Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור חוץ-תאית שלפוחית (EVs) בידוד במבחנה בינוני בתרבית מ למבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum.
Abstract
חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם עלי הלוואי קרומיים שלפוחית שפורסמו על ידי מגוון רחב של תאים לתוך microenvironment חוץ-תאית. EVs לייצג אוכלוסייה של שלפוחית הטרוגנית, אשר גודל נע בין 40 ו- 1,000 ננומטר. ראיות המצטבר ציינו כי EVs תפקיד חשוב רגולטוריות פתוגן-פונדקאי אינטראקציות. הבנה עמוקה של schistosome EVs צריך לספק תובנות לגבי המנגנונים אינטראקציות schistosome-מארח, המאפשר פיתוח של אסטרטגיות הרומן נגד בילהרציה. כאן, אנו שואפים המשך מחקר EVs פונקציות ב- schistosomes על-ידי הצגת פרוטוקול להצפנה בידוד ואפיון של EVs מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum (S. japonicum). EVs הם בודדו אותנו מהמתרחש in vitro לקשרי תרבות בינוני באמצעות צנטריפוגה בשילוב עם ערכת בידוד exosome מסחרי. מבודדים japonicum ס EVs (SjEVs) בדרך כלל בעלי קוטר של 100-400 ננומטר, מאופיינים על ידי שידור מיקרוסקופיה אלקטרונית החיוורים ומכתים המערבי. השימוש PKH67 צבע התווית על-ידי SjEVs הוכיחה כי SjEVs הם לנחלתו של התאים הנמען. בסך הכל, פרוטוקול שלנו מספק שיטה חלופית עבור בידוד EVs מ schistosomes למבוגרים; SjEVs מבודדים עשוי להיות מתאים אנליזה פונקציונלית.
Introduction
חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם אוכלוסיה של קטן מאוגד-קרום שלפוחית אנקפסולציה עם חלבונים, ליפידים ו חומצות גרעין שונות. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי EVs לשחק תפקיד מכריע תקשורת, מעורבים בוויסות תהליכים פיזיולוגיים רבים, לרבות פיתוח תא, ויסות מערכת החיסון, אנגיוגנזה תא העברה2, 3,4,5. לצבירת ראיות מציין כי EVs, במחזור exosomes, ואת המטען שלהם miRNA מייצג פוטנציאל סמנים ביולוגיים של מחלות מסוימות6.
מספר חד-תאיים כגון Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, לישמניה spp-, הוכחו להיות מסוגל להפריש EVs; helminths בנוסף נמצאו להפריש EVs לתוך החיים המארח7. EVs טפיליות הוכחו להיות מעורב קיומו של זיהום, פתוגניות8ו חסין תקנה9. מחקרים אחרונים שהיו בשימוש schistosomes 10,שני mansoni עלקת הבילהרציה (S. mansoni)11 ו ס japonicum12 הראו, למבוגרים schistosomes מפרישים exosome דמויי שלפוחית שעשויים להיות מעורב בהוראות פונקציונלי של תהליכים ביולוגיים ספציפיים.
עד כה, היו בשימוש מספר שיטות כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית, כגון ultracentrifugation, אולטראפילטרציה13, השימוש של ריאגנטים מבוסס פולימר, גודל-הדרה, ו- immunoaffinity בידוד. אלה שיטות שונות בעלי משלהם-יתרונות ומגבלות14. באופן כללי, ultracentrifugation נחשב לשיטת תקן הזהב שלפוחית בידוד. עם זאת, שיטה זו סובל המגבלה של EV פוטנציאליות צבירה14.
ב- schistosomes, כמה שיטות דווחו לבידוד EV: אלה כוללים את השימוש המסחרי EV בידוד ערכת16 עבור מספר שלבים (ביצים16,12,11,ultracentrifugation10 schistosomula11,12,10,schistosomes בוגרים17). בהתחשב בעובדה. שלפוחיות זעירות הן של מגוון רחב של גודל בין ננומטרים מאות אלפי ננומטר, פיתחנו שיטה חלופית המשלבת עם השימוש של ספסל צנטריפוגה אולטראפילטרציה, ערכת בידוד EV מסחרית כדי לבודד את EVs מ עלקת הבילהרציה japonicumלמבוגרים. EVs מבודד בדרך כלל בעל קוטר של 100-400 ננומטר, הופנמו בהצלחה על ידי תאים הנמען.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית של מכון מחקר וטרינרי שנגחאי, האקדמיה הסינית למדעים חקלאי (מספר היתר: SHVRIAU-14-0101).
1. תרבות במבחנה של Schistosomes
הערה: Schistosomes מייצגים של חומרים מסוכנים. העובדים יש ללבוש כפפות גומי בכלל פעמים כאשר טיפול תולעים, המתלים schistosomal או אחרים הקשורים חומרים ביולוגיים. ניו זילנד ארנבים נדבקו בנגיף ~ 2,000 cercariae באמצעות חשיפה בטן. Schistosomes בשלב הכבד היו שנאספו ארנבים נגוע japonicum S. cercariae ב- 28 ימים לאחר הפגיעה על ידי זלוף של הכבד וורידים מצע המעי העליון. ההליכים של תולעת אוסף צריכה להפנות אליהם בפרסומים קודמים דיווח על מחקרים עכברים18.
- לאסוף טפילים בתוך 500-mL. רוחצים אותם ביסודיות את x 3 בעדינות עם 200 מ של טרופה (37 מעלות צלזיוס) PBS (pH 7.4).
- הפרד ~ 200 זוגות תולעת על כל צלחת פטרי 90 מ מ. לאחר מכן לשטוף ביסודיות הטפילים, בעדינות 2 x עם 50 מ של טרופה (37 ° C) RPMI-1640 תרבות בינוני המכיל 100 U של פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין.
- לשמור על טפילים ב- 40 מ של טרופה RPMI-1640 תרבות בינונית ללא אנטיביוטיקה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 -צפיפות של תולעת ~ 5 זוגות /mL עבור 2 h ב- 90 מ מ פטרי צלחת.
הערות: המדיום RPMI 1640 אינו אמור להכיל סרום, אחרת יהיה הציג אקסוגני שלפוחית חוץ-תאית.
2. מראש שטופלו תנאי מדיה
- לאסוף את המדיום תרבות, ואז centrifuge המדיום ב 4 ° C ב g × 2,000 למשך 30 דקות להסיר את ביצי התולעת הטגמנטום פסולת.
- להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים ולסנן ואז הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
- לאסוף את פתרון מסונן בשקית dialyzed (משקל מולקולרי ניתוק: 3.5kD), ואז dialyze את הפתרון באמצעות פתרון 8% PEG8000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערות: השלב זה חשוב להעשיר את SjEVs להגדלת התשואה של בידוד SjEVs.
3. בידוד של SjEVs
- להעביר את הפתרון dialyzed צינור חדש ולאחר מכן להוסיף 0.5 נפחי הכימית בידוד מוחלט exosome.
- מערבבים את הפתרון על ידי vortexing או pipetting למעלה ולמטה כדי להבטיח ההומוגניות של הפתרון.
- דגירה התערובת ב 2 מעלות צלזיוס 8 מעלות למשך הלילה.
- Centrifuge את התערובת ב g × 15,000 עבור h 1-2 ° C עד 8 ° C.
- האחות וזורקים את תגובת שיקוע.
הערות: EVs הכלולים בגדר בחלק התחתון של הצינור (לא גלוי ברוב המקרים). - Resuspend בגדר EVs ב 2 מ של PBS ולאחר מכן אחסן את הפתרון EVs ב-80 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף.
4. אפיון של EVs מאת סופג המערבי
- לקבוע ריכוז חלבון הדגימה SjEVs, למשל, על ידי BCA וזמינותו.
- הכינו 10-20 µg של EVs במאגר ריפה 22.5 µL. לאחר מכן להוסיף 7.5 µL של 4 x טעינת מאגר וחום במשך 5 דקות ב 95 ° C.
- להפריד חלבונים SjEVs על ידי ג'ל מרחביות-דף 12%.
- להעביר את החלבונים PVDF ממברנה, ואז בדיקה עם נוגדנים anti-CD63 (1:1, 000 דילול), ואחריו חיטוט עם הארנב אנטי איג-HRP (1:5, 000 דילול).
- השתמש ריאגנט לזיהוי ECL לפיתוח ממברנה, לזהות את הסימנים chemiluminescence מערכת הדמיה.
5. אפיון של EVs מאת במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים
- להוסיף 2 µL של SjEVs מבודדים רשתות מצופים formvar ל- 200 עם רשת שינוי, אז לאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר.
- כתם עם 2% חומצה Phosphotungstic עבור 1 דקות, ואז לאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר.
- לטעון את הרשתות אל בעל מדגם של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, נחשפים בקרן אלקטרון kV 80 עבור לכידת תמונה.
6. SjEVs תווית עם PKH67 ואת וזמינותו ספיגת תא
הערות: כל השלבים הבאים בוצעו בטמפרטורת החדר (20-25 ° C), אלא אם צוין אחרת.
- העברת µg 5 SjEVs פתרון לתוך צינור פוליפרופילן התחתון חרוט ולכוונן את העוצמה 12 מ על-ידי הוספת RPMI 1640 בינוני.
- Centrifuge את SjEVs ב g × 110,000 במשך 90 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה SjEVs.
- לאחר צנטריפוגה, תשאף היטב את תגובת שיקוע.
הערה: לצבוע ethanolic PKH67 צריכים לא להתווסף ישירות בגדר SjEV, כמו זה יביא מכתים הטרוגנית ואת הכדאיות תא מופחת. - להכין פתרון ההשעיה EV 2 x על-ידי הוספת 1 מ"ל של Diluent C בגדר SjEV; כדי להבטיח פיזור מלאה, resuspend עם pipetting עדין.
- לפני צביעת בדו Diluent, הכן טרי 2 x צבע פתרון על ידי הוספת 2 µL של הפתרון צבע ethanolic PKH67 1 מ"ל של Diluent C בשפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן ולערבב היטב כדי לפזר.
- להוסיף במהירות של 1 מ"ל של x 2 EV ההשעיה (שלב 6.4) עד 1 מ"ל של 2 x צבע פתרון (שלב 6.5) ומיד מערבבים המדגם על-ידי pipetting.
- דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 4 דקות.
- הפסק ההכתמה על-ידי הוספת 4 מיליליטר FBS ולאחר מכן תקופת דגירה של 1 דקות.
- הוסף RPMI1640 בינוני לכוונן את עוצמת הקול מ ל 12 ולאחר מכן צנטריפוגה ב g × 110,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע והוסף בינוני RPMI1640 resuspend את PKH67 הנקרא SjEV כדורי.
- צנטריפוגה ב g × 110,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות לשטוף פעם אחת ולאחר מכן להוסיף PBS כדי resuspend את כדורי SjEVs.
7. תא SjEVs ספיגה Assay
- תאים בתרבית של זרע כמו NCTC לשבט 1469 תאים או HEK293T תאים ב- 6-ובכן צלחות (2 × 105 תאים לכל טוב), התרבות התאים בן לילה.
- מוסיפים 5 µg SjEVs מתויג PKH67, ואז התרבות תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 h.
- לאחר דגירה, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם PBS פעמיים.
- לתקן את התאים עם 4% פתרון פורמלדהיד למשך 15 דקות, לשטוף פעמיים יותר עם PBS.
- כתם תא גרעינים עם 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי).
- לבחון את התאים באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לכמת את התשואה של SjEVs מבודדים באמצעות פרוטוקול המתואר, השתמשנו BCA חלבון assay כדי לגשת ריכוז חלבון SjEVs מבודדים schistosomes למבוגרים 28 יום. כפי שמוצג בטבלה 1, ריכוז חלבון SjEV נע בין 208 µg אל µg 250 לכל 100 מ של מדיום (טבלה 1). גודל החלקיקים, כפי שנקבע על ידי ניתוח nanoparticle מלוורן, ציין כי SjEVs מבודדים נע בין 100 ננומטר 400 nm, עם האוכלוסייה הגבוה ביותר בסביבות 220 nm בגודלם (איור 1). אפיון נוסף SjEVs על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים חשף EVs להיות עגול שלפוחית של 100-200 ננומטר קוטר (איור 2). המערבי סופג ניתוח ציין כי SjEVs מבודדים זוהו באמצעות נוגדנים CD63, אשר הוא סמן EV טיפוסי (איור 3). קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תצפית מצוינת SjEVs התווית על-ידי PKH67 הופנמו על ידי תאים 1,469 שיבוט NCTC, SjEVs בעיקר הופצו בציטופלסמה של הנמען תאים (איור 4).
| דגימות | EVs / 100ml תרבות בינוני |
| #1 | 250 µg |
| #2 | 208 µg |
| #3 | 220 µg |
טבלה 1: SjEVs חלבון המתקבל תרבות בינוני; מידת SjEVs לגשת על ידי BCA assay לכל 100 מ של תרבות בינוני, המכיל ~ 500 זוגות תולעת, מוצג.
איור 1 : גודל הפצה של SjEVs מבודדים מ בינוני בתרבית. µL 20 SjEVs פתרון היה מדולל עם 1000 µL PBS; . אז, התערובת נותחו באמצעות ביצועים גבוהים זווית שני חלקיקים בגודל מולקולרי מנתח. התוצאה המוצגת הינה נציגה של הנתונים מכל שלוש ומשום עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : אפיון של SjEVs על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : המערבי סופג ניתוח של SjEVs מבודדים נגד נוגדנים CD63. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : קליטת SjEVs על-ידי תאי יונקים. PKH הנקרא SjEVs מוצגים בירוק, בעוד האטום תא מוצגים בכחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים שנעשו לאחרונה על EVs הוכיחו את schistosome ש-evs לשחק תפקיד חשוב בפתוגן-פונדקאי אינטראקציות3,9,12,16. כתובת נוספת פונקציות התקינה שלהם, זה חיוני כדי לבודד EVs מן schistosomes. כאן, אנו מתארים שיטה חלופית עבור בידוד SjEV. שיטה זו מניבה בגודל מגוון רחב של SjEVs, מ- 100 ננומטר 400 nm, ב מבוגרים ס japonicum. וזמינותו ספיגת תא הבאות הצביעו EVs מבודד תחת פרוטוקול המתואר הופנמו בהצלחה על ידי תאים הנמען, כי miRNAs המשויך שלהם פוטנציאל לשחק בתפקידים רגולטוריים17.
EVs, אשר עשוי להיות מופרש על ידי סוגים שונים של תאים, נמצאים גם סוגים שונים של נוזלי הגוף19. כתוצאה מכך, חשוב להימנע באופן מלאכותי מה EVs אקסוגני במהלך התהליך של בידוד SjEV. לדוגמה, המדיום תרבות צריכה מכיל סרום. צפיפות תולעת בתרבות במבחנה צריכה להיות סבירה למזער את תגובת המתח פוטנציאל להפחית את שיעורי התמותה של תולעים. בנוסף, יצוין כי בשלבים שונים של schistosomes או תולעים ממחשבים מארחים שונים עשויים להציג EVs שונים. כתוצאה מכך, זה הכרחי כדי לשמור על טפילים במבחנה לסביבות של הדומים הסביבה המארח ולאחר התנאים תחת SjEV אשר מבוצעת בידוד חייב להיות עקבי. בנוסף, אנחנו לא ניתן לשלול את האפשרות של שונות הקשורות SjEVs הנגרמת על ידי תרבות מתח.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור בידודו של SjEVs מ- 2 h in vitro לקשרי תרבות המדיה עבור schistosomes למבוגרים. יתרון של פרוטוקול זה הוא זמן קצר תרבות ממזער את המתח שאליו נחשפים טפילים, והתוצאה עשויה להיות הפרשת EV-פיזיולוגיים. בנוסף, מצאנו SjEVs מבודדים כפי שמתואר פרוטוקול זה הופנמו על ידי תאים הנמען, רומז כי SjEVs אלה עשויים להיות פעילים ביולוגית17. בסך הכל, בפרוטוקול הנוכחי מאפשר הבידוד יעיל של SjEVs של מבוגר תולעים בעזרת ציוד מעבדה סטנדרטיים, ומאפשרת שלהם אפיון באמצעות סופג המערבי ואת וזמינותו ספיגת תאים. EVs מבודד עשוי לשמש לאפיון אינטראקציות פתוגן-פונדקאי נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה היה, בחלקו או במלואו, נתמך על ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31472187 ו- 31672550), אגרונומיה ו תוכנית חדשנות טכנולוגית של האקדמיה הסינית למדעי החקלאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al.
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F.
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
