Kalium ioner bidrar til hvile membran potensialet i celler og ekstracellulære K+ konsentrasjon er en viktig regulator av mobilnettet excitability. Beskriver vi hvordan å gjøre, kalibrere og bruke monopolar K+-selektiv microelectrodes. Med slike elektrodene kan måling av elektrisk vakte K+ konsentrasjon dynamikk i voksen hippocampus skiver.
Kalium ioner betydelig bidrar til hvile membran potensialet i celler, og derfor ekstracellulære K+ konsentrasjon er en viktig regulator av cellen excitability. Endret konsentrasjoner ekstracellulære K+ påvirker hvile membran potensial og mobilnettet excitability av skiftende likevekt mellom lukket, åpen og deaktivert for spenningen-avhengige ionekanaler som ligger til grunn for handlingen potensial initiering og gjennomføring. Derfor er det verdifullt å måle direkte ekstracellulære K+ dynamikk i helse og syke tilstander. Her beskriver vi hvordan å gjøre, kalibrere og bruke monopolar K+-selektiv microelectrodes. Vi satt dem i voksen hippocampus hjernen skiver å måle elektrisk vakte K+ konsentrasjon dynamics. Forstandig bruk av slike elektrodene er en viktig del av verktøysett for å evaluere mobilnettet og Biofysiske mekanismer som styrer ekstracellulære K+ konsentrasjoner i nervesystemet.
Kalium ion konsentrasjoner er strengt regulert i hjernen, og deres svingninger utøver en mektig innflytelse på hvile membran potensialet i alle celler. I lys av disse viktige bidrag er et viktig mål for biologi å fastslå mobilnettet og Biofysiske mekanismene som brukes til å regulere tett konsentrasjonen av K+ på ekstracellulære plass i ulike organer av kroppen1 , 2. et viktig krav i disse studiene er muligheten til å måle K+ konsentrasjoner nøyaktig. Selv om mange komponenter som bidrar til kalium homeostase i hjernen i friske og syke tilstander har blitt identifisert3,4,5, har ytterligere fremgang blitt redusert på grunn av spesialiserte natur forbereder ion selektiv microelectrodes for kalium måling. Microelectrode sensorer representerer gullstandarden for måling K+ konsentrasjoner i vitro, vev skiver og i vivo.
Nyere metoder for K+ overvåking er under utvikling med optiske sensorer, men dette ikke oppdager en biologisk relevante utvalg av K+ konsentrasjoner eller har ikke blitt fullt sjekket i biologiske systemer, selv om resultatene vises lovende6,7,8. Sammenlignet med optiske sensorer, er microelectrodes fundamentalt begrenset til en kilde måling av ioner, selv om elektroden matriser kan forbedre romlig oppløsning9. Denne artikkelen fokuserer på enkelt-barreled microelectrode sensorer for å overvåke K+ dynamics.
I dette arbeidet vi rapporterer detaljert gradvis prosedyrer å gjøre K+ selektiv microelectrodes, med en valinomycin-baserte kalium ionophore som tillater svært selektive (104 brett K+ å Na+ selektivitet) K+ bevegelse over membraner10. En naturlig forekommende polypeptid, valinomycin fungerer som en K+ gjennomtrengelig pore og forenkler flyten av K+ ned den elektrokjemiske gradering. Vi beskriver hvordan å kalibrere elektrodene, lagre og bruke dem og til slutt hvordan du distribuerer dem til å måle K+ konsentrasjon dynamikk i akutt hippocampus hjernen skiver fra voksne mus. Bruk av slike elektroder med genmodifiserte mus som mangler spesifikke ionekanaler foreslått å regulere ekstracellulære K+ dynamics skal avsløre de cellulære mekanismene brukes av nervesystemet for å kontrollere ambient konsentrasjonen av K + i ekstracellulære miljøet.
Metoden som beskriver vi her har tillatt oss å vurdere K+ dynamics svar på elektrisk stimulering av Schaffer collaterals i akutt hippocampus skiver fra voksne mus. Vår metode for å forberede K+ ion selektive microelectrodes ligner på tidligere beskrevet prosedyrer12,13,14,15. Denne metoden har imidlertid fordeler over alternative elektrode konfigurasjoner i at det er …
The authors have nothing to disclose.
Khakh lab ble støttet av NIH MH104069. Mody laboratoriet ble støttet av NIH NS030549. J.C.O. takk NIH T32-Grant(NS058280) for trening av Neural Microcircuits.
Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
Microscope | Olympus | BX51 | |
Electrode puller | Sutter | P-97 | |
Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
Patch computer | Dell | n/a | |
Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
D-glucose | Sigma | G7528 | |
Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |