proteína verde fluorescente (EGFP) impulsado por un promotor constitutivo activo de Tribolium castaneum (alfa-tubulina promotor26). Las tasas de supervivencia embrionaria fueron bajos (tabla 1) y 26 G0 adultos se recuperaron. Para determinar si el elemento de donante inserta en las células de germen, G1 embriones fueron evaluados para la expresión de EGFP. Aunque de hecho fueron identificado progenie fluorescente (figura 4), investigación embriones WCR con la fuente de luz intensa demostró para ser letal27. La próxima ronda de la transformación del germline utilizó un nuevo plásmido donante, uno que posee un gen de la proteína fluorescente roja (DsRed) impulsado por un promotor constitutivo activo de Drosophila melanogaster (promotor de laproteína de choque térmico 70 28 ). Mientras que las tasas de supervivencia fueron que mucho mejor (tabla 1), los sobrevivientes adultos produjeron solamente una sola larva DsRed-positivos (figura 5). Sin embargo, estos experimentos eran particularmente informativos en dos cuanto. En primer lugar, se descubrió que microinyección causado retrasos en el desarrollo, dando lugar a una prolongado tiempo a portilla. En lugar de incubar dentro de 2 semanas todos los embriones, embriones inyectados nacieron entre 12 y 26 días post microinyección, así requiriendo un período prolongado de seguimiento para todas sus crías obtuvieron. En segundo lugar, se observó que las larvas recién nacidas estaban bastante activas. Ellos se arrastró sobre la tapa de donde se consigue pegados y a veces escapados del plato de agar. Estos problemas fueron superados por sellado de placas de Petri con una capa de parafina y examinar las tapas y agar cuidadosamente para sus crías.
La versión final de este protocolo de inyección fue probada por microinjecting embriones WCR con buffer solo o con ayudante y ojo-promotor (3xP329) marcado de plásmidos de ADN del donante. Como un control adicional, otro conjunto de embriones se manejaron idénticamente pero no fueron microinyectados. Cuatro juegos de los embriones fueron inyectados con cualquier solución de la inyección. Un total de 485 embriones fueron inyectados con el almacenador intermediario y de esos, 148 tramada (tipo escotilla = 30.5%, tabla 1). De 1.450 embriones inyectados con el plásmido DNAs, 289 tramada (tasa = 26,8%). Curiosamente, de los 470 embriones que experimentaron las mismas condiciones de manejo de huevo, pero sin microinyección, sólo 250 tramada (tasa = 53,2%). Que la tasa de supervivencia de los embriones uninjected es 20% mayor que las tasas de supervivencia para los embriones inyectados es de esperarse debido a los daños inevitables causados por microinyección. Sin embargo, se observa poca diferencia entre inyección de buffer y la inyección de ADN, que indica la cantidad de ADN que se agrega es aceptable para la región del gran Caribe (ver discusión). Estos resultados también muestran que las tasas de supervivencia mejoraron sobre esfuerzos anteriores. Establecimiento exitoso de líneas transgénicas utilizando este método ha sido divulgado a otra parte27.
Figura 1: colección de huevos. A) cámara de recogida del huevo. B) Zoomed-en vista de una sección de una cámara de huevo después de 24 h huevos pone. Tenga en cuenta que las flechas indican la ubicación de algunos huevos. C) lavar huevos de estopilla. D) el traslado definitivo de los huevos de la región del gran Caribe. Nota, soporte indica la región densamente embriones de RGC (es decir, mínimo de agua). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: preparar una diapositiva de inyección. A) negro filtro de papel pegadas firmemente a un portaobjetos de microscopio estándar. B) Zoomed-en vista de una sección de una inyección se deslice durante el proceso de preparación. Nota #1 la flecha indica la ubicación de una hilera de huevos, línea parcial #2 de pegamento y #3 el perno usado para extender el pegamento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: inyectando embriones. Una diapositiva de inyección con ocho filas de huevos. Debido al ángulo de la aguja de inyección, filas sucesivas de embriones se pueden inyectar simplemente moviendo el escenario. Nota el tinte rojo en la aguja de inyección mucho ayuda a la visualización de la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Embrión de1 G transgénicos. Embriones de un adulto de la región del gran Caribe que era co-inyección con piggyBac-basado ayudante y donante plásmidos como un embrión. El embrión de verde brillante es positivo para la expresión de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) mientras que los otros no son. Expresión de EGFP es impulsado por el promotor de Tribolium castaneum alfa-tubulina 26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Larva de1 de transgénicos G. larvas de 3er estadio cuyo padre fue co-inyección con piggyBac-basado ayudante y donante plásmidos como un embrión. La larva que brilla intensamente rojo de la izquierda es positiva para la expresión de la DsRed, mientras que la larva de la derecha no es. Expresión DsRed es impulsado por el promotor de choque de Drosophila melanogaster térmico 70 28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Experimento | Tratamiento | Huevos | Tramada | Tasa de Portilla |
| Exp. #1 | ΑtubEGFP-donante | 910 | 57 | 6.3% |
| Exp. #2 | hsp70DsRed-donante | 1580 | 211 | 13.4% |
| Exp. #3 | 3xP3EGFP-donante | 1450 | 389 | 26,8% |
| Tampón de | 485 | 148 | 30,5% | |
| Inyección de no | 470 | 250 | 53,2% |
Tabla 1: datos de microinyección. Tarifas de tres experimentos de microinyección en embriones de RGC, mostrando el número total de huevos inyectados, el número total de larvas que nacieron con éxito y la tasa de portilla de la portilla.
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Discussion
Aunque microinyección de WCR con dsRNAs para RNAi ha reportado9, este es el primer protocolo para establecer las mejores prácticas para microinjecting precellular embriones de la región del gran Caribe, un proceso crítico para llevar a cabo la transformación del germline o CRISPR/Cas9 genoma de esta especie. Exitosa microinyección de embriones WCR es dependiente en muchos factores, como es la eficiencia de transformación. A continuación algunos de los principales problemas afectan el resultado de utilizar este protocolo para la transformación del germline en este escarabajo.
Obtención de embriones precellular
Como se mencionó anteriormente, ADN no cruza las membranas celulares que el dsRNA forma puede. Esto significa que es de vital importancia que DNA, mRNA y las proteínas se inyecta antes de cellularization. Porque la sincronización de inyección es crítica, es importante determinar una probable ventana para microinyección exitoso basado en el tiempo que tarda el nondiapausing RGC cepa30 para completar la embriogénesis. Esto se calculó con base en estudios detallados de la fecha de la etapa del blastoderm sincitial en otro escarabajo, Tribolium castaneum. En Tribolium, cellularization ocurre ~ 8 h post huevo pone a 30 ° C31. Puesto que él lleva días ~3.5 para Tribolium embriogénesis completa a 30 ° C, cellularization ocurre una décima parte de lo que en el proceso. Embriones de la región del gran Caribe tiene casi 2 semanas para desarrollar, cellularization no puede ocurrir hasta que pone el segundo huevo de post del día. Por lo tanto, se suponía que la ventana para microinyección exitoso es por lo menos 24 horas de largo, que es útil, ya que requieren de WCR ponedora durante la noche para proporcionar suficientes cantidades de huevos para microinyección. Mientras que este método fue utilizado para la transgénesis éxito27, es concebible que resultados podrían mejorarse inyectando embriones más jóvenes, siempre manejo de embriones muy tempranos no les causa daño.
Concentración y calidad de ADN
No es sorprendente que concentración de ADN juega un papel fundamental en la transformación exitosa. Durante mucho tiempo se ha pensado que era necesario para evitar la potencial toxicidad para los embriones inyectados32manteniendo la concentración final de ADN de plásmido por debajo de 1 mg/mL. Aunque ahora no está claro si los problemas de toxicidad del pasado eran debido a la DNA sí mismo o por el contrario eran el resultado de contaminantes de los procesos de purificación del plásmido, esta regla ha sido firmemente adherido a para dos décadas. Sin embargo, recientemente hemos descubierto que más de 1 mg/mL límite era no sólo posible, sino que hacerlo puede lograr mayores tasas de transformación, llevando a especulaciones de que la ausencia de toxicidad de huevo puede ser debido a los avances en equipos de purificación del plásmido, dando por resultado menos contaminantes. Teniendo en cuenta el tiempo necesario para la posterior WCR, cualquier aumento en las tasas de transformación es útil, aunque resulta un poco más altos índices de mortalidad.
