Summary
Здесь мы представляем протокол для описания изоляции внеклеточного везикулы (EVs) в в vitro культурной среде от взрослых Schistosoma японский.
Abstract
Внеклеточные везикулы (EVs) являются мембранные везикулы, выпущенная различных клеток в внеклеточной микроокружения. EVs представляют население гетерогенных везикулы, чей размер диапазона от 40 до 1000 Нм. Накопленных доказательств указал, что EVs играют важную роль регулирования в возбудитель хост взаимодействий. Глубокое понимание schistosome EVs должны обеспечить понимание механизмов лежащие в основе взаимодействия schistosome хост, позволяя развития новых стратегий по борьбе с шистосомозом. Здесь мы стремимся дальнейшего изучения функций EVs в шистосомоз, представив протокол для изоляции и характеристика EVs от взрослых Schistosoma японский (S. Японский). EVs были изолированы от в vitro питательной среды с помощью центрифугирования, в сочетании с комплектом изоляции коммерческих exosome. Изолированные S. Японский EVs (SjEVs) обычно обладают диаметром 100-400 Нм и характеризуются просвечивающей электронной микроскопии и Западный blotting. Использование PKH67 краска меченых SjEVs продемонстрировал, что SjEVs относить на счет получателя клетки. В целом наш протокол предоставляет альтернативный метод для изоляции EVs от взрослых шистосомоз; изолированные SjEVs могут быть пригодны для функционального анализа.
Introduction
Внеклеточные везикулы (EVs) являются население малых мембраны прыгните везикулы, инкапсулированный с различными белки, липиды и нуклеиновых кислот. Недавние исследования показали, что EVs играют решающую роль в ячейке коммуникации и участвуют в регуляции многих физиологических процессов, включая развитие клеток, иммунных регулирование, ангиогенез и клеток миграции2, 3,4,5. Накопление доказательств показывает, что EVs, циркулирующих exosomes, а их груз, Мирна представляет потенциальные biomarkers некоторых заболеваний6.
Несколько простейших как Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziи лейшмании spp., показали, чтобы иметь возможность выделять EVs; Дополнительно были обнаружены глисты выделяют EVs в жизни хостов7. Было показано, что паразитарные EVs участвовать в поддержании инфекции, патогенности8и иммунных правила9. Последние исследования в шистосомоз 10,оба Schistosoma mansoni (S. mansoni)11 и12 S. Японскийуказали, что взрослый шистосомоз выделяют exosome как пузырьки, которые могут быть участие в функциональных положений конкретных биологических процессов.
На сегодняшний день, были использованы несколько методов изолировать внеклеточного везикулы, таких как ultracentrifugation, ультрафильтрация13, использование реагентов на полимерной основе, размер-гель-проникающей хроматографии и immunoaffinity изоляции. Эти различные методы имеют свои собственные преимущества и ограничения14. Как правило ultracentrifugation считается золотым стандартом метод для изоляции везикул. Однако этот метод страдает от ограничения потенциальных EV агрегации14.
Шистосомоз, пару методов были зарегистрированы для изоляции EV: к ним относятся ultracentrifugation11,12,10 и использование коммерческих EV изоляции комплект16 в несколько этапов (16яйца, schistosomula11, Взрослый шистосомоз10,12,17). Учитывая, что микровезикулы имеют широкий спектр размером от нескольких сотен нанометров до тысяч нанометров, мы разработали альтернативный метод, который сочетает в себе использование скамейке центрифуги, ультрафильтрации и коммерческих EV изоляции комплект изолировать EVs от Взрослый Schistosoma японский. Изолированные EVs обычно обладают диаметром 100-400 Нм и были успешно внедрено клетками получателя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были утверждены местным Этический Комитет Шанхай ветеринарных научно-исследовательского института, Китайская академия сельскохозяйственных наук (разрешение на номер: SHVRIAU-14-0101).
1. в Vitro культуры шистосомоз
Примечание: Шистосомоз представляют собой биологическую опасность. Рабочие должны носить латексные перчатки на все времена когда обработка червей, schistosomal подвески или другие связанные с биологическими материалами. Кролики Новой Зеландии были заражены cercariae ~ 2000 через брюшной экспозиции. Шистосомоз в стадии печени были собраны от кроликов, инфицированных S. Японский cercariae в 28 дней после инфицирования, перфузии печени и брыжеечных вен. В предыдущих публикациях отчетности исследования на мышах18были ссылки на процедуры червь коллекции.
- Собирайте паразитов в 500 мл стакан. Тщательно промойте их и аккуратно 3 x с 200 мл разогретую (37 ° C) PBS (рН 7,4).
- Отдельных пар червь ~ 200 для каждой чашке Петри 90 мм. Затем тщательно вымойте паразитов и аккуратно 2 x с 50 мл разогретую (37 ° C) RPMI 1640 питательной среды, содержащие 100 ед пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина.
- Поддерживать паразитов в 40 мл разогретой RPMI 1640 питательной среды без антибиотиков при 37 ° C, под 5% CO2 на плотности червь ~ 5 пар/мл по 2 ч в 90 мм Петри блюдо.
Отмечает: RPMI 1640 среднего не должен содержать сыворотки, в противном случае будут вводиться экзогенных внеклеточного везикул.
2. предварительно обработанного состояния СМИ
- Собирать питательной среды и затем центрифуга среднего на 4 ° C на 2000 × g для 30 минут, чтобы удалить яйца и червь вентральная мусора.
- Супернатант передать свежие трубки, а затем отфильтровать решения с помощью шприца фильтра 0.22 мкм.
- Собирать отфильтрованный раствор в dialyzed мешке (отсечения молекулярный вес: 3.5kD) и затем dialyze решения с помощью 8% PEG8000 раствор при температуре 4 ° C на ночь.
Отмечает: Этот шаг имеет важное значение для обогащения SjEVs для увеличения урожайности SjEVs изоляции.
3. изоляция SjEVs
- Dialyzed решение передать новой трубки, а затем добавить 0.5 томов реагента изоляции всего exosome.
- Mix решение хорошо, vortexing или закупорить вверх и вниз, чтобы обеспечить однородность раствора.
- Инкубируйте смеси на 2 ° C до 8 ° C на ночь.
- Центрифуга смеси на 15000 × г за 1 час на 2 ° C до 8 ° C.
- Аспирационная и удалить супернатант.
Отмечает: EVs содержатся в Пелле в нижней части трубки (не виден в большинстве случаев). - Ресуспензируйте Пелле EVs в 2 мл PBS и затем сохранить решение EVs-80 ° c до дальнейшего анализа.
4. характеристика EVs, западный Blotting
- Определите концентрацию белка SjEVs образца, например, путем анализа BCA.
- Подготовка 10-20 мкг EVs в 22,5 Буфер RIPA мкл. Затем добавьте 7,5 мкл 4 x загрузки буфера и тепла для 5 мин при 95 ° C.
- SjEVs белки разделяются геля SDS-PAGE 12%.
- Передача белки PVDF мембрану и затем зонд с анти CD63 антител (1:1, 000 разрежения), следуют зондирование с анти кролик IgG-ПХ (1:5, 000 разрежения).
- Используйте ECL обнаружения реагент для развития мембраны и обнаружить сигналы, хемилюминесценция Система.
5. характеристика EVs, просвечивающей электронной микроскопии
- 2 мкл изолированных SjEVs 200 formvar покрытием сетки сетка, а затем дайте ему высохнуть при комнатной температуре.
- Пятно с 2% фосфорвольфрамовой кислоты за 1 мин и затем дайте ему высохнуть при комнатной температуре.
- Загрузить сетки на держателя образца просвечивающий электронный микроскоп и подвергается 80 кв электроннолучевые для захвата изображения.
6. SjEVs этикетка с PKH67 и поглощения Assay клетки
Отмечает: Все последующие шаги были выполнены при температуре (20-25 ° C), если не указано иное.
- Перевести 5 мкг SjEVs решения на конусном днище полипропиленовые трубы и отрегулируйте громкость до 12 мл, добавив RPMI 1640 среднего.
- Центрифуга SjEVs на 110 000 g × 90 мин при температуре 4 ° C для Пелле SjEVs.
- После центрифугирования тщательно удалить супернатант.
Примечание: Обколоть краситель PKH67 следует не добавляется непосредственно SjEV Пелле, как это приведет к неоднородной окраски и жизнеспособность сокращение клеток. - Приготовляют раствор 2 x EV подвеска, добавив 1 мл разбавителя C SjEV гранулы; для обеспечения полной дисперсии, Ресуспензируйте с нежным закупорить.
- Незадолго до окрашивания в разбавителя C, готовить свежий 2 x раствор красителя, добавив 2 мкл раствора обколоть красителя PKH67 в 1 мл разбавителя C в полипропиленовые пластиковых пробирок и смешивания хорошо разойтись.
- Быстро добавьте 1 mL x 2, подвеска EV (шаг 6.4) по 1 мл 2 x раствор красителя (шаг 6.5) и сразу смешать образца, закупорить.
- Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 4 мин.
- Остановите окрашивание путем добавления 4 мл FBS и затем инкубировать 1 мин.
- Добавьте RPMI1640 средне-Отpегулиpуйте уpовень до 12 мл и затем центрифуги на 110 000 × g при 4 ° C 90 мин.
- Удалить супернатант и добавить средне RPMI1640 Ресуспензируйте PKH67 помечены SjEV гранул.
- Центрифуга на 110 000 × g при 4 ° C 90 мин мыть один раз и затем добавить PBS Ресуспензируйте SjEVs гранул.
7. SjEVs клеток поглощения Assay
- Mammalian клеток семян таких НКТЦ клонировать 1469 клетки или клетки HEK293T в 6-ну пластины (2 × 105 ячеек на хорошо) и культура клетки на ночь.
- Добавьте 5 мкг PKH67, меченного SjEVs и затем культура клеток при 37 ° C для 2-4 ч.
- После инкубации удалите среды и вымыть клетки с PBS дважды.
- Исправьте клетки с 4% раствор формальдегида для 15 мин и промывают дважды больше с PBS.
- Пятно клеточных ядер с 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Наблюдать за клетки, с помощью микроскопии флуоресцирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для количественной оценки урожайности изолированных SjEVs с использованием описанных протокола, мы использовали BCA assay протеина для доступа к концентрации белков изолированных SjEVs от 28-дневный взрослых шистосомоз. Как показано в таблице 1, концентрация белка SjEV, варьировались от 208 мкг до 250 мкг на 100 мл среды (Таблица 1). Размер частиц, как определяется Малверн наночастиц анализа, указал, что изолированные SjEVs варьировались от 100 Нм до 400 Нм, с высоким населением около 220 Нм в размер (рис. 1). Дальнейшие характеристика SjEVs, просвечивающей электронной микроскопии выявлены EVs быть круглой везикулы примерно 100-200 Нм в диаметре (рис. 2). Западной blotting анализ указал, что изолированные SjEVs были признаны, с использованием антител CD63, который является типичным EV маркером (рис. 3). Люминесцентная микроскопия наблюдения указал, что PKH67-меченых SjEVs были внутреннюю НКТЦ клон 1469 клетками и что SjEVs главным образом были распределены в цитоплазме клеток получателей (Рисунок 4).
| Образцы | EVs/100 мл питательной среды |
| #1 | 250 мкг |
| #2 | 208 мкг |
| #3 | 220 мкг |
Таблица 1: SjEVs белка полученных из культуры среднего; показано количество SjEVs доступ к BCA пробирного на 100 мл питательной среды, содержащие ~ 500 пар червь,.
Рисунок 1 : Размер распределение SjEVs изолированы от культурной среды. 20 мкл раствора SjEVs был разведен с 1000 мкл PBS; Затем смесь была проанализирована с помощью высокопроизводительных два угла частиц и молекулярного размера анализатор. Результат показан является представителем данных из трех независимых изоляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Характеристика SjEVs, просвечивающей электронной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Западный blotting анализ изолированных SjEVs против CD63 антитела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Освоение SjEVs на клетки млекопитающих. PKH, помечены SjEVs показаны зеленым цветом, в то время как клеточных ядер отображаются синим цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Недавние исследования по EVs показали, что schistosome, которую EVs играют важную роль в хост возбудитель взаимодействия3,9,12,16. Для дальнейшего решения своих нормативных функций, важно изолировать EVs от шистосомоз. Здесь мы описываем альтернативный метод для изоляции SjEV. Этот метод дает широкий диапазон размером SjEVs, от 100 Нм до 400 Нм, в взрослых S. Японский. Следующие поглощения assay клетки указал, что EVs, изолированных в протоколе описаны были успешно относить на счет получателя клеток и их связанные интерферирующим потенциально играть нормативной роли17.
EVs, которые могут быть выделяется много различных типов клеток, также присутствуют в различных жидкостях организма19. Следовательно важно избежать, чтобы искусственно введение экзогенного EVs в процессе SjEV изоляции. К примеру питательной среды не должен содержать сыворотки. Плотность червя в культуре в vitro должна быть разумно свести к минимуму потенциальной реакции на стресс и снижения смертности червей. Кроме того следует отметить, что различные этапы шистосомоз или червей из различных узлов могут представлять различные EVs. Следовательно крайне важно поддерживать паразитов в средах в пробирке , которые напоминают хост-среды, и условий, при которых SjEV изоляции должны быть согласованы. Кроме того мы не можем исключать возможность расхождений, связанных с SjEVs, вызванных стрессом культуры.
Здесь мы представляем собой протокол для изоляции SjEVs от 2 h в vitro культуры СМИ для взрослых шистосомоз. Преимуществом этого протокола является время короткой культуры сводит к минимуму стресс, которому подвергаются паразитов, которые могут привести к не физиологической секреции EV. Кроме того мы обнаружили, что SjEVs, изолированные, как описано в настоящем протоколе были относить на счет получателя клетки, предполагая, что эти SjEVs могут быть биологически активные17. В общем настоящий протокол позволяет эффективной изоляции SjEVs от взрослых червей с помощью стандартного лабораторного оборудования и позволяет их характеристика, используя Западный blotting и поглощение assay клетки. Изолированные EVs могут использоваться для дальнейшей характеризации хост возбудитель взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было, в части или в целом, поддержке национальных естественных наук фонд Китая (31472187 и 31672550) и сельскохозяйственной науки и технологии инновации программа Китайской академии сельскохозяйственных наук.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al.
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F.
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
