Summary
칼륨 이온은 세포의 휴식 막 잠재력에 기여 하 고 extracellular K+ 농도 세포 흥분의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 우리가 확인 하 고, 보정 하 고 monopolar K+를 사용 하는 방법을 설명-선택 microelectrodes. 같은 전극을 사용 하 여 성인 hippocampal 조각 전기 evoked K+ 농도 역학 측정 수 있습니다.
Abstract
칼륨 이온이 세포의 휴식 막 잠재력에 크게 기여 하 고, 따라서, extracellular K+ 농도 세포 흥분의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 활동 전위의 기반이 되는 전압 종속 이온 채널에 대 한 폐쇄, 오픈 및 비활성 상태 사이 평형 이동 하 여 휴식 막 잠재력과 세포 흥분 extracellular K+ 영향의 농도 변경 개시와 전도 따라서, 그것은 extracellular K+ 역학 건강 및 질병 상태를 직접 측정 하는 중요 한입니다. 여기, 우리가 확인 하 고, 보정 하 고 monopolar K+를 사용 하는 방법 설명-선택 microelectrodes. 우리는 전기 evoked K+ 농도 역학 측정 hippocampal 뇌 조각에 그들을 배포. 이러한 전극의 사리 분별이 사용 신 경계에 extracellular K+ 농도 제어 하는 세포와 생물 메커니즘을 평가 하는 데 필요한 도구 키트의 중요 한 부분 이다.
Introduction
칼륨 이온 농도 두뇌에 긴밀 하 게 규제 하 고 그들의 동요는 모든 세포의 휴식 막 잠재력에 강력한 영향을 발휘. 이러한 중요 한 공헌에 비추어 생물학의 중요 한 목표는 시체1 의 다른 장기에서 세포 외 공간에서 단단히 K+ 의 농도 조절 하는 데 사용 되는 셀룰러 및 생물 메커니즘을 결정 하는 , 2. 이러한 연구에 중요 한 요구는 K+ 농도 정확 하 게 측정 하는 능력. 건강 하 고 병에 걸린 상태에서 뇌의 칼륨 항상성에 공헌 하는 많은 구성 요소 식별된3,,45, 있다 지만 더 진행 되었습니다 둔화의 특성 상 전문 이온 선택적 microelectrodes 칼륨 측정에 대 한 준비. Microelectrode 센서 K+ 농도 생체 외에서조직 조각에서 vivo에서 측정 하기 위한 금 표준을 나타냅니다.
그러나 모니터링 K+ 에 대 한 새로운 접근법 개발이 K의 생물학 관련 범위+ 농도 검색 하지 않습니다 또는 하지 완전히 홀더 되었습니다 생물 학적 시스템에 있지만 광학 센서를 사용 하 여 초기 결과 유망한6,,78나타납니다. 광학 센서에 비해, microelectrodes는 근본적으로 이온, 포인트 소스 측정 전극 배열9공간 해상도 향상 시킬 수 있지만. 이 문서는 K+ 역학을 모니터링 하기 위한 단일 질주 microelectrode 센서에 초점을 맞추고.
이 작품에서는, 우리는 선택적 microelectrodes, 높게 선택적인 허용 하는 valinomycin 기반 칼륨 ionophore를 사용 하 여 (104 배 K+ + 나 선택도를) K+ 수 있도록 상세한 단계적 절차 보고 K+ 막10이상 운동입니다. 자연스럽 게 발생 polypeptide, valinomycin K+ 침투성 숨 구멍으로 작동 하 고 그것의 전기 화학 기온 변화도 아래로 K+ 의 흐름을 용이 하 게 한다. 우리는 또한 전극, 보정 하는 방법을 설명 저장 하 고 그들을 사용 하는 방법 및 마지막으로 성인 쥐에서 급성 hippocampal 두뇌 조각에서 K+ 농도 역학을 측정 하기 위해 그들을 배포 하는 방법. Extracellular K+ 역학 규제를 제안 하는 특정 이온 채널 부족 유전자 변형된 생쥐와 같은 전극의 사용 K의 주위 농도 제어 하는 신경 시스템에서 사용 하는 셀룰러 메커니즘을 계시 해야 한다 + extracellular 환경에.
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Protocol
모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 헬스 가이드의 국립 연구소에 따라 실시 했다 고 장관의 동물 연구 위원회, 로스 앤젤레스가 주 대학에 의해 승인 했다. 모든 마우스 음식과 물을 사용할 수 있는 광고 libitum 12 h 빛 어두운 환경에 함께 보관 되어 있었다. 모든 동물 명백한 행동 변경 없이 건강 한, 이전 연구에 관여 되지 않은 되었고 빛 주기 동안 희생 했다. 실험 데이터는 성인 쥐 (모든 실험에 대 한 오래 된 6-8 주)에서 수집 했다.
1. 선택적 microelectrodes K+ 의 준비
- 붕 규 산 유리의 Silanization
- 포장에서 충분 한 유리 모세 혈관을 제거 하 고 50 mL 원뿔 관으로 장소. HCl 밤새 또는 최소 6 시간에 대 한 부드러운 동요와 1 M HCl 세척 전극에 원뿔 튜브 위로 채우십시오.
- 짧게 70% 에탄올과 모세 혈관을 헹 구 고 6-8 시간 동안 100-120 ° C에서 완전 하 게 건조. 더 사용 하기 전에 최대 4 주 동안 무수 칼슘 황산 염 방 습 제로 용기에 씻어 모 세관을 저장 합니다.
- Silanization, 이전 microelectrode 끌어당기는 사람을 사용 하 여 좋은 팁을 모 세관을 당겨. 우리가 사용 하는 microelectrodes는 직경에서 대략 2-5 미크론. 항상 취급 하십시오 장갑, 세척 된 모세 혈관 피부에서 기름 silanization를 방해할 수 있습니다.
- 전극 팁 파손을 방지 하기 위해 바닥에서 상승는 되도록 유리 용기에 microelectrodes를 놓습니다. Microelectrodes 멸 테이프 또는 유사한 접착 테이프를 사용 하 여 컨테이너를 수정 합니다.
- 약 0.5 mL 5 %dichlorodimethylsilane (DDS) silanization 솔루션의 질소 대체 방법을 사용 하 여 컨테이너에서 제거 ( 그림 2참조). 질소 가스는 풍선을 풍선에 주사기 또는 튜브와 바늘 연결. 더 긴 바늘을 통해 별도 주사기에 DDS를 그리는 동안 DDS 컨테이너에 바늘을 삽입 합니다.
- 펫의 팁에 dropwise silanization 솔루션을 적용 하 고 즉시 커버. 들고 silanization 솔루션 microelectrodes 미리 따뜻하게 (170-180 ° C) 실험실 오븐에 10-12 시간 또는 200-220 ° C에서 30 분에 대 한 컨테이너를 놓습니다
- 부 화 후 오븐을 해제 하 고 오븐에서 제거 하십시오. 그것은 매우 뜨거운는 인큐베이터에서 접시를 제거할 때는 주의 해야 합니다. 냉각 유리를 수 있도록 10-15 분간 실 온에서 벤치에 접시를 놓습니다.
- microelectrodes (테이프를 잘라 면도날 또는 메스 블레이드 사용) 접시에서 제거 건조제 채워진된 밀폐 용기에 그들을 배치. 수 분의 자유로운 유지 하는 Silanized microelectrodes silanization 다음 최대 1 주일까지 사용할 수 있습니다.
- 전극을 못쓰게
- 재고 솔루션 K+ ionophore 칵테일의 준비: 5 %w / v valinomycin, 93 %v / v 1, 2-디 메 틸-3-니트로 벤젠, 2 %w / v 칼륨 tetrakis(4-chlorophenyl) 붕 산 염11. 이 솔루션은 희미 한 노란 색상입니다. 실내 온도에 밀폐, 불투명 용기에 계속. 제대로 저장 된 경우이 솔루션에 게 몇 개월 지난 수 있습니다.
- 10 mM HEPES pH 7.4에서 300 mM NaCl 버퍼링의 재고 솔루션을 준비 합니다. 28 G microfil 팁 주사기에 연결을 사용 하 여 버퍼링된 NaCl와 전극 클램프 및 백필으로 수정. 준수는 염 microelectrode 팁의 끝에 도달 했습니다. microelectrode의 전류 흐름을 방해할 수 있는 큰 거품의 무료 되는지 확인 합니다.
- 약 10-20 µ m 폭, 메스 또는 면도칼의 무딘 사이드를 사용 하 여 전극의 팁을 휴식.
- 사용 하는 micropipette, K+ ionophore는 microelectrode의 끝 근처의 작은 물방울 (~0.1 µ l)를 적용 합니다. 만약 전극은 제대로 silanized 드롭릿에 깨진된 팁으로 흡수 될 것 이다. 채우기 1-2 m m K+ ionophore와 제거 초과 전극 휴지를 사용합니다.
2. 선택적 Microelectrodes K+ 의 교정
- 교정 솔루션의 준비
- KCl과 NaCl을 대체 하 여 동등한 osmolarity 인공 뇌 척추 액체 (실제)에서 KCl의 다양 한 농도의 솔루션을 준비 합니다. 우리는 0.1, 1, 4.5, 10, 100 m m K+ 실제, 전극의 교정에 대 한 사용. 이러한 교정 솔루션에 대 한 조리법은 표 1에 나열 됩니다.
| 화학 | MW | 마지막 m m | 0.1 m m [K +] | 1 m m [K +] | 4.5 m m [K +] | 10 m m [K +] | 100 m m [K +] |
| (g / mol) | |||||||
| NaCl | 58.44 | 다릅니다. | 1.51 g | 1.50 g | 1.44 g | 1.4 g | 0.345 g |
| KCl | 1 M 주식 | 다릅니다. | 20 µ l | 200 µ l | 900 µ l | 2 ml | 20 ml |
| CaCl2 | 1 M 주식 | 2 | 400 µ l | ||||
| MgCl2 | 1 M 주식 | 1 | 200 µ l | ||||
| NaH2포4 | 119.98 | 1.2 | 0.29 g | ||||
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 0.437 g | ||||
| D-포도 당 | 180.16 | 10 | 0.360 g | ||||
| 물 | q.s. 200 ml | ||||||
표 1입니다. 칼륨 교정 솔루션
- Microelectrode 교정
- 실험을 시작 하기 전에 적어도 20 분 동안 95% O2/5% CO2 와 모든 솔루션을 거품. 4.5 m m [K+] 목욕 perfusing 시작 분 당 3 mL의 속도로 실제. K+ 선택적인 전극을 조작자에 전극 headstage에 연결 된 전극 홀더 넣으십시오. 이 headstage는 적절 한 앰프에 연결 된다. 목욕 perfusate에는 전극의 끝을 삽입 합니다.
- Ag/AgCl 접지 전극은 동일한 솔루션에서 목욕을 하 고 흐름은 꾸준한 확인 하십시오. Stepwise 방식에서 교정 솔루션을 적용 하 고 전극 팁에 걸쳐 mV에 잠재적인 변화를 기록 합니다. 다음 솔루션으로 전환 하기 전에 안정적인 값에 도달 하는 전극 팁에서 잠재력을 기다립니다
- 전극 끝에 교정 솔루션의 응용 프로그램에 대 한 응답에서 안정 상태 전압 변화를 측정 합니다. 전극 응답의 사면은 적어도 52와 58 보다 더 큰 확인 mV 로그 변경 [k+] 당.
3입니다. 급성 Hippocampal 뇌 조각의 준비
- 조각 솔루션의 준비
- 500 mL 자당 준비 절단 솔루션 구성: 194 m m 자당, 30 m NaCl, 4.5 m KCl, 10mm D-포도 당, 1mm MgCl2m m, 1.2 m m NaH2포4, 26mm NaHCO3, 290-300 mOsm, 5% CO2와 95% O2 포화.
- 준비의 구성 기록 솔루션 (실제)의 1-2 리터: 124 mM NaCl, 4.5 m m KCl, 1 mM MgCl2, 10 m m D-포도 당, 2 mM CaCl2, 1.2 m m NaH2포4및 26 m m NaHCO3; (버블링) 후 pH 7.3-7.4, 290-300 mOsm, 5% CO2와 95% O2 포화. 솔루션을 기록 뇌 조각 홀더 챔버를 포함 하는 비 커를 32-34 ° c.에 그것을 유지합니다 비 자금 얼음 물으로 vibratome 챔버를 채우십시오.
- 급성 슬라이스 준비
- 깊이 2-3 mL isoflurane에 미리 충전 된 벨 항아리에 그것을 배치 하 여 마우스를 anesthetize. 발가락 핀치 반사에 대 한 확인 하 고 응답 하지 않는 경우 신속 하 게 목을 벨 동물 프로토콜에서 요구 하는으로 한 쌍의 날카로운가 위 또는 단두대를 사용 하 여.
- 2-3 cm 절 개 잘라 중간 선 따라 두 피를 두개골의 꼬리 부분에서가 위를 사용 하 여 확인 합니다. 수동으로 제거 두 피, 하는 동안 두 개의 1 cm 가로 절 측면을 따라 구멍 매그넘에서 두개골의 확인 합니다. 그럼, 좋은 위를 사용 하 여 잘라 절 개 코에 두개골의 뒤에서 중간에 따라 두개골의 길이.
- 중간 선 근처 삽입 미세 집게를 사용 하 여 두 부분에 베인된 두개골을 철회. 두개골에서 쥐의 뇌를 추출 하 고 블레이드를 사용 하 여 제거 하는 소 뇌 및 후 각 전구, 두뇌의 rostral 꼬리 부분에 각각 있습니다. 이러한 큰 균열, 피 질에서 그들을 구분 하 여 확인할 수 있습니다.
- 슈퍼 접착제를 사용 하 여 vibratome 트레이에 두뇌 블록을 탑재 합니다. Vibratome 트레이를 차가운 얼음 절단 솔루션을 채우십시오.
- 300 µ m 두께에서 코로나 비행기에 조직 섹션을 잘라. 보통 6 코로나 hippocampal 조각은 수집할 수 있습니다.
- 각 섹션을 자른 후 즉시 전송 조각 슬라이스 잡고 비 커 32-34 ° c 예 열 섹션을 포함 하는 비 커를 제거 하기 전에 20 분 동안이 온도에 섹션을 계속 하 고 녹음 전에 적어도 20-30 분 동안 실내 온도에 배치.
4. 전기 Evoked K+ 역학의 측정
- 조각 준비 설정
- 부드럽게 뇌 조각 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 목욕에 놓고 부드럽게 나일론 문자열 플래티넘 하프와 장소에서 개최 합니다.
- 바이 폴라 자극 전극의 팁 서로 평행한 조각의 평면 수준 확인 합니다. 천천히, 6-7 초 동안 삽입 전극 CA3 지층 radiatum에 약 40-50 µ m 깊은 Schaffer collaterals를 자극. 코로나 섹션에서 CA3 식별할 수 있습니다 약 hippocampal genu에과 립 세포 층에 해 마 적절 한 측면의 부분으로 중간과 복 부 피라미드 세포 층에 떨어지는 지층 radiatum와 함께.
- 조심 스럽게 삽입 K+-깊은 약 3 4 초 동안 전극을 천천히 낮추어 CA1 지층 radiatum 약 50 µ m으로 선택적인 전극. Stimulations 슬라이스를 적용 하기 전에 전극에 걸쳐 안정 가능성을 허용:이 보통 5 ~ 10 분 정도 걸립니다. 조각 전시 자발적인 경우 extracellular k+ 변경 삭제 그리고 새로운 조각으로이 과정을 반복 합니다.
- 측정 갖는 K+ 출시
- 수동으로 디지털 응답을 녹음 하면서는 자극에 방 아 쇠를 우울 하 여 전기 자극 (8 펄스)의 열차를 적용 합니다. 10 Hz와 1 ms 펄스 폭, 10 µ A 자극 진폭에서 시작에서 자극을 적용 합니다.
- 최대 K+ 응답 진폭 감지 될 때까지 2의 요인에 의해 증가 자극 진폭을 적용 합니다. 표시 되지 않으면 어떤 응답 단위로 100 µ m의 자극 사이트에 가까이 K+ 전극의 위치를 이동 하는 경우
- 절반 최대한 응답을 생성 하는 자극 진폭을 결정 합니다. 우리의 경험에서는, 이것은 준비 품질, 동물, 그리고 자극 전극 및 K+ 선택적인 전극 사이의 거리의 나이에 따라 40-160 µ A 사이.
- 동일한 조각에서 사용 하 여 자극 진폭 절반 최대한 응답을 생성 하는 진폭 보다 한 단계 (예: 반 최대한 응답을 생성 하는 80 µ A 경우 사용 40 µ A) 펄스의 수를 증가의 자극 기차를 적용. 처음, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 펄스의 열차 사용 했습니다.
- K+ 신호 전기 자극된 Schaffer 민간인 목욕의 활동 전위 발생에 의해 중재는 것인지 10 분 동안 0.5 µ M TTX 실제에 적용 하 고 자극 프로토콜을 반복 합니다. 갖는 무반응을 관찰 한다.
- 마친 후 슬라이스 실험, 전극은 전극 교정 솔루션에서 다시 보정 하 여 자사의 responsivity를 유지 하 고 있다 고 응답 보장 초기 교정에서 10% 이상 벗어나지는 확인
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Representative Results
Extracellular K+의 선택적 측정을 위해 우리는 깨끗 한 붕 규 산 유리 펫 (그림 1A)의 silanization 통해 소수 레이어와 코팅 이온 선택적 microelectrodes 준비. 이 코팅 전극의 끝에 휴식 하 고 전극 팁 (그림 1B)에 좁은 개방을 통해 K+ 플럭스만을 허용 하는 valinomycin를 포함 하는 K+ ionophore를 수 있습니다. 못쓰게 백필 염와 K+ ionophore 전극, 후 전극 시험 될 수 있다 그들의 신속 하 고 선형 변화에 대응 stepwise 목욕 K+ 농도 (그림 3A)와 그들의 응답에 대 한 목욕 K+ 염 분에 교정 범위 (그림 3B) 변경 또는 방식으로 실제 Nernst 방정식2에 의해 예측. 58.2 해야 약 선의 기울기를 결정 하기 위해 목욕 K+ 농도 대 한 잠재적인 안정 된 상태에서 변화를 그릴 수 있습니다 mV 로그 [K+], Nernst 방정식, 그리고 이상 52에 따르면 당 당 mV 로그인 [K+] (그림 3C). 우리는 또한 K+ 선택적인 전극의 응답 속도 테스트 하 고는 그들은 약 85 ms (3D 그림,E)의 상승 및 부패 시간 상수와 K+ 에 5.5 m m 변화에 반응을 발견.
LCD 디스플레이 자극의 위치를 식별 하 고 기록 전극에 연결 된 표준 직 립 현미경 electrophysiological 녹음 장비에 의하여 이루어져 있다. 아니 특별 한 광학 K+ 와 자극 전극;의 시각적 배치에 필요한 우리 5 배 또는 10 배 목표 렌즈 및 할로겐 전구에서 하얀 빛을 사용 하지만 백색 LED 대신 사용 될 수 있었다. 자극 전극 자극 아이 솔 레이 터, depolarizing는 자극 또는 다른 그런 타이밍 장치에서 펄스의 타임된 배달을 통해 현재 제공의 출력에 연결 된다. 다른 말로 자극을 제공 합니다 2 V, 10-20 Hz의 열차 타이밍 펄스 자극 아이 솔 레이 터. 이 펄스를 받으면 자극 아이 솔 레이 터는 다음 자극 전극에 원하는 전류를 제공 합니다. 기록 전극은 전극 홀더, headstage, 증폭기 및 A/D 보드 electrophysiological 레코딩 소프트웨어 (그림 4A)와 PC에 인터페이싱 하는 연결에 연결 된다. 전극 성공적으로 보정 되어 급성 조각 준비 된 후에, 실제 perfusate에는 슬라이스를 배치할 수 있습니다. Schaffer collaterals, K+자극-선택적 전극 CA1 지층 radiatum 내 고 필드 자극 전극은 내는 CA3 (그림 4B).
전극 배치 되었습니다 일단 K+ 기록에는 안정적인 기준선에 도달 했습니다 다음 현재 진폭 증가의 펄스에 적용할 수 있는 조각 (그림 5, 상단). 이 활동의 파형 TTX 응용 프로그램 (그림 5, 하단)으로 폐지 되는 지 수 감퇴 속도, K+ 의 급속 한 증가으로 나타납니다.
