Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att beskriva extracellulära blåsor (EVs) isolering i in vitro- odlade medium från vuxna Schistosoma japonicum.
Abstract
Extracellulära blåsor (EVs) är membranös blåsor utgivet en mängd celler i den extracellulära mikromiljö. EVs representerar en befolkning på heterogena vesicles, vars storlekar mellan 40 och 1000 nm. Samlade bevis anges att EVs spelar viktiga reglerande roller i patogen-värd-interaktioner. En djup förståelse av schistosome EVs bör ge insikter om mekanismerna bakom schistosome-värd-interaktioner, möjliggöra utveckling av nya strategier mot snäckfeber. Här, vi strävar efter att ytterligare studera EVs funktioner i schistosomes genom att presentera ett protokoll för isolering och karakterisering av EVs från vuxna Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs isolerades från in vitro- odlingsmedium med centrifugering kombinerad med en kommersiell exosome isolering kit. Den isolerade S. japonicum EVs (SjEVs) normalt har en diameter på 100-400 nm och kännetecknas av överföring elektroniska mikroskopi och western blotting. Användningen av PKH67 dye-märkt SjEVs har visat att SjEVs är internaliserad av mottagarens celler. Sammantaget ger våra protokoll en alternativ metod för att isolera EVs från vuxna schistosomes; den isolerade SjEVs kan vara lämplig för funktionell analys.
Introduction
Extracellulära blåsor (EVs) är en population av små membran-bundna blåsor inkapslade med olika proteiner, lipider och nukleinsyror. Senare studier visat att EVs spelar en avgörande roll i cell-cell kommunikation, och är involverade i regleringen av många fysiologiska processer, inklusive cell utveckling, immunreglering, angiogenes och cell migration2, 3,4,5. Ackumulerande bevis indikerar att EVs, cirkulerande exosomes och deras miRNA Last representerar potentiella biomarkörer för vissa sjukdomar6.
Flera protozoer såsom Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzioch Leishmania spp., har visat sig kunna utsöndra EVs; maskar har dessutom visat att utsöndra EVs till levande värd7. Parasitiska EVs har visat sig vara inblandade i underhållet av infektion, patogenicitet8och immunreglering9. Senaste studier i schistosomes båda Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 och S. japonicum12 har uppgett att vuxna schistosomes utsöndrar exosome-liknande blåsor som kan vara involverade i funktionella reglementet av specifika biologiska processer.
Hittills har har flera metoder använts för att isolera extracellulära vesicles, såsom ultracentrifugering, ultrafiltrering13, användning av polymerbaserade reagenser, storlek-utslagning kromatografi och immunoaffinity isolering. Dessa olika metoder har sina egna fördelar och begränsningar14. Allmänhet, ultracentrifugering anses metoden guldmyntfoten för vesikler isolering. Dock lider denna metod begränsning av potentiella EV aggregering14.
I schistosomes, ett par metoder har rapporterats för EV isolering: dessa inkluderar ultracentrifugering11,12,10 och användningen av kommersiella EV isolering kit16 för flera etapper (ägg16, schistosomula11, vuxen schistosomes10,12,17). Med tanke på att microvesicles har ett brett utbud av storlek från flera hundra nanometer till tusen nanometer, utvecklat vi en alternativ metod som kombinerar med användning av bänk centrifug, ultrafiltrering och en kommersiell EV isolering kit att isolera EVs från Adult Schistosoma japonicum. Isolerade EVs vanligtvis besatt en diameter på 100-400 nm och var framgångsrikt internaliseras av mottagarens celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av den lokala etiska kommittén för Shanghai veterinärmedicinska Research Institute, kinesiska jordbruket vetenskapsakademin (tillåta nummer: SHVRIAU-14-0101).
1. in Vitro kultur av Schistosomes
Obs: Schistosomes representerar ett biohazard. Arbetstagare bör bära latex handskar på alla tider när hantering maskar, schistosomal suspensioner eller andra relaterade biologiska material. Nya Zeeland kaniner var infekterade med ~ 2,000 cercariae via buken exponering. Schistosomes i levern skede insamlades från kaniner infekterade med S. japonicum cercariae på 28 dagar efter infektion av perfusion av levern och mesenteriska vener. Förfarandena i mask collection har refererats i tidigare publikationer rapportering studier i möss18.
- Samla parasiter i en 500 mL-glasbägare. Tvätta dem noga och försiktigt 3 x med 200 mL förvärmd (37 ° C) PBS (pH 7,4).
- Separata ~ 200 mask-par för varje 90 mm petriskål. Sedan tvätta parasiter och försiktigt 2 x med 50 mL förvärmd (37 ° C) RPMI-1640 odlingsmedium som innehåller 100 U av penicillin och 100 mg/mL streptomycin.
- Upprätthålla parasiter i 40 mL förvärmd RPMI-1640 odlingsmedium utan antibiotika vid 37 ° C under 5% CO2 på en densitet på ~ 5 mask par/ml för 2 h i 90 mm Petri maträtt.
Anteckningar: RPMI 1640 medium bör inte innehålla serum, annars exogena extracellulära vesikler kommer att införas.
2. förbehandlade skick Media
- Samla odlingsmediet och sedan Centrifugera mediet vid 4 ° C vid 2000 × g i 30 min ta bort ägg och mask tegmental skräp.
- Överför supernatanten till en frisk slang och sedan filtrera lösningen använder ett filter med 0,22 µm i sprutan.
- Samla den filtrerade lösningen i en dialyzed väska (molekylvikt cut-off: 3.5kD) och sedan dialyze lösningen med 8% PEG8000 lösning vid 4 ° C över natten.
Anteckningar: Detta steg är viktigt att berika SjEVs för att öka avkastningen av SjEVs isolering.
3. isolering av SjEVs
- Överför dialyzed lösningen till ett nytt rör och tillsätt sedan 0,5 volymer av totala exosome isolering reagens.
- Blanda lösningen väl av vortexa eller pipettering upp och ner för att säkerställa homogenitet av lösningen.
- Inkubera blandningen vid 2 ° C till 8 ° C över natten.
- Centrifugera blandningen på 15.000 × g för 1 h vid 2 ° C till 8 ° C.
- Aspirera och kasta bort supernatanten.
Anteckningar: EVs återfinns i pelleten på botten av röret (syns inte i de flesta fall). - Återsuspendera pelleten EVs i 2 mL PBS och sedan lagra EVs lösningen vid-80 ° C tills vidare analys.
4. karakterisering av EVs av Western Blotting
- Bestämma proteinkoncentration av SjEVs provet, exempelvis med BCA assay.
- Förbereda 10-20 µg av EVs i 22,5 µL RIPA bufferten. Lägg sedan till 7,5 µL av 4 x laddar buffert och värme i 5 min vid 95 ° C.
- Separat SjEVs proteiner av 12% SDS-PAGE gel.
- Överföra proteinerna till PVDF membran och sedan sond med anti-CD63 antikroppar (1:1, 000 utspädning), följt av sondering med anti-kanin IgG-HRP (1:5, 000 utspädning).
- Använda ECL upptäckt reagens för membran utveckling och upptäcka signaler genom en chemiluminescence imaging system.
5. karakterisering av EVs av transmissionselektronmikroskopi
- Tillsätt 2 µL av isolerade SjEVs till 200 mesh formvar-belagda galler och låt det torka i rumstemperatur.
- Fläcken med 2% Phosphotungstic syra för 1 min och låt det torka i rumstemperatur.
- Ladda gallren på prov innehavaren av transmissionselektronmikroskop och utsätts för en 80 kV elektronstråle för Bildinsamling.
6. SjEVs etikett med PKH67 och Cell upptag Assay
Anteckningar: Alla efterföljande steg utfördes vid rumstemperatur (20-25 ° C), om inte annat anges.
- Överföra 5 µg SjEVs lösning till en konisk botten polypropylen rör och justera volymen till 12 mL genom att lägga till RPMI 1640 medium.
- Centrifugera i SjEVs vid 110.000 × g i 90 minuter vid 4 ° C för att pellets SjEVs.
- Efter centrifugering, noggrant Aspirera supernatanten.
Obs: PKH67 enprocentig färgämnet bör inte läggas direkt till SjEV pelleten, eftersom detta skulle resultera i heterogena färgning och minskad cellernas viabilitet. - Bered en 2 x EV Suspension genom att lägga till 1 mL spädningsvätska C SjEV pelleten; för att säkerställa fullständig dispersion, blandas med milda pipettering.
- Strax före färgning i spädningsvätska C, förbereda en färsk 2 x Dye lösning genom att lägga 2 µL av PKH67 enprocentig dye lösningen 1 ml spädningsvätska C i en polypropylen centrifugrör och blanda väl för att skingra.
- Lägg snabbt till de 1 mL av 2 x EV Suspension (steg 6,4) 1 ml 2 x Dye lösning (steg 6,5) och omedelbart blanda provet genom pipettering.
- Inkubera blandningen vid rumstemperatur för 4 min.
- Stoppa färgningen genom att lägga till 4 mL FBS och sedan Inkubera i 1 min.
- Lägg till RPMI1640 medium för att justera volymen till 12 mL och sedan Centrifugera 110.000 × g vid 4 ° C i 90 min.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt RPMI1640 medium för att resuspendera den PKH67 märkt SjEV pellets.
- Centrifugera 110.000 × g vid 4 ° C i 90 minuter tvätta en gång och sedan lägga till PBS för att resuspendera SjEVs pellets.
7. SjEVs Cell upptag Assay
- Utsäde däggdjursceller såsom NCTC klon 1469 celler eller HEK293T celler i 6-väl tallrikar (2 × 105 celler per brunn) och odla cellerna över natten.
- Lägg till 5 µg PKH67-märkt SjEVs och sedan kultur celler vid 37 ° C i 2-4 h.
- Ta bort mediet efter inkuberingen och tvätta cellerna med PBS två gånger.
- Fixa cellerna med 4% formaldehydlösning för 15 min och tvättas två gånger mer med PBS.
- Fläcken cellkärna med 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI).
- Iaktta de celler som använder fluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att kvantifiera utbytet av isolerade SjEVs med beskrivna protokollet, brukade vi BCA protein assay åt protein koncentrationen av den isolerade SjEVs från 28-dagars vuxen schistosomes. I tabell 1visas SjEV protein koncentrationen varierade 208 µg 250 µg per 100 mL medium (tabell 1). Partikelstorlek, som bestäms av Malvern nanopartiklar analys, anges att den isolerade SjEVs varierade från 100 nm till 400 nm, med den högsta befolkningen runt 220 nm storlek (figur 1). Ytterligare karakterisering av SjEVs av transmissionselektronmikroskopi avslöjade EVs vara runda blåsor på cirka 100-200 nm i diameter (figur 2). Western blotting analys indikerade att de isolerade SjEVs kändes igen med hjälp av CD63 antikroppar, som är en typisk EV markör (figur 3). Fluorescence mikroskopi observation anges att de PKH67-märkt SjEVs var internaliseras av NCTC klon 1 469 celler och att SjEVs distribuerades främst i cytoplasman i mottagarens celler (figur 4).
| Prover | EVs / 100ml odlingsmedium |
| #1 | 250 µg |
| #2 | 208 µg |
| #3 | 220 µg |
Tabell 1: SjEVs protein som erhållits från odlingssubstratet; visas mängden SjEVs nås av BCA assay per 100 mL odlingsmedium, innehållande ~ 500 mask par,.
Figur 1 : Storlek distribution av SjEVs isolerade från odlade medium. 20 µL av SjEVs lösning var utspädd med 1000 µL PBS; sedan analyserades blandningen med hjälp av en högpresterande två vinkel partikel och molekylär storlek analyzer. Resultatet visas är representativt av data från tre oberoende isoleringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Karakterisering av SjEVs av transmissionselektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Western blotting analys av den isolerade SjEVs mot CD63 antikroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Upptag av SjEVs av däggdjursceller. Den PKH märkt SjEVs visas i grönt, medan cellkärnorna visas i blått. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyligen genomförda undersökningar om EVs har visat att schistosome EVs spelar en viktig roll i värd-patogen interaktioner3,9,12,16. Till ytterligare adress deras reglerande funktioner, är det viktigt att isolera EVs från schistosomes. Här beskriver vi en alternativ metod för SjEV isolering. Denna metod ger en rad storlek på SjEVs, från 100 nm till 400 nm, i vuxen S. japonicum. Följande cell upptag analysen indikerade att EVs isolerade under protokollet beskrivs var framgångsrikt internaliseras av mottagarens celler och att deras associerade MicroRNA potentiellt spela reglerande roller17.
EVs, som kan utsöndras av många olika typer av celler, finns också i olika typer av kroppsvätskor19. Följaktligen är det viktigt att undvika att artificiellt införa exogena EVs under processen med SjEV isolering. Odlingsmediet bör till exempel inte innehålla serum. Worm tätheten i in vitro- kultur bör vara rimligt att minimera den potentiella stressreaktionen och lägre dödlighet av maskar. Det bör dessutom noteras att olika stadier av schistosomes eller maskar från olika värdar kan uppvisa olika EVs. Följaktligen är det nödvändigt att bibehålla parasiterna i in vitro- miljöer som liknar värdmiljön och de villkor under vilka SjEV isolering utförs måste överensstämma. Dessutom kan vi inte utesluta möjligheten att variansen relaterade till SjEVs orsakade av kultur stress.
Här presenterar vi ett protokoll för isolering av SjEVs från 2 h i vitro Odlingsmedier för vuxen schistosomes. En fördel med detta protokoll är att kort kulturtid minimerar stress som utsätts för parasiter, vilket kan resultera i icke-fysiologiskt EV sekretion. Vi hittade dessutom att de SjEVs som isolerade som beskrivs i detta protokoll var internaliseras av mottagarens celler, vilket tyder på att dessa SjEVs kan vara biologiskt aktiva17. Sammantaget kan detta protokoll effektiv isolering av SjEVs från vuxna maskar använder vanlig laboratorieutrustning, och möjliggör deras karakterisering med western blotting och cell upptag assay. Isolerade EVT kan användas för att ytterligare karakterisera värd-patogen interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie var, delvis eller i sin helhet, stöds av National Natural Science Foundation Kina (31472187 och 31672550) och The Agricultural Science och Technology Innovation Program av den kinesiska Vetenskapsakademien jordbruket.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al.
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F.
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