Ablandamiento de la superficie del huevo antes de microinyección
A diferencia de Tribolium, la superficie más externa (corion) de un embrión de RCM debe ser ablandada antes de microinyección. Este es un paso crítico, incluso cuando se utiliza agujas de cuarzo. Idealmente, agua debe aplicarse a un solo embrión inmediatamente antes de la inyección, pero se puede aplicar a grupos de 2 a 3 embriones a la vez si microinyección puede lograrse antes de chorions reharden. Sin este paso, las agujas generalmente no podrá penetrar en el corion, causando así el intento de inyección falle y potencialmente dañar la punta de la aguja. Por otra parte, si la aguja pasa a penetrar con éxito un corion seco, la solución de la inyección por lo general sale detrás debido a la presión dentro el embrión es mayor que la presión ambiente. Sin embargo, es fácil distinguir seco mojado embriones (blanda). Específicamente, cuando se seque, embriones tienen un distinto rígida, forma redonda, mientras que la adición de agua les hace perder su aspecto esférico. Ablandamiento no sólo permite la aguja fácilmente penetrar en el corion pero también reduce la presión dentro el embrión suficientemente que la solución de la inyección no se escapa hacia fuera.
Humedad y moho
Los embriones inyectados se llevan a cabo en un ambiente cálido y húmedo a lo largo de la embriogénesis. Estas condiciones no sólo proporcionan el ambiente perfecto para el desarrollo de la región del gran Caribe sino también promoción el crecimiento de moho. Durante este período de dos semanas, el moho crece con frecuencia en los platos de agar vivienda los embriones de la región del gran Caribe. Desafortunadamente, los embriones requieren alta humedad e intenta reducirla dio lugar a tasas mucho menores de la portilla. Interesante, la presencia del molde tenía generalmente poco impacto en las tasas de la portilla, con más embriones tramar sin problemas. Por otra parte, tratamientos antimicóticos son perjudiciales para embriones de la región del gran Caribe, por lo que la mejor manera de reducir el crecimiento de moho parece ser para evitar la contaminación; limpieza de herramientas, recipientes y sistema de microinyección antes de su uso y tratando de mantener el tiempo de microinjecting al mínimo ya que las esporas de moho son frecuentes en ambientes de laboratorio.
Conclusiones
Este protocolo está diseñado para permitir que más investigadores a emplear tecnologías transgénicas en su investigación de la región del gran Caribe y que ayudará en el desarrollo de tecnologías adicionales de transgénicos para su uso en este insecto. Sofisticados basados en transgénicos experimentos en Tribolium podrían ser adaptados para la región del gran Caribe, incluyendo mutagénesis33 y genoma basado en CRISPR edición34. Porque estas técnicas requieren de microinyección de embriones precellular, este Protocolo será útil no sólo para estudios de genómica funcional basado en el transposón o CRISPR/Cas9-mediada por la edición del genoma sino también para estrategias de manejo de plagas basadas en genética 35 , 36.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una beca del programa de investigación de Monsanto maíz Rootworm conocimiento, conceder fondos de puesta en marcha y número AG/1005 (para MDL y YC) a MDL de NCSU. FC fue apoyado por becas del programa de investigación de Monsanto maíz Rootworm conocimiento (AG/1005) y la National Science Foundation, grant número MCB-1244772 (para MDL). Los autores declaran a no hay intereses contrapuestos. FC y MDL concibieron y diseñado los experimentos; FC, PW y SP realizan los experimentos; MDL y analizaron los resultados; y FC, NG y MDL escribieron el manuscrito. Agradecemos a Teresa O'Leary, William Klobasa y Stephanie Gorski por su ayuda experto en investigación de la región del gran Caribe. También agradecemos a Dr. Wade French (USDA-ARS, Laboratorio Central de investigación agrícola del norte, Brookings, SD) para los envíos de huevos para establecer colonias de laboratorio y proporcionar protocolos de cría.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
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