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Neuroscience

만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57511

Summary

칼륨 이온은 세포의 휴식 막 잠재력에 기여 하 고 extracellular K+ 농도 세포 흥분의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 우리가 확인 하 고, 보정 하 고 monopolar K+를 사용 하는 방법을 설명-선택 microelectrodes. 같은 전극을 사용 하 여 성인 hippocampal 조각 전기 evoked K+ 농도 역학 측정 수 있습니다.

Abstract

칼륨 이온이 세포의 휴식 막 잠재력에 크게 기여 하 고, 따라서, extracellular K+ 농도 세포 흥분의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 활동 전위의 기반이 되는 전압 종속 이온 채널에 대 한 폐쇄, 오픈 및 비활성 상태 사이 평형 이동 하 여 휴식 막 잠재력과 세포 흥분 extracellular K+ 영향의 농도 변경 개시와 전도 따라서, 그것은 extracellular K+ 역학 건강 및 질병 상태를 직접 측정 하는 중요 한입니다. 여기, 우리가 확인 하 고, 보정 하 고 monopolar K+를 사용 하는 방법 설명-선택 microelectrodes. 우리는 전기 evoked K+ 농도 역학 측정 hippocampal 뇌 조각에 그들을 배포. 이러한 전극의 사리 분별이 사용 신 경계에 extracellular K+ 농도 제어 하는 세포와 생물 메커니즘을 평가 하는 데 필요한 도구 키트의 중요 한 부분 이다.

Introduction

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칼륨 이온 농도 두뇌에 긴밀 하 게 규제 하 고 그들의 동요는 모든 세포의 휴식 막 잠재력에 강력한 영향을 발휘. 이러한 중요 한 공헌에 비추어 생물학의 중요 한 목표는 시체1 의 다른 장기에서 세포 외 공간에서 단단히 K+ 의 농도 조절 하는 데 사용 되는 셀룰러 및 생물 메커니즘을 결정 하는 , 2. 이러한 연구에 중요 한 요구는 K+ 농도 정확 하 게 측정 하는 능력. 건강 하 고 병에 걸린 상태에서 뇌의 칼륨 항상성에 공헌 하는 많은 구성 요소 식별된3,,45, 있다 지만 더 진행 되었습니다 둔화의 특성 상 전문 이온 선택적 microelectrodes 칼륨 측정에 대 한 준비. Microelectrode 센서 K+ 농도 생체 외에서조직 조각에서 vivo에서 측정 하기 위한 금 표준을 나타냅니다.

그러나 모니터링 K+ 에 대 한 새로운 접근법 개발이 K의 생물학 관련 범위+ 농도 검색 하지 않습니다 또는 하지 완전히 홀더 되었습니다 생물 학적 시스템에 있지만 광학 센서를 사용 하 여 초기 결과 유망한6,,78나타납니다. 광학 센서에 비해, microelectrodes는 근본적으로 이온, 포인트 소스 측정 전극 배열9공간 해상도 향상 시킬 수 있지만. 이 문서는 K+ 역학을 모니터링 하기 위한 단일 질주 microelectrode 센서에 초점을 맞추고.

이 작품에서는, 우리는 선택적 microelectrodes, 높게 선택적인 허용 하는 valinomycin 기반 칼륨 ionophore를 사용 하 여 (104 배 K+ + 나 선택도를) K+ 수 있도록 상세한 단계적 절차 보고 K+10이상 운동입니다. 자연스럽 게 발생 polypeptide, valinomycin K+ 침투성 숨 구멍으로 작동 하 고 그것의 전기 화학 기온 변화도 아래로 K+ 의 흐름을 용이 하 게 한다. 우리는 또한 전극, 보정 하는 방법을 설명 저장 하 고 그들을 사용 하는 방법 및 마지막으로 성인 쥐에서 급성 hippocampal 두뇌 조각에서 K+ 농도 역학을 측정 하기 위해 그들을 배포 하는 방법. Extracellular K+ 역학 규제를 제안 하는 특정 이온 채널 부족 유전자 변형된 생쥐와 같은 전극의 사용 K의 주위 농도 제어 하는 신경 시스템에서 사용 하는 셀룰러 메커니즘을 계시 해야 한다 + extracellular 환경에.

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Protocol

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모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 헬스 가이드의 국립 연구소에 따라 실시 했다 고 장관의 동물 연구 위원회, 로스 앤젤레스가 주 대학에 의해 승인 했다. 모든 마우스 음식과 물을 사용할 수 있는 광고 libitum 12 h 빛 어두운 환경에 함께 보관 되어 있었다. 모든 동물 명백한 행동 변경 없이 건강 한, 이전 연구에 관여 되지 않은 되었고 빛 주기 동안 희생 했다. 실험 데이터는 성인 쥐 (모든 실험에 대 한 오래 된 6-8 주)에서 수집 했다.

1. 선택적 microelectrodes K+ 의 준비

  1. 붕 규 산 유리의 Silanization
    1. 포장에서 충분 한 유리 모세 혈관을 제거 하 고 50 mL 원뿔 관으로 장소. HCl 밤새 또는 최소 6 시간에 대 한 부드러운 동요와 1 M HCl 세척 전극에 원뿔 튜브 위로 채우십시오.
    2. 짧게 70% 에탄올과 모세 혈관을 헹 구 고 6-8 시간 동안 100-120 ° C에서 완전 하 게 건조. 더 사용 하기 전에 최대 4 주 동안 무수 칼슘 황산 염 방 습 제로 용기에 씻어 모 세관을 저장 합니다.
    3. Silanization, 이전 microelectrode 끌어당기는 사람을 사용 하 여 좋은 팁을 모 세관을 당겨. 우리가 사용 하는 microelectrodes는 직경에서 대략 2-5 미크론. 항상 취급 하십시오 장갑, 세척 된 모세 혈관 피부에서 기름 silanization를 방해할 수 있습니다.
    4. 전극 팁 파손을 방지 하기 위해 바닥에서 상승는 되도록 유리 용기에 microelectrodes를 놓습니다. Microelectrodes 멸 테이프 또는 유사한 접착 테이프를 사용 하 여 컨테이너를 수정 합니다.
    5. 약 0.5 mL 5 %dichlorodimethylsilane (DDS) silanization 솔루션의 질소 대체 방법을 사용 하 여 컨테이너에서 제거 ( 그림 2참조). 질소 가스는 풍선을 풍선에 주사기 또는 튜브와 바늘 연결. 더 긴 바늘을 통해 별도 주사기에 DDS를 그리는 동안 DDS 컨테이너에 바늘을 삽입 합니다.
    6. 펫의 팁에 dropwise silanization 솔루션을 적용 하 고 즉시 커버. 들고 silanization 솔루션 microelectrodes 미리 따뜻하게 (170-180 ° C) 실험실 오븐에 10-12 시간 또는 200-220 ° C에서 30 분에 대 한 컨테이너를 놓습니다
    7. 부 화 후 오븐을 해제 하 고 오븐에서 제거 하십시오. 그것은 매우 뜨거운는 인큐베이터에서 접시를 제거할 때는 주의 해야 합니다. 냉각 유리를 수 있도록 10-15 분간 실 온에서 벤치에 접시를 놓습니다.
    8. microelectrodes (테이프를 잘라 면도날 또는 메스 블레이드 사용) 접시에서 제거 건조제 채워진된 밀폐 용기에 그들을 배치. 수 분의 자유로운 유지 하는 Silanized microelectrodes silanization 다음 최대 1 주일까지 사용할 수 있습니다.
  2. 전극을 못쓰게
    1. 재고 솔루션 K+ ionophore 칵테일의 준비: 5 %w / v valinomycin, 93 %v / v 1, 2-디 메 틸-3-니트로 벤젠, 2 %w / v 칼륨 tetrakis(4-chlorophenyl) 붕 산 염11. 이 솔루션은 희미 한 노란 색상입니다. 실내 온도에 밀폐, 불투명 용기에 계속. 제대로 저장 된 경우이 솔루션에 게 몇 개월 지난 수 있습니다.
    2. 10 mM HEPES pH 7.4에서 300 mM NaCl 버퍼링의 재고 솔루션을 준비 합니다. 28 G microfil 팁 주사기에 연결을 사용 하 여 버퍼링된 NaCl와 전극 클램프 및 백필으로 수정. 준수는 염 microelectrode 팁의 끝에 도달 했습니다. microelectrode의 전류 흐름을 방해할 수 있는 큰 거품의 무료 되는지 확인 합니다.
    3. 약 10-20 µ m 폭, 메스 또는 면도칼의 무딘 사이드를 사용 하 여 전극의 팁을 휴식.
    4. 사용 하는 micropipette, K+ ionophore는 microelectrode의 끝 근처의 작은 물방울 (~0.1 µ l)를 적용 합니다. 만약 전극은 제대로 silanized 드롭릿에 깨진된 팁으로 흡수 될 것 이다. 채우기 1-2 m m K+ ionophore와 제거 초과 전극 휴지를 사용합니다.

2. 선택적 Microelectrodes K+ 의 교정

  1. 교정 솔루션의 준비
    1. KCl과 NaCl을 대체 하 여 동등한 osmolarity 인공 뇌 척추 액체 (실제)에서 KCl의 다양 한 농도의 솔루션을 준비 합니다. 우리는 0.1, 1, 4.5, 10, 100 m m K+ 실제, 전극의 교정에 대 한 사용. 이러한 교정 솔루션에 대 한 조리법은 표 1에 나열 됩니다.
화학 MW 마지막 m m 0.1 m m [K +] 1 m m [K +] 4.5 m m [K +] 10 m m [K +] 100 m m [K +]
(g / mol)
NaCl 58.44 다릅니다. 1.51 g 1.50 g 1.44 g 1.4 g 0.345 g
KCl 1 M 주식 다릅니다. 20 µ l 200 µ l 900 µ l 2 ml 20 ml
CaCl2 1 M 주식 2 400 µ l
MgCl2 1 M 주식 1 200 µ l
NaH24 119.98 1.2 0.29 g
NaHCO3 84.01 26 0.437 g
D-포도 당 180.16 10 0.360 g
q.s. 200 ml

표 1입니다. 칼륨 교정 솔루션

  1. Microelectrode 교정
    1. 실험을 시작 하기 전에 적어도 20 분 동안 95% O2/5% CO2 와 모든 솔루션을 거품. 4.5 m m [K+] 목욕 perfusing 시작 분 당 3 mL의 속도로 실제. K+ 선택적인 전극을 조작자에 전극 headstage에 연결 된 전극 홀더 넣으십시오. 이 headstage는 적절 한 앰프에 연결 된다. 목욕 perfusate에는 전극의 끝을 삽입 합니다.
    2. Ag/AgCl 접지 전극은 동일한 솔루션에서 목욕을 하 고 흐름은 꾸준한 확인 하십시오. Stepwise 방식에서 교정 솔루션을 적용 하 고 전극 팁에 걸쳐 mV에 잠재적인 변화를 기록 합니다. 다음 솔루션으로 전환 하기 전에 안정적인 값에 도달 하는 전극 팁에서 잠재력을 기다립니다
    3. 전극 끝에 교정 솔루션의 응용 프로그램에 대 한 응답에서 안정 상태 전압 변화를 측정 합니다. 전극 응답의 사면은 적어도 52와 58 보다 더 큰 확인 mV 로그 변경 [k+] 당.

3입니다. 급성 Hippocampal 뇌 조각의 준비

  1. 조각 솔루션의 준비
    1. 500 mL 자당 준비 절단 솔루션 구성: 194 m m 자당, 30 m NaCl, 4.5 m KCl, 10mm D-포도 당, 1mm MgCl2m m, 1.2 m m NaH24, 26mm NaHCO3, 290-300 mOsm, 5% CO2와 95% O2 포화.
    2. 준비의 구성 기록 솔루션 (실제)의 1-2 리터: 124 mM NaCl, 4.5 m m KCl, 1 mM MgCl2, 10 m m D-포도 당, 2 mM CaCl2, 1.2 m m NaH24및 26 m m NaHCO3; (버블링) 후 pH 7.3-7.4, 290-300 mOsm, 5% CO2와 95% O2 포화. 솔루션을 기록 뇌 조각 홀더 챔버를 포함 하는 비 커를 32-34 ° c.에 그것을 유지합니다 비 자금 얼음 물으로 vibratome 챔버를 채우십시오.
  2. 급성 슬라이스 준비
    1. 깊이 2-3 mL isoflurane에 미리 충전 된 벨 항아리에 그것을 배치 하 여 마우스를 anesthetize. 발가락 핀치 반사에 대 한 확인 하 고 응답 하지 않는 경우 신속 하 게 목을 벨 동물 프로토콜에서 요구 하는으로 한 쌍의 날카로운가 위 또는 단두대를 사용 하 여.
    2. 2-3 cm 절 개 잘라 중간 선 따라 두 피를 두개골의 꼬리 부분에서가 위를 사용 하 여 확인 합니다. 수동으로 제거 두 피, 하는 동안 두 개의 1 cm 가로 절 측면을 따라 구멍 매그넘에서 두개골의 확인 합니다. 그럼, 좋은 위를 사용 하 여 잘라 절 개 코에 두개골의 뒤에서 중간에 따라 두개골의 길이.
    3. 중간 선 근처 삽입 미세 집게를 사용 하 여 두 부분에 베인된 두개골을 철회. 두개골에서 쥐의 뇌를 추출 하 고 블레이드를 사용 하 여 제거 하는 소 뇌 및 후 각 전구, 두뇌의 rostral 꼬리 부분에 각각 있습니다. 이러한 큰 균열, 피 질에서 그들을 구분 하 여 확인할 수 있습니다.
    4. 슈퍼 접착제를 사용 하 여 vibratome 트레이에 두뇌 블록을 탑재 합니다. Vibratome 트레이를 차가운 얼음 절단 솔루션을 채우십시오.
    5. 300 µ m 두께에서 코로나 비행기에 조직 섹션을 잘라. 보통 6 코로나 hippocampal 조각은 수집할 수 있습니다.
    6. 각 섹션을 자른 후 즉시 전송 조각 슬라이스 잡고 비 커 32-34 ° c 예 열 섹션을 포함 하는 비 커를 제거 하기 전에 20 분 동안이 온도에 섹션을 계속 하 고 녹음 전에 적어도 20-30 분 동안 실내 온도에 배치.

4. 전기 Evoked K+ 역학의 측정

  1. 조각 준비 설정
    1. 부드럽게 뇌 조각 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 목욕에 놓고 부드럽게 나일론 문자열 플래티넘 하프와 장소에서 개최 합니다.
    2. 바이 폴라 자극 전극의 팁 서로 평행한 조각의 평면 수준 확인 합니다. 천천히, 6-7 초 동안 삽입 전극 CA3 지층 radiatum에 약 40-50 µ m 깊은 Schaffer collaterals를 자극. 코로나 섹션에서 CA3 식별할 수 있습니다 약 hippocampal genu에과 립 세포 층에 해 마 적절 한 측면의 부분으로 중간과 복 부 피라미드 세포 층에 떨어지는 지층 radiatum와 함께.
    3. 조심 스럽게 삽입 K+-깊은 약 3 4 초 동안 전극을 천천히 낮추어 CA1 지층 radiatum 약 50 µ m으로 선택적인 전극. Stimulations 슬라이스를 적용 하기 전에 전극에 걸쳐 안정 가능성을 허용:이 보통 5 ~ 10 분 정도 걸립니다. 조각 전시 자발적인 경우 extracellular k+ 변경 삭제 그리고 새로운 조각으로이 과정을 반복 합니다.
  2. 측정 갖는 K+ 출시
    1. 수동으로 디지털 응답을 녹음 하면서는 자극에 방 아 쇠를 우울 하 여 전기 자극 (8 펄스)의 열차를 적용 합니다. 10 Hz와 1 ms 펄스 폭, 10 µ A 자극 진폭에서 시작에서 자극을 적용 합니다.
    2. 최대 K+ 응답 진폭 감지 될 때까지 2의 요인에 의해 증가 자극 진폭을 적용 합니다. 표시 되지 않으면 어떤 응답 단위로 100 µ m의 자극 사이트에 가까이 K+ 전극의 위치를 이동 하는 경우
    3. 절반 최대한 응답을 생성 하는 자극 진폭을 결정 합니다. 우리의 경험에서는, 이것은 준비 품질, 동물, 그리고 자극 전극 및 K+ 선택적인 전극 사이의 거리의 나이에 따라 40-160 µ A 사이.
    4. 동일한 조각에서 사용 하 여 자극 진폭 절반 최대한 응답을 생성 하는 진폭 보다 한 단계 (예: 반 최대한 응답을 생성 하는 80 µ A 경우 사용 40 µ A) 펄스의 수를 증가의 자극 기차를 적용. 처음, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 펄스의 열차 사용 했습니다.
    5. K+ 신호 전기 자극된 Schaffer 민간인 목욕의 활동 전위 발생에 의해 중재는 것인지 10 분 동안 0.5 µ M TTX 실제에 적용 하 고 자극 프로토콜을 반복 합니다. 갖는 무반응을 관찰 한다.
    6. 마친 후 슬라이스 실험, 전극은 전극 교정 솔루션에서 다시 보정 하 여 자사의 responsivity를 유지 하 고 있다 고 응답 보장 초기 교정에서 10% 이상 벗어나지는 확인

