Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur extrazellulären Vesikel (EVs) Isolierung in in Vitro kultivierten Medium von Erwachsenen Schistosoma Japonicumbeschreiben.
Abstract
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind häutig Vesikel, die von einer Vielzahl von Zellen in der extrazellulären Mikroumgebung veröffentlicht. EFD repräsentieren eine Bevölkerung von heterogenen Vesikel, deren Größe zwischen 40 und 1.000 nm. Gesammelte Beweise gezeigt, dass EVs in Erreger-Wirt Interaktionen eine wichtige regulatorische Rolle spielen. Ein tiefes Verständnis der schistosome-EVs soll Einblicke in die Mechanismen schistosome--Wirt Interaktionen, ermöglicht die Entwicklung neuer Strategien gegen Bilharziose. Hier wollen wir weiter studieren EVs Funktionen in Schistosomen durch Vorlage eines Protokolls für die Isolierung und Charakterisierung des EFD vom Erwachsenen Schistosoma Japonicum (S. Japonicum). EVs wurden von in-vitro- Kulturmedium mit Zentrifugation kombiniert mit einem kommerziellen exosom isolierungskit isoliert. Die isolierten S. Japonicum EVs (SjEVs) in der Regel besitzen einen Durchmesser von 100-400 nm, und zeichnen sich durch Übertragung elektronischer Mikroskopie und westliche Beflecken. Die Verwendung von PKH67 Farbstoff-markierten SjEVs hat gezeigt, dass SjEVs durch den empfängerzellen internalisiert werden. Insgesamt bietet unser Protokoll eine alternative Methode zur Isolierung von EVs von Erwachsenen Schistosomen; die isolierten SjEVs möglicherweise für Funktionsanalyse geeignet.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind eine Bevölkerung von kleinen Membrane-springen Vesikel mit verschiedenen Proteine, Lipide und Nukleinsäuren gekapselt. Jüngste Studien gezeigt, dass EVs eine entscheidende Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation spielen und sind beteiligt an der Regulation des zahlreiche physiologische Prozesse, einschließlich der Zellentwicklung, Immunregulation, Angiogenese und Zelle Migration2, 3,4,5. Sammeln Beweise gibt, dass EVs, zirkulierenden exosomen und ihre Fracht MiRNA potenzielle Biomarker für bestimmte Krankheiten6darstellt.
Einige Protozoen wie Trichomonas Vaginalis, Trypanosomen Trypanosomaund Leishmania Spp., haben gezeigt, dass EVs; absondern zu können Helminthen zusätzlich gefunden wurden, EVs in lebenden absondern beherbergt7. Parasitäre EVs wurden gezeigt, bei der Aufrechterhaltung der Infektion, Pathogenität8und Immunregulation9einbezogen werden. Aktuelle Studien in Schistosomen beide Schistosoma Mansoni (S. Mansoni) 10,11 und S. Japonicum12 haben gezeigt, dass Erwachsene Schistosomen exosom erinnernden Bläschen absondern, die möglicherweise die funktionale Vorschriften bestimmte biologische Prozesse beteiligt.
Bisher wurden verschiedene Methoden zur extrazellulären Vesikel, wie Ultrazentrifugation, Ultrafiltration13, die Verwendung von Polymer-basierten Reagenzien, Größe-Ausschluss-Chromatographie und immunoaffinitäts Isolation isolieren. Diese verschiedenen Methoden besitzen ihre eigenen Vorzüge und Grenzen14. Im Allgemeinen gilt Ultrazentrifugation die Goldstandard-Methode für die Vesikel Isolierung. Allerdings leidet diese Methode aus der Beschränkung des potenziellen EV Aggregation14.
In Schistosomen, eine Reihe von Methoden zur Isolierung der EV gemeldet wurden: dazu gehören Ultrazentrifugation11,12,10 und die Verwendung von kommerziellen EV Isolation Kit16 für mehrere Stufen (Eiern16, Schistosomula11, Erwachsene Schistosomen10,12,17). Da die Microvesicles einer breiten Palette von mehreren hundert Nanometer bis tausend Nanometer groß sind, entwickelten wir einer alternativen Methode, die kombiniert mit dem Einsatz von Bank-Zentrifuge, Ultrafiltration und eine kommerzielle EV isolierungskit der EVs von isolieren Erwachsenen Schistosoma Japonicum. Die isolierten EVs in der Regel besaß einen Durchmesser von 100-400 nm und wurden erfolgreich durch den empfängerzellen verinnerlicht.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden genehmigt durch die lokale Ethikkommission des Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences (erlauben Nummer: SHVRIAU-14-0101).
1. in-vitro- Kultur von Schistosomen
Hinweis: Schistosomen repräsentieren ein Biohazard. Arbeiter tragen Latex Handschuhe überhaupt mal beim Umgang mit Würmern, schistosomal Suspensionen oder anderen biologische Materialien im Zusammenhang. Neuseeland-Kaninchen wurden mit ~ 2.000 Cercariae über Abdominal-Belichtung infiziert. Schistosomen Stadium der Leber wurden gesammelt von Kaninchen mit S. Japonicum Cercariae auf 28 Tage nach der Infektion durch Durchblutung der Leber und mesenterialen Adern angesteckt. Die Verfahren der Wurm Sammlung haben in früheren Publikationen Berichten Studien an Mäusen18verwiesen.
- Parasiten in einen 500-mL-Becherglas zu sammeln. Waschen Sie sie gründlich und sanft 3 X mit 200 mL vorgewärmt (37 ° C) PBS (pH 7,4).
- ~ 200 Wurm Paare für jedes 90 mm Petrischale zu trennen. Waschen Sie die Parasiten gründlich und sanft 2 X mit 50 mL vorgewärmt (37 ° C) RPMI-1640 Kulturmedium mit 100 U von Penicillin und 100 mg/mL von Streptomycin.
- Pflegen Sie Parasiten in 40 mL vorgewärmten RPMI-1640 Kulturmedium ohne Antibiotika bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 bei einer Dichte von ~ 5 Wurm Paare /mL für 2 Stunden in 90 mm Petri dish.
Noten: RPMI 1640 Medium sollte nicht Serum enthalten, ansonsten exogene extrazelluläre Vesikel vorgestellt werden.
(2) vorbehandelten Zustand Medien
- Sammeln Sie das Kulturmedium zu und Zentrifugieren Sie das Medium bei 4 ° C bei 2.000 × g für 30 min Eiern entfernen und Wurm tegmental Schutt.
- Übertragen Sie den überstand auf eine frische Rohr und Filtern Sie dann die Lösung mit Hilfe eines Filters 0,22 µm Spritze.
- Die filtrierte Lösung in einem dialysierter Beutel zu sammeln (Molekulargewicht Cut-Off: 3.5kD) und dann die Lösung mit 8 % PEG8000 Lösung bei 4 ° C über Nacht Dialyse.
Noten: Dieser Schritt ist wichtig, SjEVs zu bereichern, zur Erhöhung der Ausbeute der SjEVs Isolation.
(3) die Isolierung des SjEVs
- Übertragen der dialysierten Lösung zu einem neuen Schlauch und fügen Sie 0,5 Volumen des gesamten exosom Isolierung Reagens.
- Mischen Sie die Lösung gut durch aufschütteln oder pipettieren rauf und runter um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten.
- Inkubieren Sie die Mischung bei 2 ° C bis 8 ° C über Nacht.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 15.000 × g für 1 h bei 2 ° C bis 8 ° C.
- Aspirieren und den überstand verwerfen.
Noten: EVs enthalten die Kugel am unteren Ende der Röhre (in den meisten Fällen nicht sichtbar). - Aufschwemmen der EVs Pellet in 2 mL PBS und speichern Sie anschließend die EVs-Lösung bei-80 ° C bis zur weiteren Analyse.
4. Charakterisierung der EVs von Western Blotting
- Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins der SjEVs Probe, z. B. durch BCA-Assay.
- 10-20 µg des EFD in 22,5 µL RIPA Puffer vorzubereiten. Dann fügen Sie 7,5 µL 4 x laden Puffer und Hitze für 5 min bei 95 ° C.
- Trennen Sie SjEVs Proteine durch 12 % SDS-PAGE Gel.
- Die Proteine auf PVDF-Membran übertragen und dann mit Anti-CD63-Antikörper (1:1, 000 Verdünnung), gefolgt von sondieren mit Anti-Kaninchen IgG-HRP (1:5, 000 Verdünnung) Sonde.
- Verwenden Sie ECL-Erkennung Reagenz für Membranentwicklung und erkennen Sie die Signale zu, indem eine Chemilumineszenz imaging-System.
5. Charakterisierung der EVs von Transmissions-Elektronenmikroskopie
- 200 Mesh Formvar-beschichtete Netze 2 µL der isolierten SjEVs hinzu und dann bei Raumtemperatur trocknen lassen.
- Färben mit 2 % Phosphotungstic Acid für 1 min und dann bei Raumtemperatur trocknen lassen.
- Laden Sie die Gitter auf dem Probenhalter des Transmissions-Elektronenmikroskop und einen 80 kV Elektronenstrahl für Bilderfassung ausgesetzt.
6. SjEVs Label mit PKH67 und Zelle-Aufnahme-Test
Noten: Alle weiteren Schritte wurden bei Raumtemperatur (20-25 ° C), durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
- 5 µg SjEVs Lösung in einem konischen Boden aus Polypropylen Röhrchen zu übertragen und die Lautstärke bis 12 mL durch Hinzufügen von RPMI 1640 Medium.
- Zentrifugieren Sie die SjEVs bei 110.000 × g für 90 min bei 4 ° C um SjEVs pellet.
- Aspirieren Sie nach Zentrifugation sorgfältig überstand.
Hinweis: Der PKH67 ethanolische Farbstoff sollte nicht direkt an das Pellet SjEV hinzugefügt werden, heterogene Färbung und reduzierte Zellviabilität sonst würde. - Bereiten Sie eine 2 X EV Suspension Lösung durch Zugabe von 1 mL Verdünnungsmittel C zum Pellet SjEV; um komplette Dispersion zu gewährleisten, mit sanften pipettieren aufzuwirbeln.
- Kurz vor der Färbung im Verdünnungsmittel C, bereiten Sie einen frischen 2 x Farbstofflösung durch 1 mL Verdünnungsmittel C in einem Polypropylen Zentrifugenröhrchen 2 µL der PKH67 ethanolische Farbstofflösung hinzufügen und mischen um gut zu zerstreuen.
- Fügen Sie schnell die 1 mL 2 X EV Suspension (Schritt 6.4) zu 1 mL 2 x Farbstofflösung (Schritt 6.5) und sofort mischen die Probe durch pipettieren.
- Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 4 min.
- Die Färbung durch Zugabe von 4 mL FBS zu stoppen und dann 1 min inkubieren.
- Fügen Sie RPMI1640 Medium, um die Lautstärke zu 12 mL und dann bei 110.000 × g bei 4 ° C für 90 min zentrifugieren.
- Entfernen des Überstands und RPMI1640 Medium, um die PKH67 mit der Bezeichnung SjEV Pellets aufzuwirbeln.
- Zentrifugieren Sie bei 110.000 × g bei 4 ° C für 90 min. einmal waschen und dann hinzufügen PBS um die SjEVs Pellets aufzuwirbeln.
7. SjEVs Zelle Aufnahme Assay
- Samen Säugerzellen wie NCTC Klonen 1469 Zellen oder HEK293T in 6-Well-Platten (2 × 105 Zellen pro Well) und über Nacht Kulturzellen.
- 5 µg PKH67 versehenen SjEVs hinzufügen und dann Kulturzellen bei 37 ° C für 2-4 h.
- Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und waschen Sie die Zellen mit PBS zweimal.
- Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Formaldehyd-Lösung für 15 min und zweimal mit PBS gewaschen.
- Fleck Zellkerne mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
- Beobachten Sie die Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie.
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Representative Results
Um die Ausbeute an isolierten SjEVs mit Hilfe der beschriebenen Protokoll zu quantifizieren, haben wir die Konzentration des Proteins von der isolierten SjEVs von 28 Tagen Erwachsene Schistosomen Zugriff auf BCA Protein Assay verwendet. Wie aus Tabelle 1hervorgeht, reichte die SjEV Proteinkonzentration von 208 µg bis 250 µg pro 100 mL Medium (Tabelle 1). Die Partikelgröße Malvern Nanopartikel Analyse bestimmt darauf hingewiesen, dass die isolierte SjEVs von 100 reichte nm bis 400 nm, mit der höchsten Einwohnerzahl rund 220 nm Größe (Abbildung 1). Weitere Charakterisierung des SjEVs von Transmissions-Elektronenmikroskopie ergeben EVs zu Runde Bläschen von ca. 100-200 nm im Durchmesser (Abbildung 2). Western Blot-Analyse ergab, dass die isolierten SjEVs erkannt wurden mit CD63 Antikörpern ist ein typischer EV-Marker (Abbildung 3). Fluoreszenz-Mikroskopie Beobachtung angezeigt, dass die mit der Bezeichnung der PKH67 SjEVs durch die NCTC Klon 1.469 Zellen verinnerlicht wurden und dass die SjEVs hauptsächlich im Zytoplasma der empfängerzellen (Abbildung 4) verteilt wurden.
| Proben | EVs / 100ml Kulturmedium |
| #1 | 250 µg |
| #2 | 208 µg |
| #3 | 220 µg |
Tabelle 1: SjEVs Protein gewonnen aus Kulturmedium; die Höhe der SjEVs BCA-Test pro 100 mL Kulturmedium, erreichbar mit ~ 500 Wurm Paare, wird angezeigt.
Abbildung 1 : Größenverteilung der isolierten SjEVs von kultivierten Medium. 20 µL der SjEVs Lösung wurde mit 1000 µL PBS verdünnt; dann wurde die Mischung mit einer Hochleistungs-zwei Winkel-Partikel und Molekülgröße Analyzer analysiert. Das gezeigte Ergebnis ist repräsentativ für die Daten von drei unabhängigen Isolationen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Charakterisierung der SjEVs von Transmissions-Elektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Western Blot-Analyse der isolierten SjEVs gegen CD63 Antikörper. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Aufnahme des SjEVs von Säugerzellen. Die PKH beschriftet SjEVs erscheinen in grün, während die Zellkerne blau dargestellt sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Neuere Studien über EFD nachgewiesen, dass Schistosome EVs spielen eine wichtige Rolle in Wirt-Pathogen Interaktionen3,9,12,16. Weitere Adresse unbedingt ihre Regulierungsaufgaben EVs von Schistosomen zu isolieren. Hier beschreiben wir eine alternative Methode zur SjEV Isolierung. Diese Methode führt zu eine breiten Palette Größe von SjEVs, von 100 nm bis 400 nm, bei Erwachsenen S. Japonicum. Der folgenden Zelle Aufnahme Test angegeben, dass EVs isoliert unter dem beschriebenen Protokoll erfolgreich durch den empfängerzellen verinnerlicht wurden und ihre damit verbundenen MiRNAs potentiell regulatorischen Rollen17spielen.
EFD, die durch viele verschiedene Arten von Zellen abgesondert werden können, sind auch in verschiedenen Arten von Körperflüssigkeiten19. Infolgedessen ist es wichtig, um künstlich Einführung exogene EVs während des Prozesses der SjEV Isolation zu vermeiden. Zum Beispiel sollte das Kulturmedium Serum nicht enthalten. Die Wurm-Dichte in der in-vitro- Kultur sollte vernünftig zu minimieren potentielle Stress-Reaktion und senken die Sterblichkeit von Würmern. Darüber hinaus ist zu beachten, dass verschiedene Phasen der Schistosomen oder Würmer von verschiedenen Hosts unterschiedliche EVs darstellen können. Infolgedessen ist es unerlässlich, die Parasiten in in-vitro- Umgebungen zu verwalten, die die Host-Umgebung ähneln, und die Bedingungen, unter denen, die sjev isoliert ausgeführt wird, müssen konsequent sein. Darüber hinaus sind wir nicht in der Lage, die Möglichkeit der Varianz im Zusammenhang mit SjEVs durch Kultur Stress verursacht auszuschließen.
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung des SjEVs von 2 h in-vitro- Kultur, Medien für Erwachsene Schistosomen. Ein Vorteil dieses Protokolls ist, dass kurze Kulturzeit minimiert den Stress, den Parasiten ausgesetzt sind, die unphysiologischen EV-Sekretion führen können. Darüber hinaus fanden wir, dass die SjEVs isoliert, wie in diesem Protokoll beschrieben durch den empfängerzellen, was darauf hindeutet, dass diese SjEVs möglicherweise biologisch aktiven17verinnerlicht wurden. Insgesamt ermöglicht dieses Protokolls die effiziente Isolierung des SjEVs von Erwachsenen Würmer mit standard Laborgeräten und ermöglicht ihre Charakterisierung mittels western Blot und Zelle-Aufnahme-Test. Die isolierten EVs können verwendet werden, um weitere Wirt-Pathogen Interaktionen zu charakterisieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie war, im Teil oder im ganzen, unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China (31472187 und 31672550) und The Agricultural Science and Technology Innovation Program von der chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
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