그림 1 : Silanization 반응 및 K+ 선택적 microelectrode 아키텍처의 다이어그램. A. 붕 규 산 유리의 노출된 극 지 수 산 기 그룹 및 silanization 시 약 dichlorodimethylsilane (DDS) 사이 발생 하는 silanization 반응의 도식 대표. 이 반응에는 얇은 막 형태로 K+ ionophore 수 있는 소수 성, 유리의 표면을 렌더링 합니다. B. K+ 선택적 microelectrode의 다이어그램. 전극 염 경우 포함 이며 K+ 선택적 솔루션은 끝에 1-2 m m 두꺼운 층에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : DDS 추출의 다이어그램. 컨테이너에서 DDS 추출 질소 교체 절차의 도식 적인 표현입니다. DDS 휘발성과 가연성 이며 때 높은 농도에 따라서 그것은 불활성 질소 가스를 제거 하는 DDS를 대체 하는 데 필요한 대기 가스와 심하게 반응 수 있습니다. 질소로 채워진 풍선에 바늘 주사기 또는 적절 한 튜브를 통해 연결 되어 있습니다. 이 바늘은 컨테이너에 질소 가스 (N2) 흐름을 허용 하는 컨테이너에 실 란 트를 통해 삽입 됩니다. 별도로, 긴 (3-10 cm) 바늘 1 mL 주사기에 연결 이며 컨테이너에 삽입 합니다. 이 주사기 다음 질소 가스만 컨테이너를 입력 수 DDS, 추출 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Microelectrodes의 교정. A. 식 염 수에 다른 K+ 농도의 목욕 관류 응용 프로그램 수 있습니다 신속 하 고 역 변화를 생산 Nernstian 잠재력에 전극 팁에서. B. 실제 K+ 의 Stepwise 응용 전극 팁 잠재력에 특성 및 안정적인 변화를 느끼게합니다. 4 전극; K+ 의 농도 증가에 대응 K+ 선택적인 전극의 mV 변경의 C. 줄거리 R2 는이 4 개의 전극에 대 한 0.9995 이다. 디 빠른 관류 시스템 목욕 응용 프로그램 10 m K m의+ + K 선택적 전극 팁에서 전압에 단계 응답을 발생합니다. E. 측정된 응답의 시간 (ms에 타우); 부패 및 상승 시간 사이의 차이가 감지 되었습니다 (± SEM, p 를 의미 = 0.939, 2 샘플 t-테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Extracellular K+ 측정을 위한 장치. A. 전기 생리학 장비 방진 테이블에 연결 된 카메라와 LCD 디스플레이 조각 시각화에 대 한 고정 현미경의 구성 됩니다. K+ 전극 headstage, 증폭기 및 아날로그 electrophysiological 녹음 소프트웨어와 연결 된 PC에 신호를 출력 하는 디지털 보드를 고정 됩니다. 전기 자극 전극 자극 진폭 및 타이밍 자극 전달에 대 한 자극은 자극 아이 솔 레이 터에 연결 됩니다. B. 다이어그램 슬라이스 준비와 조각에서 다양 한 전극의 배치의 위치. CA3 rostral 피라미드 세포 층에 떨어지는 지층 radiatum와 hippocampal genu에과 립 세포 층에 해 마 적절 한 측면의 부분으로 약 식별 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 전기 evoked K+ 자료의 측정. K+ 의 대표적인 흔적 기저 상태 (맨 위)에서 기록 전극과 (아래)를 기록 하기 전에 5 분 동안 테트로도톡신 (0.25 µ M)의 신청에 그들의 손실에서 릴리스 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리가 여기에 설명 하는 방법 성인 쥐에서 급성 hippocampal 조각에서 Schaffer collaterals의 전기 자극에 대 한 응답에서 K+ 역학 평가 허용 했다. 준비 K+ 이온 선택적 microelectrodes의 우리의 방법은 앞서 설명한 절차12,13,,1415와 비슷합니다. 그러나,이 메서드는 장점이 대체 전극 구성 이라는 점에서 신속 하 고 단순한 K+ 선택적인 microelectrodes를 준비 하. 적절 한 교정 후 이러한 전극 튼튼하게 전기 자극, 동안 조각에 K+ 역학 측정을 발견 했다 그리고 이러한 응답 TTX에 의해 차단 되었습니다. 이 실험에서는 10 Hz에서 80-160 uA의 stimulations 사용 되었다; 그러나, 특정 실험에 대 한 관심의 뇌 영역에 대 한 자극 조건의 최적화 해야 합니다. 이 값으로 표시 됩니다.
전극의 응답의 사면은 58.2 이어야 한다 mV 로그 [K+] 당. 이러한 값은 K+ 선택적 반 투과성 막; 위한 네른스트와 Nicolsky Eisenman 방정식에서 예측 후자 더 나은 이온16사이 상호 작용에 대 한 계정. 전극 예상 방식으로 응답 하지 않으면,이 두 가지 주된 이유 중 하나에 대 한 수 있습니다. 첫 번째는 silanization 수 적절 한 형태로 손실 또는 소금 다리를 되도록 막 발생 있습니다. 확인 막 현미경을 통해 관찰 하 여 그대로, 피 펫 솔루션 및 막 사이 명확한 인터페이스 이어야 한다. 또 다른 이유는, 염화는 전선에서 전류의 흐름을 방해 하는 피 펫에 거품의 존재 수 있습니다. 거품, 관찰 하는 경우에 피 펫 및 그들을 제거 하는 적극적으로 영화 제거 합니다. 이러한 솔루션은 실패, 다시 또 다른 K+ 선택적인 전극 또는 더 이상 또는 더 높은 온도에 대 한 silanization를 반복 합니다. 그러나, 그것은 새로운 두뇌 지역 공부 하거나 새로운 microelectrode 테스트 때마다 이러한 키 컨트롤을 반복 하는 것이 중요.
두 특정 증폭기가이 실험에 사용 된 있지만 다른 앰프 보다 크거나 500 m ω 입력된 임피던스는으로 사용 될 수 있습니다. 우리 K 범위+ 농도 끝났다 어느 설정 전압 응답의 기울기에 차이가 발견 데 500 m ω와 5 GΩ 입력된 임피던스 전극 보정, (에서 ten-fold 변경 당 56.9 ± 0.7와 56.5 ± 0.9 mV [K+ < / c1 >] 500 m ω 및 5 GΩ 입력 임피던스, 각각; P = 0.759, 쌍 t-테스트, n = 4 전극).
우리는 또한 10 m m (그림 3D) 4.5에서 [k+] 알려진된 점프를 전극의 응답 시간을 추정 하 빠른 솔루션 스위치를 사용. 전극 반응을 상승 및 붕괴 시간 (타우) 85 ± 12와 85 ± 15 ms, 각각. 이에 관하여 우리의 사용자 정의 빠른 솔루션 스위처를 위한 솔루션 교환 활동 했다 따라서, 85 ± 27 양 K+ 선택적인 전극 속도 론으로 빨리 우리는 고용 솔루션 스위처와 K+ 의 역학 보다 훨씬 빠른에 응답 Schaffer 부수적인 자극 (그림 5) 결과로 증여는 extracellular 경제 이러한 데이터 K+ 선택적인 전극 K+ 축적 및 클리어런스 뇌 조직에서의 활동을 추정에 사용 될 수 있다는 것이 좋습니다. 그러나, 미래에 적절 한 컨트롤을 작동 하 고 교정에 사건-의해-사건을 기준으로 필요 하 게 됩니다. 그것은 귀중 한 녹음 실에서 솔루션 교환 활동을 이해 하는 시간을 보내고 하는 것이 좋습니다.
우리는 품질 및 조각에 K+ 측정의 안정성에 영향을 주는 세 가지 매우 중요 한 요소를 발견. 첫 번째는 준비의 품질, 조직 건강 및 사용 하는 동물의 나이 관련 된 것으로 나타납니다. 이 연구를 위해 우리는 ~ 12 주 오래 되 C57/Bl6N 쥐를 이용 했다. 드문 경우에, 우리 자연 K+ 변동 ~0.1 m m에 이른다 고 5-10 초; 지속 조각 발견 이 분할 영역 삭제 했다. 두 번째 녹음 microelectrode의 품질입니다. 기본 문제는 시간 및 가져온된 유리 모 세관의 silanization에 사용 되는 온도. 좋습니다 > 최소한 6 시간 동안 170 ° C (하룻밤은 허용) 또는 30 분 동안 200 ° C에서. 부족 한 난방 silanization 시 약으로 전극의 전극 유지 하지 않는 안정적인 상태 잠재적인 K+ ionophore의 점진적 손실이 발생할 수 있습니다. 또한, 준비할 때 전극, 즉 대략 평균 셀 시체 (그림 1B)의 크기에 10-20 μ m의 직경을 가진 팁에 K+ ionophore의 얇은 레이어 (1-2 m m)를 배치 하는 것이 좋습니다. 지나치게 넓은 팁을 아프게 하지 마십시오 또는 K+ 선택적 막 무결성을 잃게 될 것 이다 고 전극 실패 합니다. 이 단계는 올바른 크기의 팁을 얻으려면 연습이 필요할 수 있습니다. 너무 좋은 팁 또는 너무 두꺼운 층의 K+ 선택적인 전극 적절히 구성 된 전극에 비해 느린 응답을 가질 수 있습니다. 세 번째 요소는 자극 전극과 K+ 선택적인 전극 사이의 거리입니다. 그러나 우리 사용 약 500 µ m의 전극 간 거리, 최적의 거리 개인의 두뇌 영역으로 상당히 변화할 수 있다 하 고 특정 실험에 대 한 신중 하 게 고려 될 필요가 있을 것 이다.
싱글 배럴 구성 뿐만 아니라 현재 K+를 만들기 위한 여러 가지 방법이 있습니다-양극과 동심에 선택적인 microelectrodes 형식17. 이러한 방법의 게시 설명에 비해 단일 채널 전극은 두 가지 주요 단점: 1) 약간 큰 팁 직경 (~ 10 대 4 µ m), 세포 외 공간 바이 폴라와 동심 comparted의 큰 혼란을 일으킬 수 있는 전극, 및 2) 호환 바이 폴라 전극에서 여러 이온 종의 동시 측정. 그러나, 단일 채널 전극은 여러 가지 이점을 제공합니다. 특히, 이러한 전극 5 분 미만에 날조 될 수 있다 하 고 그러므로 더 일회용 만든 고 실험 하기 전에 신속 하 게 보정 수 있습니다. 따라서, 과정 실험 동안 전극 파손의 위험 관심사의 작습니다. 또한, 접지 전극과 기록 전극은 물리적으로 구분 하 여 목욕의 볼륨, 이므로 동심에 바이 폴라 전극 실패 이어질 수 있는 전극의 끝에 소금 다리의 형성을 위한 기회 전극입니다. 단일 채널 전극의 응답 시간 이지만 바이 폴라 전극 및 가능성이 동심에 비해 전극 (~ 20 ms) 보다 더 빨리 우리의 빠른 관류 시스템 80 ms (그림 3E 순서 응답 시간 측정에만 허용 ). 또한, 이러한 전극 큰 팁 저항 있고 높은 입력된 저항을 가진 증폭기의 사용을 요구 한 바이 폴라 전극에 비해 낮은 잡음을 제공 합니다. 마지막으로,이 전극 전문된 micromanipulator 또는 headstage 동심 전극에 대 한 필요를 사용 하 여가 필요 하지 않습니다. 균형에, 건설의 장점과 단일 채널 전극의 사용의 용이성 단점을 보다 큽니다.
우리가 여기 K+ 역학 분할 영역을 측정 하는 데 사용 하는 접근 K+ 레 귤 레이 션을 공부에 많은 두뇌 지구에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 K+의 사용 방법을 보여 줍니다 있지만-선택적 전극에서 전기 evoked 칼륨 이온의 역학의 측정에 대 한 뇌 조직,이 프로토콜 사용할 수 있습니다 광범위 하 게 많은 다른 조직에서 하는 것은 K+ 역학 측정 합니다. 이러한 상황 포함 될 수 있습니다 자연 역학과 변화 응답 약리, optogenetic, 또는 chemogenetic 세포 활성화. 이 microelectrodes는 어떤 실험실 도구 상자에이 기술의 급속 한 통합을 허용으로 충분 한 품질과 신뢰성으로 만들 수 있습니다. 건강 및 질병 상태에 K+ 농도의 상세한 분석 수 있도록 추가 검색 및 다양 한 분자 및 세포 구성 요소 기여할 휴식 K+ 뇌3, 농도의 정량화 18,19.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
Khakh 실험실은 NIH MH104069에 의해 지원 되었다. Mody 실험실 NIH NS030549에 의해 지원 되었다. J.C.O.는 NIH T32 신경 칩 훈련 Grant(NS058280) 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
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