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Representative Results

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Extracellular K+의 선택적 측정을 위해 우리는 깨끗 한 붕 규 산 유리 펫 (그림 1A)의 silanization 통해 소수 레이어와 코팅 이온 선택적 microelectrodes 준비. 이 코팅 전극의 끝에 휴식 하 고 전극 팁 (그림 1B)에 좁은 개방을 통해 K+ 플럭스만을 허용 하는 valinomycin를 포함 하는 K+ ionophore를 수 있습니다. 못쓰게 백필 염와 K+ ionophore 전극, 후 전극 시험 될 수 있다 그들의 신속 하 고 선형 변화에 대응 stepwise 목욕 K+ 농도 (그림 3A)와 그들의 응답에 대 한 목욕 K+ 염 분에 교정 범위 (그림 3B) 변경 또는 방식으로 실제 Nernst 방정식2에 의해 예측. 58.2 해야 약 선의 기울기를 결정 하기 위해 목욕 K+ 농도 대 한 잠재적인 안정 된 상태에서 변화를 그릴 수 있습니다 mV 로그 [K+], Nernst 방정식, 그리고 이상 52에 따르면 당 당 mV 로그인 [K+] (그림 3C). 우리는 또한 K+ 선택적인 전극의 응답 속도 테스트 하 고는 그들은 약 85 ms (3D 그림,E)의 상승 및 부패 시간 상수와 K+ 에 5.5 m m 변화에 반응을 발견.

LCD 디스플레이 자극의 위치를 식별 하 고 기록 전극에 연결 된 표준 직 립 현미경 electrophysiological 녹음 장비에 의하여 이루어져 있다. 아니 특별 한 광학 K+ 와 자극 전극;의 시각적 배치에 필요한 우리 5 배 또는 10 배 목표 렌즈 및 할로겐 전구에서 하얀 빛을 사용 하지만 백색 LED 대신 사용 될 수 있었다. 자극 전극 자극 아이 솔 레이 터, depolarizing는 자극 또는 다른 그런 타이밍 장치에서 펄스의 타임된 배달을 통해 현재 제공의 출력에 연결 된다. 다른 말로 자극을 제공 합니다 2 V, 10-20 Hz의 열차 타이밍 펄스 자극 아이 솔 레이 터. 이 펄스를 받으면 자극 아이 솔 레이 터는 다음 자극 전극에 원하는 전류를 제공 합니다. 기록 전극은 전극 홀더, headstage, 증폭기 및 A/D 보드 electrophysiological 레코딩 소프트웨어 (그림 4A)와 PC에 인터페이싱 하는 연결에 연결 된다. 전극 성공적으로 보정 되어 급성 조각 준비 된 후에, 실제 perfusate에는 슬라이스를 배치할 수 있습니다. Schaffer collaterals, K+자극-선택적 전극 CA1 지층 radiatum 내 고 필드 자극 전극은 내는 CA3 (그림 4B).

전극 배치 되었습니다 일단 K+ 기록에는 안정적인 기준선에 도달 했습니다 다음 현재 진폭 증가의 펄스에 적용할 수 있는 조각 (그림 5, 상단). 이 활동의 파형 TTX 응용 프로그램 (그림 5, 하단)으로 폐지 되는 지 수 감퇴 속도, K+ 의 급속 한 증가으로 나타납니다.

Figure 1
그림 1 : Silanization 반응 및 K+ 선택적 microelectrode 아키텍처의 다이어그램. A. 붕 규 산 유리의 노출된 극 지 수 산 기 그룹 및 silanization 시 약 dichlorodimethylsilane (DDS) 사이 발생 하는 silanization 반응의 도식 대표. 이 반응에는 얇은 막 형태로 K+ ionophore 수 있는 소수 성, 유리의 표면을 렌더링 합니다. B. K+ 선택적 microelectrode의 다이어그램. 전극 염 경우 포함 이며 K+ 선택적 솔루션은 끝에 1-2 m m 두꺼운 층에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : DDS 추출의 다이어그램. 컨테이너에서 DDS 추출 질소 교체 절차의 도식 적인 표현입니다. DDS 휘발성과 가연성 이며 때 높은 농도에 따라서 그것은 불활성 질소 가스를 제거 하는 DDS를 대체 하는 데 필요한 대기 가스와 심하게 반응 수 있습니다. 질소로 채워진 풍선에 바늘 주사기 또는 적절 한 튜브를 통해 연결 되어 있습니다. 이 바늘은 컨테이너에 질소 가스 (N2) 흐름을 허용 하는 컨테이너에 실 란 트를 통해 삽입 됩니다. 별도로, 긴 (3-10 cm) 바늘 1 mL 주사기에 연결 이며 컨테이너에 삽입 합니다. 이 주사기 다음 질소 가스만 컨테이너를 입력 수 DDS, 추출 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : Microelectrodes의 교정. A. 식 염 수에 다른 K+ 농도의 목욕 관류 응용 프로그램 수 있습니다 신속 하 고 역 변화를 생산 Nernstian 잠재력에 전극 팁에서. B. 실제 K+ 의 Stepwise 응용 전극 팁 잠재력에 특성 및 안정적인 변화를 느끼게합니다. 4 전극; K+ 의 농도 증가에 대응 K+ 선택적인 전극의 mV 변경의 C. 줄거리 R2 는이 4 개의 전극에 대 한 0.9995 이다. 빠른 관류 시스템 목욕 응용 프로그램 10 m K m의+ + K 선택적 전극 팁에서 전압에 단계 응답을 발생합니다. E. 측정된 응답의 시간 (ms에 타우); 부패 및 상승 시간 사이의 차이가 감지 되었습니다 (± SEM, p 를 의미 = 0.939, 2 샘플 t-테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : Extracellular K+ 측정을 위한 장치. A. 전기 생리학 장비 방진 테이블에 연결 된 카메라와 LCD 디스플레이 조각 시각화에 대 한 고정 현미경의 구성 됩니다. K+ 전극 headstage, 증폭기 및 아날로그 electrophysiological 녹음 소프트웨어와 연결 된 PC에 신호를 출력 하는 디지털 보드를 고정 됩니다. 전기 자극 전극 자극 진폭 및 타이밍 자극 전달에 대 한 자극은 자극 아이 솔 레이 터에 연결 됩니다. B. 다이어그램 슬라이스 준비와 조각에서 다양 한 전극의 배치의 위치. CA3 rostral 피라미드 세포 층에 떨어지는 지층 radiatum와 hippocampal genu에과 립 세포 층에 해 마 적절 한 측면의 부분으로 약 식별 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 전기 evoked K+ 자료의 측정. K+ 의 대표적인 흔적 기저 상태 (맨 위)에서 기록 전극과 (아래)를 기록 하기 전에 5 분 동안 테트로도톡신 (0.25 µ M)의 신청에 그들의 손실에서 릴리스 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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우리가 여기에 설명 하는 방법 성인 쥐에서 급성 hippocampal 조각에서 Schaffer collaterals의 전기 자극에 대 한 응답에서 K+ 역학 평가 허용 했다. 준비 K+ 이온 선택적 microelectrodes의 우리의 방법은 앞서 설명한 절차12,13,,1415와 비슷합니다. 그러나,이 메서드는 장점이 대체 전극 구성 이라는 점에서 신속 하 고 단순한 K+ 선택적인 microelectrodes를 준비 하. 적절 한 교정 후 이러한 전극 튼튼하게 전기 자극, 동안 조각에 K+ 역학 측정을 발견 했다 그리고 이러한 응답 TTX에 의해 차단 되었습니다. 이 실험에서는 10 Hz에서 80-160 uA의 stimulations 사용 되었다; 그러나, 특정 실험에 대 한 관심의 뇌 영역에 대 한 자극 조건의 최적화 해야 합니다. 이 값으로 표시 됩니다.

전극의 응답의 사면은 58.2 이어야 한다 mV 로그 [K+] 당. 이러한 값은 K+ 선택적 반 투과성 막; 위한 네른스트와 Nicolsky Eisenman 방정식에서 예측 후자 더 나은 이온16사이 상호 작용에 대 한 계정. 전극 예상 방식으로 응답 하지 않으면,이 두 가지 주된 이유 중 하나에 대 한 수 있습니다. 첫 번째는 silanization 수 적절 한 형태로 손실 또는 소금 다리를 되도록 막 발생 있습니다. 확인 막 현미경을 통해 관찰 하 여 그대로, 피 펫 솔루션 및 막 사이 명확한 인터페이스 이어야 한다. 또 다른 이유는, 염화는 전선에서 전류의 흐름을 방해 하는 피 펫에 거품의 존재 수 있습니다. 거품, 관찰 하는 경우에 피 펫 및 그들을 제거 하는 적극적으로 영화 제거 합니다. 이러한 솔루션은 실패, 다시 또 다른 K+ 선택적인 전극 또는 더 이상 또는 더 높은 온도에 대 한 silanization를 반복 합니다. 그러나, 그것은 새로운 두뇌 지역 공부 하거나 새로운 microelectrode 테스트 때마다 이러한 키 컨트롤을 반복 하는 것이 중요.

두 특정 증폭기가이 실험에 사용 된 있지만 다른 앰프 보다 크거나 500 m ω 입력된 임피던스는으로 사용 될 수 있습니다. 우리 K 범위+ 농도 끝났다 어느 설정 전압 응답의 기울기에 차이가 발견 데 500 m ω와 5 GΩ 입력된 임피던스 전극 보정, (에서 ten-fold 변경 당 56.9 ± 0.7와 56.5 ± 0.9 mV [K+ < / c1 >] 500 m ω 및 5 GΩ 입력 임피던스, 각각; P = 0.759, 쌍 t-테스트, n = 4 전극).

우리는 또한 10 m m (그림 3D) 4.5에서 [k+] 알려진된 점프를 전극의 응답 시간을 추정 하 빠른 솔루션 스위치를 사용. 전극 반응을 상승 및 붕괴 시간 (타우) 85 ± 12와 85 ± 15 ms, 각각. 이에 관하여 우리의 사용자 정의 빠른 솔루션 스위처를 위한 솔루션 교환 활동 했다 따라서, 85 ± 27 양 K+ 선택적인 전극 속도 론으로 빨리 우리는 고용 솔루션 스위처와 K+ 의 역학 보다 훨씬 빠른에 응답 Schaffer 부수적인 자극 (그림 5) 결과로 증여는 extracellular 경제 이러한 데이터 K+ 선택적인 전극 K+ 축적 및 클리어런스 뇌 조직에서의 활동을 추정에 사용 될 수 있다는 것이 좋습니다. 그러나, 미래에 적절 한 컨트롤을 작동 하 고 교정에 사건-의해-사건을 기준으로 필요 하 게 됩니다. 그것은 귀중 한 녹음 실에서 솔루션 교환 활동을 이해 하는 시간을 보내고 하는 것이 좋습니다.

우리는 품질 및 조각에 K+ 측정의 안정성에 영향을 주는 세 가지 매우 중요 한 요소를 발견. 첫 번째는 준비의 품질, 조직 건강 및 사용 하는 동물의 나이 관련 된 것으로 나타납니다. 이 연구를 위해 우리는 ~ 12 주 오래 되 C57/Bl6N 쥐를 이용 했다. 드문 경우에, 우리 자연 K+ 변동 ~0.1 m m에 이른다 고 5-10 초; 지속 조각 발견 이 분할 영역 삭제 했다. 두 번째 녹음 microelectrode의 품질입니다. 기본 문제는 시간 및 가져온된 유리 모 세관의 silanization에 사용 되는 온도. 좋습니다 > 최소한 6 시간 동안 170 ° C (하룻밤은 허용) 또는 30 분 동안 200 ° C에서. 부족 한 난방 silanization 시 약으로 전극의 전극 유지 하지 않는 안정적인 상태 잠재적인 K+ ionophore의 점진적 손실이 발생할 수 있습니다. 또한, 준비할 때 전극, 즉 대략 평균 셀 시체 (그림 1B)의 크기에 10-20 μ m의 직경을 가진 팁에 K+ ionophore의 얇은 레이어 (1-2 m m)를 배치 하는 것이 좋습니다. 지나치게 넓은 팁을 아프게 하지 마십시오 또는 K+ 선택적 막 무결성을 잃게 될 것 이다 고 전극 실패 합니다. 이 단계는 올바른 크기의 팁을 얻으려면 연습이 필요할 수 있습니다. 너무 좋은 팁 또는 너무 두꺼운 층의 K+ 선택적인 전극 적절히 구성 된 전극에 비해 느린 응답을 가질 수 있습니다. 세 번째 요소는 자극 전극과 K+ 선택적인 전극 사이의 거리입니다. 그러나 우리 사용 약 500 µ m의 전극 간 거리, 최적의 거리 개인의 두뇌 영역으로 상당히 변화할 수 있다 하 고 특정 실험에 대 한 신중 하 게 고려 될 필요가 있을 것 이다.

싱글 배럴 구성 뿐만 아니라 현재 K+를 만들기 위한 여러 가지 방법이 있습니다-양극과 동심에 선택적인 microelectrodes 형식17. 이러한 방법의 게시 설명에 비해 단일 채널 전극은 두 가지 주요 단점: 1) 약간 큰 팁 직경 (~ 10 대 4 µ m), 세포 외 공간 바이 폴라와 동심 comparted의 큰 혼란을 일으킬 수 있는 전극, 및 2) 호환 바이 폴라 전극에서 여러 이온 종의 동시 측정. 그러나, 단일 채널 전극은 여러 가지 이점을 제공합니다. 특히, 이러한 전극 5 분 미만에 날조 될 수 있다 하 고 그러므로 더 일회용 만든 고 실험 하기 전에 신속 하 게 보정 수 있습니다. 따라서, 과정 실험 동안 전극 파손의 위험 관심사의 작습니다. 또한, 접지 전극과 기록 전극은 물리적으로 구분 하 여 목욕의 볼륨, 이므로 동심에 바이 폴라 전극 실패 이어질 수 있는 전극의 끝에 소금 다리의 형성을 위한 기회 전극입니다. 단일 채널 전극의 응답 시간 이지만 바이 폴라 전극 및 가능성이 동심에 비해 전극 (~ 20 ms) 보다 더 빨리 우리의 빠른 관류 시스템 80 ms (그림 3E 순서 응답 시간 측정에만 허용 ). 또한, 이러한 전극 큰 팁 저항 있고 높은 입력된 저항을 가진 증폭기의 사용을 요구 한 바이 폴라 전극에 비해 낮은 잡음을 제공 합니다. 마지막으로,이 전극 전문된 micromanipulator 또는 headstage 동심 전극에 대 한 필요를 사용 하 여가 필요 하지 않습니다. 균형에, 건설의 장점과 단일 채널 전극의 사용의 용이성 단점을 보다 큽니다.

우리가 여기 K+ 역학 분할 영역을 측정 하는 데 사용 하는 접근 K+ 레 귤 레이 션을 공부에 많은 두뇌 지구에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 K+의 사용 방법을 보여 줍니다 있지만-선택적 전극에서 전기 evoked 칼륨 이온의 역학의 측정에 대 한 뇌 조직,이 프로토콜 사용할 수 있습니다 광범위 하 게 많은 다른 조직에서 하는 것은 K+ 역학 측정 합니다. 이러한 상황 포함 될 수 있습니다 자연 역학과 변화 응답 약리, optogenetic, 또는 chemogenetic 세포 활성화. 이 microelectrodes는 어떤 실험실 도구 상자에이 기술의 급속 한 통합을 허용으로 충분 한 품질과 신뢰성으로 만들 수 있습니다. 건강 및 질병 상태에 K+ 농도의 상세한 분석 수 있도록 추가 검색 및 다양 한 분자 및 세포 구성 요소 기여할 휴식 K+3, 농도의 정량화 18,19.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

Khakh 실험실은 NIH MH104069에 의해 지원 되었다. Mody 실험실 NIH NS030549에 의해 지원 되었다. J.C.O.는 NIH T32 신경 칩 훈련 Grant(NS058280) 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome DSK Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice Taconic Stock#B6
Microscope Olympus BX51
Electrode puller Sutter P-97
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2
pCLAMP10.3 Molecular Devices n/a
Custom microfil 28G tip World precision instruments CMF28G
Tungsten Rod A-M Systems 716000
Bipolar stimulating electrodes FHC MX21XEW(T01)
Stimulus isolator World precision instruments A365
Grass S88 Stimulator Grass Instruments Company S88
Borosilicate glass pipettes World precision instruments 1B150-4
A to D board Digidata 1322A Axon Instruments
Signal Amplifier Multiclamp 700A or 700B Axon Instruments
Headstage CV-7B Cat 1 Axon Instruments
Patch computer Dell n/a
Sodium Chloride Sigma S5886
Potassium Chloride Sigma P3911
HEPES Sigma H3375
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S0751
D-glucose Sigma G7528
Calcium Chloride Sigma 21108
Magnesium Chloride Sigma M8266
valinomycin Sigma V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene Sigma 40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate Sigma 60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane Sigma 85126-5ml
TTX Cayman Chemical Company 14964
Hydrochloric acid Sigma H1758-500mL
Sucrose Sigma S9378-5kg
Pipette Micromanipulator Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens Olympus PlanAPO 10xW

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References

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만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여
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Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. J. Vis. Exp. (135), e57511, doi:10.3791/57511 (2018).More

Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. J. Vis. Exp. (135), e57511, doi:10.3791/57511 (2018).

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