Summary
Aquí, presentamos un protocolo para describir el aislamiento de las vesículas extracelulares (EVs) en medio de cultivo en vitro de adultos Schistosoma japonicum.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EVs) son vesículas membranosas por una variedad de células en el microambiente extracelular. EVs representan una población de vesículas heterogéneas, cuyo rango de tamaño entre 40 y 1.000 nm. Evidencia acumulada indica que EVs desempeñan importantes funciones reguladoras en las interacciones patógeno-host. Una profunda comprensión del schistosome EVs debe proporcionar penetraciones en los mecanismos subyacentes a las interacciones host esquistosoma, permitir el desarrollo de nuevas estrategias contra la esquistosomiasis. Aquí, nuestro objetivo es profundizar el estudio funciones de EVs en esquistosomas presentando un protocolo para el aislamiento y la caracterización de los vehículos eléctricos de adultos Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs se aislaron en vitro el medio de cultivo utilizando centrifugación combinada con un kit de aislamiento comercial exosomas. Los aislados de S. japonicum EVs (SjEVs) por lo general poseen un diámetro de 100-400 nm y se caracterizan por microscopía electrónica de transmisión y el borrar occidental. El uso de PKH67 SjEVs de marcado tinte ha demostrado que SjEVs es internalizados por las células del receptoras. En general, el protocolo proporciona un método alternativo para aislar EVs de esquistosomas adultos; el SjEVs aislado puede ser adecuado para el análisis funcional.
Introduction
Las vesículas extracelulares (EVs) son una población de pequeñas vesículas de membrana-limita con varias proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Estudios recientes demostraron que EVs desempeñan un papel crucial en la comunicación de la célula y participan en la regulación de numerosos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo de las células, regulación inmune, angiogénesis y migración de célula2, 3,4,5. La acumulación de pruebas indica que EVs, circulación de exosomas y su carga de miRNA representan potenciales biomarcadores de ciertas enfermedades6.
Varios protozoos como Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziy Leishmania spp., han demostrado ser capaces de secretar EVs; helmintos, además se han encontrado secretar EVs en vida alberga7. EVs parasitarias han demostrado para estar implicado en el mantenimiento de la infección, patogenicidad8y9de la regulación inmune. Recientes estudios en esquistosomas ambos Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 y S. japonicum12 han indicado que los esquistosomas adultos secretan exosomas como vesículas que pueden ser involucrados en las normas funcionales de procesos biológicos específicos.
Hasta la fecha, se han utilizado varios métodos para aislar las vesículas extracelulares, como la ultracentrifugación, ultrafiltración13, el uso de reactivos basados en polímeros, cromatografía por exclusión de tamaño y aislamiento de inmunoafinidad. Estos métodos poseen sus propias ventajas y limitaciones de la14. Generalmente, la ultracentrifugación se considera el método estándar de oro para el aislamiento de la vesícula. Sin embargo, este método adolece de la limitación del potencial de agregación EV14.
De esquistosomas, han divulgado un par de métodos para el aislamiento de EV: Estos incluyen ultracentrifugación11,12,10 y el uso de comerciales EV aislamiento kit16 para varias etapas (huevos16, esquistosómula11, esquistosomas adultos10,12,17). Dado que microvesículas son de una amplia gama de tamaño de varios cientos nanómetros a mil nanómetros, desarrollamos un método alternativo que combina con el uso de la centrífuga de banco, ultrafiltración y un kit de aislamiento comercial de EV para aislar el servicio voluntario europeo de adultos Schistosoma japonicum. El servicio voluntario europeo aislado típicamente poseía un diámetro de 100-400 nm y con éxito fueron internalizado por las células del receptoras.
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Protocol
Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Comité de ética local de Shanghai Instituto de investigación veterinaria, Academia China de ciencias agrícolas (permiso número: SHVRIAU-14-0101).
1. in Vitro cultura de esquistosomas
Nota: Esquistosomas representan un riesgo biológico. Los trabajadores deben usar guantes de látex en todo momento cuando manejo de gusanos, schistosomal suspensiones u otras relacionadas con los materiales biológicos. Conejos de Nueva Zelandia infectaron con ~ 2.000 cercariae vía abdominal la exposición. Se recolectaron esquistosomas en la etapa hígada de conejos infectados con S. japonicum cercariae en 28 días post-infección por la perfusión del hígado y las venas mesentéricas. Los procedimientos de colección de gusano han sido referenciados en publicaciones anteriores, informes de estudios realizados en ratones18.
- Recoger parásitos en un vaso de precipitados de 500 mL. Lávelos cuidadosamente y suavemente 3 x con 200 mL de precalentado (37 ° C) PBS (pH 7.4).
- Separar ~ 200 pares de gusano para cada plato de Petri de 90 mm. Luego lave bien los parásitos y suavemente 2 x con 50 mL de precalentado (37 ° C) medio de cultivo RPMI-1640 que contiene 100 U de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina.
- Mantener parásitos en 40 mL de medio de cultivo RPMI-1640 precalentado sin antibióticos a 37 ° C debajo del 5% de CO2 a una densidad de gusano ~ 5 pares/ml para 2 h en 90 mm Petri dish.
Notas: El Medio RPMI 1640 no debe contener suero, de lo contrario se introducirán exógeno vesículas extracelulares.
2. tratamiento previo de la condición Media
- Recoge el medio de cultivo y luego centrifugar el medio a 4 ° C a 2.000 x g por 30 min eliminar huevos y desechos tegmental del gusano.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y luego filtrar la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm.
- Recoger la solución filtrada en un bolso del dializado (corte de peso molecular: 3.5kD) y luego dializarse la solución utilizando 8% PEG8000 solución a 4 ° C durante la noche.
Notas: Este paso es importante para enriquecer el SjEVs para aumentar el rendimiento de aislamiento de SjEVs.
3. aislamiento de SjEVs
- Transferir la solución de dializado a un tubo nuevo y añadir 0,5 volúmenes de reactivo de aislamiento total exosomas.
- Mezcle la solución bien por Vortex o pipeteando arriba y abajo para asegurar la homogeneidad de la solución.
- Incubar la mezcla a 2 ° C a 8 ° C durante la noche.
- Centrifugar la mezcla a 15.000 × g durante 1 h a 2 ° C a 8 ° C.
- Aspirar y descartar el sobrenadante.
Notas: EVs están contenido en el sedimento en el fondo del tubo (no visible en la mayoría de los casos). - Resuspender el precipitado de EVs en 2 mL de PBS y luego almacenar la solución de EVs a-80 ° C hasta su posterior análisis.
4. Caracterización de los vehículos eléctricos por Western Blot
- Determinar la concentración de proteína de la muestra SjEVs, por ejemplo, por análisis de la BCA.
- Preparar 10-20 μg de EVs en 22,5 μl de tampón de RIPA. Luego agregar 7.5 μl de 4 x cargando buffer y calor durante 5 minutos a 95 ° C.
- Proteínas de SjEVs separadas por gel de SDS-PAGE de 12%.
- Transferencia de las proteínas a membranas PVDF y luego probe con anticuerpos anti-CD63 (1:1, 000 dilución), seguidos por sondeo con anti-conejo IgG-HRP (1:5, 000 dilución).
- Utilizar el reactivo de detección ECL para el desarrollo de la membrana y detectar las señales de una sistema de imagen de la quimioluminescencia.
5. Caracterización de los vehículos eléctricos por microscopía electrónica de transmisión
- Añadir 2 μl de SjEVs aisladas a rejillas de formvar recubierto de malla 200 y luego deje que se seque a temperatura ambiente.
- Mancha con el 2% de ácido fosfotúngstico durante 1 minuto y luego deje que se seque a temperatura ambiente.
- Carga de las rejillas sobre el portamuestras de microscopio electrónico de transmisión y expuesto a un haz de electrones kV 80 para la captura de la imagen.
6. etiqueta SjEVs con PKH67 y análisis de absorción de la célula
Notas: Todos los pasos posteriores se realizaron a temperatura ambiente (20-25 ° C), a menos que se indique lo contrario.
- Transferencia 5 μg solución SjEVs en un tubo de polipropileno de fondo cónico y ajustar el volumen de 12 mL mediante la adición de Medio RPMI 1640.
- Centrifugue el SjEVs en 110.000 × g durante 90 minutos a 4 ° C para SjEVs de pellets.
- Después de la centrifugación, cuidadosamente aspirar el sobrenadante.
Nota: El tinte de etanol de PKH67 no se debe agregar directamente a la SjEV de la pelotilla, como esto daría lugar a la coloración heterogénea y viabilidad celular reducida. - Preparar una solución de suspensión EV 2 x añadiendo 1 mL de diluyente C a la pelotilla SjEV; para asegurar la completa dispersión, resuspender con pipeteo suave.
- Justo antes de la tinción en diluyente C, preparar un fresco 2 x solución colorante agregando 2 μl de la solución de tinte etanólico de PKH67 a 1 mL de diluyente C en un tubo de centrífuga de polipropileno y mezcla bien para dispersar.
- Rápidamente añadir 1 mL de 2 x EV suspensión (paso 6.4) a 1 mL de 2 x solución de colorante (paso 6.5) e inmediatamente mezcle la muestra mediante pipeteo.
- Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 4 minutos.
- Detener la coloración añadiendo 4 mL de SBF y luego incubar durante 1 minuto.
- Añadir medio RPMI1640 para ajustar el volumen de 12 mL y centrifugar luego a 110.000 × g a 4 ° C durante 90 minutos.
- Quite el sobrenadante y añadir medio RPMI1640 para Resuspender el PKH67 etiquetada SjEV pellets.
- Centrifugue a 110.000 × g a 4 ° C durante 90 minutos a lavar una vez y luego añadir PBS para volver a suspender los pellets de SjEVs.
7. ensayo de absorción de célula de SjEVs
- Las células mamíferas de la semilla como NCTC clonación células de 1469 o células HEK293T en placas de 6 pocillos (2 × 105 células por pocillo) y las células de la cultura durante la noche.
- Añadir 5 μg SjEVs etiqueta de PKH67 y las células a 37 ° C para 2-4 h después de la cultura.
- Después de la incubación, retirar el medio y lavar las células con PBS dos veces.
- Fijar las células con solución de formaldehído 4% durante 15 minutos y lavar dos veces con PBS.
- Se tiñen los núcleos de célula con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Observar las células utilizando microscopía de fluorescencia.
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Representative Results
Para cuantificar el rendimiento de SjEVs aislados usando el protocolo descrito, se utilizan análisis de proteína BCA para acceder a la concentración de proteína de la SjEVs aislada de esquistosomas adultos de 28 días. Como se muestra en la tabla 1, la concentración de proteína de SjEV sido 208 μg 250 μg por 100 mL de medio (tabla 1). El tamaño de partícula, según lo determinado por análisis de nanopartículas de Malvern, indica que el aislado SjEVs varió de 100 nm a 400 nm, con la mayor población de alrededor de 220 nm de tamaño (figura 1). La caracterización adicional de la SjEVs por microscopía electrónica de transmisión reveló EVs ser vesículas redondas de aproximadamente 100-200 nm de diámetro (figura 2). Western Blot análisis indica que el aislado SjEVs fueron reconocidos mediante anticuerpos de CD63, que es un típico indicador de EV (figura 3). Observación de la microscopia de fluorescencia indica que el SjEVs de PKH67-etiquetados fueron internalizados por las 1.469 células NCTC clone y que los SjEVs fueron distribuidos principalmente en el citoplasma de las células receptoras (figura 4).
| Muestras | EVs / 100ml medio de cultivo |
| #1 | 250 μg |
| #2 | 208 μg |
| #3 | 220 μg |
Tabla 1: SjEVs proteína obtenidos de medio de cultivo, la cantidad de SjEVs haciendo ensayo BCA por 100 mL de medio de cultivo, que contiene 500 ~ gusano pares, es demostrada.
Figura 1 : Tamaño de distribución de SjEVs aislados de medio cultivada. 20 μl de solución de SjEVs se diluyó con 1000 μl PBS; Luego, la mezcla se analizó mediante un alto rendimiento ángulo dos partículas y analizador de tamaño molecular. El resultado que se muestra es representativa de los datos de tres aislamientos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Caracterización de SjEVs por microscopía electrónica de transmisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de la SjEVs aislada contra anticuerpos de CD63 el borrar occidental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Captación de SjEVs por las células mamíferas. PKH con la etiqueta SjEVs se muestran en verde, mientras que los núcleos celulares aparecen en azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Estudios recientes sobre EVs han demostrado eso schistosome que EVS juegan un papel importante en huésped-patógeno interacciones3,9,12,16. Atender más sus funciones reguladoras es esencial aislar EVs de esquistosomas. Aquí, describimos un método alternativo para el aislamiento de SjEV. Este método produce un tamaño de amplia gama de SjEVs, de 100 nm a 400 nm, en adultos S. japonicum. El siguiente ensayo de absorción de células indica que EVs aislados bajo el protocolo descrito con éxito fueron internalizados por las células del receptoras y que los miRNAs asociados potencialmente desempeñar roles regulatorios17.
EVs, que pueden ser secretadas por muchos tipos diferentes de células, también están presentes en diversos tipos de fluidos corporales19. Por lo tanto, es importante evitar introducir artificialmente EVs exógenos durante el proceso de aislamiento SjEV. Por ejemplo, el medio de cultivo no debe contener suero. La densidad de gusano en el cultivo en vitro debe ser razonable minimizar la potencial respuesta de estrés y reducir las tasas de mortalidad de gusanos. Además, cabe señalar que diferentes etapas de los esquistosomas o gusanos de hosts diferentes pueden presentar diferentes EVs. En consecuencia, es imperativo mantener los parásitos en los ambientes en vitro que asemejan el entorno de host y las condiciones bajo las que SjEV es realizar aislamiento deben ser coherentes. Además, somos capaces de descartar la posibilidad de variación relacionados con SjEVs causados por la tensión de la cultura.
Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de SjEVs de 2 h en vitro medios de cultivo para esquistosomas adultos. Una ventaja de este protocolo es que tiempo de la cultura corta minimiza el estrés al que están expuestos los parásitos, que puede resultar en la secreción no fisiológica del EV. Además, encontramos que el SjEVs aislados como se describe en este protocolo fueron internalizados por las células receptores, sugiriendo que estas SjEVs pueden ser biológicamente activos17. En general, el presente Protocolo permite el eficiente aislamiento de SjEVs del adulto gusanos usando equipo normal de laboratorio y permite su caracterización mediante western blot y análisis de absorción de la célula. El servicio voluntario europeo aislado puede usarse para caracterizar las interacciones huésped-patógeno.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue, en parte o en conjunto, apoyados por la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31472187 y 31672550) y la ciencia agrícola y tecnología programa de innovación de la Academia China de ciencias agrícolas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
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