Kalium joner bidrar till vila membranet potential celler och extracellulära K+ koncentration är en viktig regulator av cellulära retbarhet. Vi beskriver hur man gör, kalibrera och använda monopolär K+-selektiv mikroelektroder. Med sådana elektroder kan mätning av elektriskt evoked K+ koncentration dynamics i vuxen Hippocampus skivor.
Kalium joner bidra avsevärt till att vila membranet potential celler och extracellulära K+ koncentration är därför en avgörande regulator av cell retbarhet. Förändrad koncentrationer av extracellulära K+ påverkar vilande membranet potential och cellulära retbarhet av skiftande jämvikter mellan sluten, öppen och inaktiverade stater för spänningsberoende jonkanaler som ligger bakom aktionspotential initiering och överledning. Därför är det värdefullt att direkt mäta extracellulära K+ dynamik i hälsa och sjuka stater. Här beskriver vi hur man gör, kalibrera och använda monopolär K+-selektiv mikroelektroder. Vi distribuerade dem i vuxna Hippocampus hjärnan skivor att mäta elektriskt evoked K+ koncentration dynamics. Förnuftig användning av sådana elektroder är en viktig del av den verktygslåda som behövs för att utvärdera cellulära och biofysiska mekanismer som styr extracellulära K+ koncentrationer i nervsystemet.
Kalium jonkoncentrationer är hårt reglerad i hjärnan, och deras variationer ett kraftfullt inflytande på vilande membranet potential av alla celler. Mot bakgrund av dessa kritiska bidrag är ett viktigt mål av biologi att bestämma de cellulära och biofysiska mekanismer som används för att ordentligt reglera koncentrationen av K+ i det extracellulära utrymmet i olika organ i kroppen1 , 2. ett viktigt krav i dessa studier är förmågan att mäta K+ koncentrationer exakt. Även om många delar som bidrar till kalium homeostas i hjärnan i friska och sjuka har varit identifierade3,4,5, har ytterligare framsteg minskat på grund av specialiserade förbereder ion selektiv mikroelektroder kalium mätning. Mikroelektrod sensorer representerar den gyllene standarden för att mäta K+ koncentrationer i vitro, i vävnad skivor och in vivo.
Nyare metoder för K+ övervakning är under utveckling med optiska sensorer, men dessa inte upptäcka en biologiskt relevant utbud av K+ koncentrationer eller har inte fullt prövats i biologiska system, även om de första resultaten visas lovande6,7,8. Jämfört med optiska sensorer, är mikroelektroder fundamentalt begränsat till en punktkälla mätning av joner, även om elektroden matriser kan förbättra den rumsliga upplösning9. Denna artikel fokuserar på singel-barreled mikroelektrod sensorer för övervakning av K+ dynamics.
I detta arbete, Vi rapporterar detaljerad stegvis förfaranden för att göra K+ selektiv mikroelektroder, använder en valinomycin-baserade kalium jonofor som tillåter mycket selektiv (104 faldigt K+ till Na+ selektivitet) K+ rörelse över membran10. En naturligt förekommande polypeptid, valinomycin fungerar som en K+ genomsläpplig por och underlättar flödet av K+ ner det är elektrokemiska gradient. Vi beskriver också hur du kalibrerar elektroderna, lagra och använda dem och slutligen hur du distribuerar dem för att mäta K+ koncentration dynamics i akut Hippocampus hjärnan skivor från vuxna möss. Användningen av sådana elektroder tillsammans med genetiskt modifierade möss som saknar specifika jonkanaler föreslog att reglera extracellulära K+ dynamics bör avslöja de cellulära mekanismer som används av nervsystemet för att styra omgivande koncentrationen av K + i den extracellulära miljön.
Den metod som vi beskriver här har tillåtit oss att bedöma K+ dynamics svar på elektrisk stimulering av Schaffer säkerheter i akut Hippocampus skivor från vuxna möss. Vår metod för att förbereda K+ ion selektiv mikroelektroder liknar tidigare beskrivna förfaranden12,13,14,15. Denna metod har dock fördelar över alternativa elektrod konfigurationer i att det är…
The authors have nothing to disclose.
Khakh labbet stöddes av NIH MH104069. Mody labbet stöddes av NIH NS030549. J.C.O. Tack det NIH T32 neurala mikrokretsar utbildning Grant(NS058280).
Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
Microscope | Olympus | BX51 | |
Electrode puller | Sutter | P-97 | |
Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
Patch computer | Dell | n/a | |
Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
D-glucose | Sigma | G7528 | |
Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |