Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at beskrive ekstracellulære vesikler (EVs) isolation i in vitro- kulturperler medium fra voksen Schistosoma japonicum.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EVs) er hindeagtige vesikler udgivet af en række celler i den ekstracellulære mikromiljø. Evt repræsenterer en befolkning af heterogene vesikler, hvis størrelse varierer mellem 40 og 1000 nm. Akkumulerede beviser angivet at evt spiller en vigtig lovgivningsmæssig rolle i pathogen-værtssammenspil. En dyb forståelse af schistosome evt skal give indsigt i de underliggende schistosome-værtssammenspil, muliggør udviklingen af nye strategier mod Bilharziose mekanismer. Her, vi sigter mod at yderligere undersøgelse evt-funktioner i schistosomes ved at præsentere en protokol til isolering og karakterisering af evt fra voksen Schistosoma japonicum (S. japonicum). Evt blev isoleret fra in vitro- dyrkningsmediet ved hjælp af centrifugering kombineret med en kommerciel exosome isolering kit. Den isolerede S. japonicum evt (SjEVs) typisk har en diameter på 100-400 nm, og er karakteriseret ved transmission elektroniske mikroskopi og western blotting. Brugen af PKH67 dye-mærket SjEVs har vist, at SjEVs er internaliseret af de modtagende celler. Samlet set giver vores protokol en alternativ metode til at isolere evt fra voksen schistosomes; den isolerede SjEVs kan være egnet til funktionelle analyse.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EVs) er en befolkning på lille membran-bundet vesikler indkapslet med forskellige proteiner, lipider og nukleinsyrer. Nylige undersøgelser viste at evt spiller en afgørende rolle i celle-celle kommunikation, og er involveret i reguleringen af mange fysiologiske processer, herunder celle udvikling, immun forordning, angiogenese og celle migration2, 3,4,5. Akkumulere beviser indikerer at evt, cirkulerende exosomes, og deres miRNA last repræsenterer potentielle biomarkører for visse sygdomme6.
Flere protozoer såsom Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziog Leishmania spp., har vist sig at være i stand til at udskille evt; helminter har desuden fundet at udskille evt i levende vært for7. Parasitære evt har vist sig at være deltager i vedligeholdelse af infektion, patogenicitet8og immun forordning9. Nylige undersøgelser i schistosomes både Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 og S. japonicum12 har tilkendegivet, at voksen schistosomes udskiller exosome-lignende blærer, der kan være involveret i de funktionelle bestemmelser i specifikke biologiske processer.
Til dato, er flere metoder blevet brugt til at isolere ekstracellulære vesikler, såsom ultracentrifugering, ultrafiltrering13, brugen af polymer-baserede reagenser, størrelse-udelukkelse kromatografi og immunoaffinity isolation. Disse forskellige metoder har deres egne fordele og begrænsninger14. Generelt anses ultracentrifugering metoden guldstandarden for vesikel isolation. Imidlertid lider denne metode begrænsning af potentielle EV sammenlægning14.
I schistosomes, et par metoder er blevet rapporteret til EV isolation: disse omfatter ultracentrifugering11,12,10 og anvendelse af kommercielle EV isolering kit16 til flere faser (æg16, schistosomula11, voksen schistosomes10,12,17). Microvesicles er af en bred vifte af størrelse fra flere hundrede nanometer til tusinde nanometer, udviklet vi en alternativ metode, der kombinerer med brug af bænken centrifuge, ultrafiltrering og en kommerciel EV isolering kit at isolere evt fra voksen Schistosoma japonicum. De isolerede evt typisk havde en diameter på 100-400 nm og blev med held internaliseret af de modtagende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af det lokale etiske udvalg af Shanghai veterinære forskningsinstitut, kinesiske akademi for Jordbrugsforskning (tillade nummer: SHVRIAU-14-0101).
1. in Vitro kultur af Schistosomes
Bemærk: Schistosomes repræsenterer en biohazard. Arbejdstagere skal bære latex handsker på alle tidspunkter, når håndtering af orme, schistosomal suspensioner, eller andre relaterede biologiske materialer. New Zealand kaniner blev smittet med ~ 2.000 cercariae via abdominal eksponering. Schistosomes på leveren scenen blev indsamlet fra kaniner inficeret med S. japonicum cercariae på 28 dage efter infektionen ved perfusion af leveren og mesenteriallymfeknuderne vener. Procedurer af ormen samling har været der refereres til i tidligere publikationer rapportering studier i mus18.
- Indsamle parasitter i et 500 mL bægerglas. Vask dem grundigt og forsigtigt 3 x med 200 mL af forvarmet (37 ° C) PBS (pH 7,4).
- Adskille ~ 200 orm par for hver 90 mm petriskål. Derefter vask grundigt, parasitter og forsigtigt 2 x med 50 mL af forvarmet (37 ° C) RPMI-1640 næringssubstratet indeholdende 100 U af penicillin og 100 mg/mL af streptomycin.
- Vedligeholde parasitter i 40 mL af forvarmet RPMI-1640 næringssubstratet uden antibiotika ved 37 ° C under 5% CO2 med en tæthed på ~ 5 orm par /mL for 2 h i 90 mm Petri fad.
Noter: RPMI 1640 medium bør ikke indeholde serum, ellers eksogene ekstracellulære vesikel vil blive indført.
2. forbehandlet betingelse medier
- Indsamle næringssubstratet og derefter centrifugeres medium ved 4 ° C på 2.000 × g for 30 min til at fjerne æg og ormen tegmentale debris.
- Overføre supernatanten til en frisk tube og derefter filtrere løsning ved hjælp af et 0,22 µm sprøjte filter.
- Indsamle den filtrerede opløsning i en dialyzed pose (molekylvægt cut-off: 3.5kD) og derefter dialyze løsning ved hjælp af 8% PEG8000 løsning ved 4 ° C natten over.
Noter: Dette trin er vigtigt at berige SjEVs for at øge udbyttet af SjEVs isolation.
3. isolering af SjEVs
- Den dialyzed opløsning overføres til en ny tube og derefter tilføje 0,5 mængder af det samlede exosome isolation reagens.
- Bland løsning godt ved vortexing eller pipettering op og ned for at sikre ensartethed af løsningen.
- Inkuber blanding på 2 ° C til 8 ° C natten over.
- Centrifugeres blandingen på 15.000 × g i 1 time ved 2 ° C til 8 ° C.
- Opsug og supernatanten.
Noter: Evt er indeholdt i pellet i bunden af røret (ikke synlig i de fleste tilfælde). - Resuspenderes evt i 2 mL PBS og derefter gemme evt løsning på-80 ° C indtil yderligere analyse.
4. Karakteristik af evt ved Western Blotting
- Bestemme proteinkoncentration SjEVs prøve, fx af BCA assay.
- Forberede 10-20 µg evt i 22,5 µL RIPA buffer. Derefter tilsættes 7,5 µL af 4 x loading bufferen og varme i 5 min. ved 95 ° C.
- Separat SjEVs proteiner af 12% SDS-PAGE gel.
- Overføre proteinerne til PVDF membran og derefter sonde med anti-CD63 antistoffer (1:1, 000 fortynding), efterfulgt af sondering med anti-kanin IgG-HRP (1:5, 000 fortynding).
- Brug ECL påvisning reagens for membran udvikling og opdage signalerne ved en kemiluminescens imaging system.
5. karakterisering af evt af transmissions Elektron Mikroskopi
- Tilføje 2 µL af isolerede SjEVs til 200 mesh formvar-belagt gitre og så lad det tørre ved stuetemperatur.
- Pletten med 2% phosphorwolfram syre til 1 min og så lad det tørre ved stuetemperatur.
- Indlæse gitre på prøveholderen af transmissions-elektronmikroskop og udsat for en 80 kV elektronstråle for billedoptagelse.
6. SjEVs etiket med PKH67 og celle optagelse Assay
Noter: Alle efterfølgende trin blev udført ved stuetemperatur (20-25 ° C), medmindre andet er angivet.
- Overføre 5 µg SjEVs løsning i en konisk bund polypropylen rør og justere lydstyrken til 12 mL ved at tilføje RPMI 1640 medium.
- Der centrifugeres SjEVs på 110.000 × g i 90 min. ved 4 ° C for at pille SjEVs.
- Efter centrifugering, omhyggeligt Aspirér supernatanten.
Bemærk: PKH67 ethanoliske farvestof bør ikke føjes direkte til SjEV pellet, da dette ville resultere i heterogene farvning og reduceret cellernes levedygtighed. - Forbered en 2 x EV Suspension løsning ved at tilføje 1 mL fortynder c til SjEV pellet; for at sikre komplet dispersion, resuspend med blid pipettering.
- Lige før farvning i fortyndingsmiddel C, forberede en frisk 2 x farvestof løsning ved at tilføje 2 µL af PKH67 ethanoliske farvestof løsning til 1 mL fortynder c i en polypropylen centrifugeglas og blande godt for at sprede.
- Hurtigt tilføje 2 x EV Suspension (trin 6.4) til 1 mL af 2 x farvestof løsning (skridt 6,5) og straks Bland prøven når der afpipetteres 1 mL.
- Inkuber blanding ved stuetemperatur i 4 min.
- Stop farvning ved tilsætning af 4 mL af FBS og derefter inkuberes i 1 min.
- Tilføj RPMI1640 medium for at justere lydstyrken til 12 mL og derefter centrifugeres ved 110.000 × g ved 4 ° C til 90 min.
- Fjern supernatanten og tilføje RPMI1640 medium for at resuspend PKH67 mærket SjEV pellets.
- Der centrifugeres ved 110.000 × g ved 4 ° C til 90 min at vaske en gang og derefter tilføje PBS for at resuspend SjEVs pellets.
7. SjEVs celle optagelse Assay
- Frø mammale celler såsom NCTC klon 1469 celler eller HEK293T celler i 6-godt plader (2 × 105 celler pr. brønd) og kultur cellerne natten over.
- Tilføj 5 µg PKH67-mærket SjEVs og derefter kultur celler ved 37 ° C i 2-4 h.
- Efter inkubationen fjerne medium og vaske cellerne med PBS to gange.
- Fix cellerne med 4% formaldehyd løsning for 15 min og vaskes to gange mere med PBS.
- Pletten cellekerner med 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Observere celler ved hjælp af Fluorescens mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at kvantificere udbyttet af isolerede SjEVs ved hjælp af den beskrevne protokol, brugte vi BCA protein assay adgang til proteinkoncentration af isolerede SjEVs fra 28-dages voksne schistosomes. Som vist i tabel 1, SjEV proteinkoncentration varierede fra 208 µg til 250 µg pr. 100 mL af medium (tabel 1). Partikelstørrelse, som bestemmes af Malvern nanopartikel analyse, angivet, at den isolerede SjEVs varierede fra 100 nm til 400 nm, med den højeste indbyggertal omkring 220 nm i størrelse (figur 1). Yderligere karakterisering af SjEVs af transmissions Elektron Mikroskopi afslørede evt være runde vesikler ca 100-200 Nm i diameter (figur 2). Western blotting analyse viste, at de isolerede SjEVs blev anerkendt ved hjælp af CD63 antistoffer, som er en typisk EV markør (figur 3). Fluorescens mikroskopi observation indiceret at de PKH67-mærket SjEVs blev internaliseret af NCTC klon 1,469 celler og at SjEVs blev primært fordelt i cytoplasma af modtagerens celler (figur 4).
| Prøver | Evt-/ 100ml næringssubstratet |
| #1 | 250 µg |
| #2 | 208 µg |
| #3 | 220 µg |
Tabel 1: SjEVs protein fremstillet af næringssubstratet; Visningsvarigheden for SjEVs adgang til BCA assay pr. 100 mL af næringssubstratet, der indeholder ~ 500 orm par,.
Figur 1 : Størrelse distribution af SjEVs isoleret fra kulturperler medium. 20 µL af SjEVs løsning blev fortyndet med 1000 µL PBS; derefter blev blandingen analyseret ved hjælp af en højtydende to vinkel partikel og molekylær størrelse analyzer. Resultatet vist er repræsentant for data fra tre uafhængige isolering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Karakterisering af SjEVs af transmissions Elektron Mikroskopi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Western blotting analyse af den isolerede SjEVs mod CD63 antistoffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Optagelse af SjEVs af pattedyrsceller. PKH mærket SjEVs er vist i grøn, mens cellekerner er vist med blåt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De seneste undersøgelser af evt har demonstreret at schistosome evt spiller en vigtig rolle i vært-patogen interaktioner3,9,12,16. Til yderligere adresse deres regulerende funktioner, er det vigtigt at isolere evt fra schistosomes. Her beskriver vi en alternativ metode til SjEV isolation. Denne metode giver en bred vifte af SjEVs, størrelse fra 100 nm til 400 nm, i voksen S. japonicum. Følgende celle optagelse analysen viste at evt isoleret under de beskrevne protokol med succes blev internaliseret af de modtagende celler og at deres tilknyttede miRNAs potentielt spille regulerende roller17.
Evt, som kan udskilles af mange forskellige typer af celler, er også til stede i forskellige former for kropsvæsker19. Det er derfor vigtigt at undgå at kunstigt at indføre eksogene evt under processen med SjEV isolation. For eksempel bør næringssubstratet ikke indeholde serum. Ormen tæthed i in vitro- kultur skal være rimeligt at minimere de potentielle stressrespons og lavere dødelighed af orme. Derudover skal det bemærkes, at forskellige stadier af schistosomes eller orme fra forskellige værter kan præsentere forskellige evt. Derfor er det nødvendigt at opretholde parasitter i in vitro- miljøer, der ligner vært omgivelser, og de betingelser, under hvilke SjEV isolation er udført skal stemme overens. Vi kan desuden ikke udelukke muligheden for variansen relateret til SjEVs forårsaget af kultur stress.
Vi præsenterer her, en protokol til isolation af SjEVs fra 2 h i vitro kultur medier for voksne schistosomes. En fordel ved denne protokol er at korte kultur tid minimerer stress som parasitter er udsat, hvilket kan resultere i ikke-fysiologisk EV sekretion. Desuden fandt vi, at SjEVs isoleres som beskrevet i denne protokol blev internaliseret af de modtagende celler, tyder på, at disse SjEVs kan være biologisk aktive17. Samlet set denne protokol giver mulighed for effektiv isolering af SjEVs fra voksne orme, ved hjælp af almindeligt laboratorieudstyr, og giver deres karakterisering ved hjælp af western blotting og celle optagelse assay. De isolerede evt kan anvendes til yderligere karakterisere vært-patogen interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse var delvist eller helt, støttet af National Natural Science Foundation of China (31472187 og 31672550) og landbruget videnskab og teknologi Innovation Program af det kinesiske Musikkonservatorium Jordbrugsforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al.
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F.
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
