Summary
Insan embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenilemek ve vücudun tüm hücre tipleri içine ayırt yeteneği ve geliştirme ve hastalık temel sorulara yanıt için bir araştırma aracı olarak hem tıbbi uygulamalar için çok ümit vericidir. Burada, embriyoların iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu ile insan embriyonik kök hücrelerin derivasyon için bir özlü, adım adım protokolü sağlar.
Abstract
Insan embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenilemek ve vücudun tüm hücre tipleri içine ayırt yeteneği ve geliştirme ve hastalık temel sorulara yanıt için bir araştırma aracı olarak hem tıbbi uygulamalar için çok ümit vericidir. Burada, embriyoların iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu ile insan embriyonik kök hücrelerin derivasyon için bir özlü, adım adım protokolü sağlar.
Protocol
Insan embriyonik kök (HES) hücre derivasyon için kullanılan Dondurulmuş insan embriyolarını uygun bilgilendirilmiş onam, Harvard Üniversitesi'nde komitesi ve insan denekler üzerinde embriyonik kök hücre araştırmaları gözetim komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır araştırma protokol çerçevesinde aşağıdaki araştırma için bağışlandı .
Aşağıda yazılı bir protokol Cowan ve arkadaşları tarafından yayınlanan parametreler üzerine dayanır. 2004, hafif değişiklikler.
Embriyo Kültürü
Quinn Advantage çözülme Kit ve kültürünün geliştirilmesine kadar genişletilmiş blastosist aşamasına kadar,% 15 Plasmanate ile desteklenmiş Küresel orta damla kullanarak insan embriyolarının çözülme.
Iç hücre kütlesinden Immunosurgery tabanlı izolasyon
Hazırlanması:
- 10cm plakaları her çözüm damla kurarak, zona pellusida ve immunosurgery kaldırılması plakaları (aşağıya bakın) hazırlayın. Buharlaşmasını önlemek için mineral yağ ile Yerleşimi. Derivasyon için tasarlanmıştır embriyo başına tek bir satır hazırlayın.
- EmbryoMax Asidik Tyrodes olduğu gibi kullanın.
- embriyonik kök hücre türetme medya: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum Yedek,% 10 Plasmanate,% 2.5 ES hücre test fetal sığır serumu (FBS), 2mm Glutamax-I,% 1 non-esansiyel amino asitler, 50 adet / ml penisilin, 50μg/ml streptomisin, 0.055mM b-merkaptoetanol 5ng/ml bFGF.
- Tavşan anti-insan kırmızı kan hücre birincil antikor, üretici firmanın önerisi, embriyonik kök hücre türetme medya ile 01:10 seyreltilmiş doğrultusunda sulandırılmış.
- Gine domuzu tamamlayıcı serum, üretici firmanın önerisi, embriyonik kök hücre türetme medya ile 01:10 seyreltilmiş doğrultusunda sulandırılmış.
- 37 ° C doku kültürü inkübatör kullanmadan önce bütün plakaları dengelenmesi.
- Embriyolar transfer olarak kullanmak için 50μl 100μl kapiller pipetler (VWR) çekin. Elmas kalem ve 0.2μm filtresi ile donatılmış ağız pipet tüp kullanımı ile biter kesin.
Immunosurgery Prosedürü:
Notlar:
- Bu prosedürde, trophectoderm hücreleri, kompleman aktivitesi ile tandem insan hücrelerine karşı antikorlar yönettiği kısa maruz kalma yok. Bu nedenle blastosist sadece yapısal bütünlüğünü de immünolojik reaksiyon duyarlı olmaktan ICM engeller olarak, protokol, sağlam bir trophectoderm yüksek kaliteli embriyolar ile en iyi şekilde çalışır.
- Tüm işlemler, ısıtılmış tabla ile donatılmış bir diseksiyon kapsamı kullanılarak yapılan.
Adımlar:
- Embriyoların yapışmasını önlemek için FBS ile embriyo transferi için kullanılan ağız pipet durulayın.
- Kültür çanak çanak AT embriyonik kök tutarak açılan blastokist transferi.
- Embriyonik kök damla damla AT serisi ile blastokist transferi prosedürü başlayın. Üçüncü açılan zona pellusida (genellikle 5-30 saniye) kapatılması için izleyebilirsiniz. Aşırı tedavi veya embriyonun bütünlüğünü değil dikkatli olun bozulabilir.
- Embriyonik kök hücre türetme medya dizi transfer blastosist AT durulayın düşer. Medya ile pipet Preloading hemen tepki AT nötralize etmek için tavsiye edilir. Tüm işlenmiş AT kadar blastosist burada tutulabilir.
- 37 30 dakika inkübasyon için üçüncü damla ° C doku kültürü inkübatörde bırakarak, primer antikor damla dizi blastokist transferi.
- Embriyonik kök hücre türetme medya dizi transfer blastosist birincil durulayın düşer.
- Trophectoderm hücrelerinin parçalanması izlemek için üçüncü bir damla bırakarak, tamamlayıcı damla dizi blastokist transferi. Lyse olarak trophectoderm hücrelerinin "köpüren" için sahnede ilk 30 saniye boyunca blastosist uyun. Lizis bu zaman dilimi içinde görülürse, tamamlanıncaya kadar tepki izlemek için mikroskop sahnede çanak tutmak. Ilk 30 saniye boyunca hiçbir köpüren görülürse trophectoderm çoğu parçalanmış kadar her 5 dakikada bir kontrol, inkübatör dönmek. Bu 5-15 dakika alabilir. Reaksiyon zamanı ve iç hücre kütlesi potansiyel zararı en aza indirmek için yakın reaksiyon izleyin.
- Transferi blastosist embriyonik kök hücre türetme medya dizi tamamlayıcı faaliyet yıkayın düşer.
- Blastosist (10μl VWR kılcal tüpler çekilmiş) biraz daha küçük bir çapa sahip cam pipet kullanarak, parçalanmış trophectoderm en uzak şerit aşağı blastosist çizmek ve.
g "alt =" 574_Figure-0 "width =" 577 "height =" 270 "/> - Levha ICM mitotik olarak inaktive edilmiş fare embriyo fibroblastlar (MEFS) besleyici hücreler üzerine izole. MEFS türetme bir gün önce hazırlanan ve embriyonik kök hücre türetme medya gün açık olmalıdır. 4-Nunc yemekleri türetme ilk adımlar için iyi çalışır.
- İlk 1-2 gün için tabak Rahatsız etmeyin. Bundan sonra, embriyonik kök hücre kolonileri (1-2 hafta içinde genellikle belirgin) akıbet için günlük olarak kontrol edin. Medya her gün 3 gün başında yarım cilt olarak değiştirilmesi gerekir.
ES hücre akıbet ve Pasajlanması
Embriyonik kök hücre akıbet yaklaşık 0,5 mm veya daha fazla ulaştığında, mekanik seçerek genişlemesi için hazırdır.
- Mekanik akıbet yarısı dağıtmak ve taze besleyiciler içeren yeni plakalar transfer. Embriyonik kök hücre kümeleri her biri yaklaşık 30-50 hücreleri olmalıdır. Back-up ilk geçiş (p1) olarak akıbet diğer yarısı bırakın. Genişletmeye devam ediyor akıbet (p0) birkaç kez alınabilir.
- İkincil koloniler benzer dağınık ve yeni hücre hatları enzimatik tripsin ile Pasajlanması adapte edilebilir pasajlar bu süre 3-5 kadar büyük kültür yemekleri arasında açılabilir. ES hücre farklılaşması en aza indirmek için, kültür medya serum içeriği de yavaş yavaş bu ilk geçişleri sırasında% 1 ve% 0 olmalıdır.
- Tüm kurulan embriyonik kök hücre hatları erken pasajların bir kısmı aşağı gelecek genişlemeler için dondurularak banked olmalıdır.
- Buna ek olarak, her bir hücre hattı karyotip analizi ile karakterize edilebilir ve in vitro ve in vivo pluripotency ve farklılaşma çalışmalar tarafından doğrulandığı.
Discussion
Burada sunulan protokol ile araştırmacılar sağlar, özlü, kolay iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu insan embriyonik kök hücre hatları elde etmek için nasıl ana hatları takip edin.
Acknowledgments
AEC Tıbbi Araştırma ve Merck Araştırma Laboratuvarları Jane Tabut Childs Memorial Fonu bir adam. Biz deneysel danışma ve tartışma, D. Egli ve C. Cowan teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quinn’s Advantage Thaw Kit | Sage | ART-8016 | |
| Global medium | Life Global | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax Acidic Tyrodes | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KO-Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| ES cell-tested fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Recombinant human basic fibroblast growth factor | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| Rabbit anti-human red blood cell primary antibody | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| Guinea-pig complement serum | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes | VWR international | ||
| Mouth pipettes with tubing | VWR international | supplied with capillary pipettes from VWR | |
| 0.2 microm Acrodisc syringe filter | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| Tissue culture dishes | VWR international | ||
| Tissue culture dishes | Nalge Nunc international | ||
| Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (E12.5) |
References
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
