Íons de potássio contribuem para o descanso potencial de membrana das células e a concentração extracelular de K+ é um regulador crucial da excitabilidade celular. Descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K+-seletivos microeletrodos. Usar tais eletrodos permite a medição da dinâmica de concentração de K+ eletricamente evocada em fatias hippocampal adultas.
Íons de potássio contribuem significativamente para o descanso potencial de membrana das células e, portanto, a concentração extracelular de K+ é um regulador crucial da excitabilidade da célula. Alterou a concentrações extracelulares K+ vai afectar a excitabilidade de celular e potenciais de membrana de descanso deslocando o equilíbrio entre Estados fechados, abertos e inativados para canais dependentes de voltagem íon que fundamentam o potencial de ação iniciação e condução. Portanto, é valioso para medir diretamente o extracelular K+ dinâmica na saúde e Estados doentes. Aqui, descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K+-seletivos microeletrodos. Nós lhes implantado em fatias hippocampal cérebro de um adulto para medir evocada eletricamente dinâmica de concentração de K+ . O uso criterioso de tais eletrodos é uma parte importante do kit de ferramentas necessária para avaliar os mecanismos celulares e biofísicos que controlam a concentração extracelular de K+ no sistema nervoso.
Concentrações de íons potássio estão fortemente regulamentadas no cérebro, e suas flutuações exercem uma poderosa influência sobre o potencial de membrana descanso de todas as células. À luz destas contribuições críticas, um objectivo importante da biologia é determinar os mecanismos celulares e biofísicos que são usados para regular firmemente a concentração de K+ no espaço extracelular em diferentes órgãos do corpo1 , 2. a capacidade de medir concentrações de K+ com precisão, constitui um requisito importante nestes estudos. Apesar de muitos componentes que contribuem para a homeostase do potássio no cérebro em Estados saudáveis e doentes foram identificados3,4,5, ainda mais progresso tem sido abrandado devido à natureza especializada do preparando íon seletivo microeletrodos para medição de potássio. Sensores de microeletrodos representam o padrão de ouro para medir K+ concentrações em vitro, em fatias de tecido e em vivo.
Novos enfoques para K+ de monitoramento estão em desenvolvimento utilizando sensores ópticos, porém estes não detectar uma gama biologicamente relevantes de K+ concentrações ou já não foram totalmente analisados em sistemas biológicos, embora os resultados iniciais Parece promissor,6,7,8. Comparado com sensores ópticos, microeletrodos são fundamentalmente limitados a uma medição de ponto fonte de íons, embora matrizes eletrodo poderiam melhorar a resolução espacial9. Este artigo enfoca os sensores de cano único microeletrodos para monitoração dinâmica K+ .
Neste trabalho, relatamos os procedimentos detalhados em etapas para fazer K+ seletivos microeletrodos, usando um ionóforo de potássio valinomicina-baseado que permite altamente seletivo (dobra4 10 K+ a seletividade Na+ ) K+ movimentação de membranas10. Um polipeptídeo natural, valinomicina atua como um poro permeável K+ e facilita o fluxo de K+ para baixo é um gradiente electroquímico. Também descreveremos como calibrar os eletrodos, como armazenar e usá-los e, finalmente, como implantá-las para medir a dinâmica de concentração K+ em fatias aguda hippocampal cérebro de ratos adultos. O uso de tais eletrodos juntamente com ratos geneticamente modificados que não possuem canais de íon específico propostos para regular extracelular K+ dinâmica deve revelar os mecanismos celulares usados pelo sistema nervoso para controlar a concentração ambiente de K + no meio extracelular.
O método que descrevemos aqui nos permitiu avaliar a dinâmica de K+ , em resposta à estimulação elétrica de colaterais de Schaffer em fatias hippocampal agudas de ratos adultos. Nosso método de preparação K+ microeletrodos seletiva de íons é semelhante a procedimentos anteriormente descritos12,13,14,15. No entanto, este método tem vantagens sobre configuraçõe…
The authors have nothing to disclose.
O laboratório de Khakh foi apoiado pelo NIH MH104069. O laboratório Mody foi apoiado pelo NIH NS030549. J.C.O. graças a Grant(NS058280) de formação do NIH T32 Neural microcircuitos.
Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
Microscope | Olympus | BX51 | |
Electrode puller | Sutter | P-97 | |
Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
Patch computer | Dell | n/a | |
Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
D-glucose | Sigma | G7528 | |
Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |