Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o isolamento de vesículas extracelulares (EVs) em vitro culta médio de adultos Schistosoma japonicum.
Abstract
Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas membranosas lançadas por uma variedade de células no microambiente extracelular. SVE representa uma população de vesículas heterogêneas, cujo intervalo de tamanho entre 40 e 1.000 nm. Evidências acumuladas indicaram que EVs desempenham importantes funções reguladoras em interações patógeno-hospedeiro. Uma compreensão profunda da esquistossomíase EVs deve fornecer insights sobre os mecanismos subjacentes interações esquistossomíase-host, permitindo o desenvolvimento de novas estratégias contra a esquistossomose. Aqui, pretendemos estudar mais EVs funções em schistosomes apresentando um protocolo para o isolamento e caracterização de EVs de adultos Schistosoma japonicum (S. japonicum). SVE foram isolados em vitro o meio de cultura usando centrifugação combinada com um kit de isolamento exossomo comercial. Os isolados de S. japonicum EVs (SjEVs) normalmente possuem um diâmetro de 100-400 nm e são caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e mancha ocidental. O uso de PKH67 SjEVs de tingir-etiquetados demonstrou que SjEVs são internalizados pelas células destinatários. No geral, o nosso protocolo fornece um método alternativo para isolar EVs de schistosomes adultos; o SjEVs isolado pode ser adequado para análise funcional.
Introduction
Vesículas extracelulares (EVs) são uma população de pequenas vesículas de membrana-limite encapsulado com várias proteínas, lípidos e ácidos nucleicos. Estudos recentes demonstraram que EVs desempenham um papel crucial na comunicação célula-célula e estão envolvidos na regulação de numerosos processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento de célula, regulamento imune, angiogênese e da migração celular2, 3,4,5. Acumular evidências indica que EVs, circulando exosomes e sua carga de miRNA representa potenciais biomarcadores de determinadas doenças6.
Vários protozoários como Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzie Leishmania spp., foram mostrados para ser capaz de secretar EVs; Além disso foram encontrados helmintos de secretar EVs em vivo hospeda7. EVs parasitárias foram mostrados para ser envolvido na manutenção da infecção, patogenicidade8e imune regra9. Recentes estudos em schistosomes ambos Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 e S. japonicum12 têm indicado que adultos schistosomes secretam exossomo como vesículas que podem ser envolvidos na regulamentação funcional de processos biológicos específicos.
Até à data, vários métodos têm sido utilizados para isolar vesículas extracelulares, tais como ultracentrifugação, ultrafiltração13, o uso de reagentes baseado em polímero, cromatografia de exclusão-tamanho e isolamento de immunoaffinity. Esses métodos diferentes possuem suas próprias vantagens e limitações de14. Geralmente, a ultracentrifugação é considerada o método padrão-ouro para isolamento de vesículas. No entanto, este método sofre a limitação do potencial de agregação de EV14.
Em schistosomes, foram relatados alguns métodos para isolamento de EV: Estes incluem ultracentrifugação11,12,10 e o uso de comerciais EV isolamento kit16 para vários estágios (ovos16, schistosomula11, schistosomes adulto10,12,17). Dado que aumentada é de uma vasta gama de tamanho de várias centenas de nanômetros a mil nanômetros, desenvolvemos um método alternativo que combina com o uso de centrífuga de bancada e um kit de isolamento comercial EV para isolar o SVE de ultrafiltração adultos de Schistosoma japonicum. O SVE isolado normalmente possuía um diâmetro de 100-400 nm e com êxito foram internalizado pelas células destinatários.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de ética local do Instituto de investigação veterinária de Shanghai, Academia Chinesa de Ciências agrárias (número de licença: SHVRIAU-14-0101).
1. cultura in Vitro de Schistosomes
Nota: Schistosomes representam um risco biológico. Os trabalhadores devem usar luvas de látex vezes quando manipulação vermes, suspensões esquistossomóticos ou outros relacionados com materiais biológicos. Nova Zelândia coelhos foram infectados com cercárias ~ 2.000 via abdominal exposição. Schistosomes na fase hepática foram coletados de coelhos infectados com cercárias de S. japonicum a pós-infecção 28 dias por perfusão de fígado e veias mesentéricas. Os procedimentos de coleta de verme tem sido referenciados em publicações anteriores, relatórios de estudos em ratos18.
- Recolha os parasitas em um copo de 500 mL. Lave-as e delicadamente 3 x 200 ml de pré-aquecido (37 ° C) PBS (pH 7,4).
- Separe pares de worm ~ 200 para cada prato de Petri de 90 mm. Então lave os parasitas e suavemente 2x com 50 mL de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura RPMI 1640 contendo 100 U de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina.
- Manter parasitas em 40 mL de meio de cultura RPMI-1640 pré-aquecido sem antibióticos a 37 ° C, abaixo dos 5% de CO2 em uma densidade de ~ 5 worm pares /mL para 2 h em 90 mm Petri dish.
Notas: O meio RPMI 1640 não deve conter soro, caso contrário serão introduzida exógena vesículas extracelulares.
2. previamente tratada condição Media
- Recolher o meio de cultura e centrifugar o médio a 4 ° C, a 2.000 × g por 30 min remover os ovos e detritos tegmental de verme.
- Transferir o sobrenadante para um tubo de fresco e em seguida filtrar a solução através de um filtro de seringa 0,22 µm.
- Recolher a solução filtrada em um saco dializado (corte de peso molecular: 3.5kD) e em seguida Dialize a solução usando solução a 8% PEG8000 a 4 ° C durante a noite.
Notas: Este passo é importante para enriquecer SjEVs para aumentar o rendimento de isolamento SjEVs.
3. isolamento de SjEVs
- Transferir a solução dializada para um novo tubo e adicione 0,5 volumes do reagente exossomo total isolamento.
- Misture a solução bem pela utilização do Vortex ou pipetagem para cima e para baixo para garantir a homogeneidade da solução.
- Incube a mistura entre 2 ° C a 8 ° C durante a noite.
- Centrifugue a mistura a 15.000 × g, durante 1 h, 2 ° c e 8 ° c.
- Aspirar e desprezar o sobrenadante.
Notas: SVE constam o sedimento no fundo do tubo (não visível na maioria dos casos). - Resuspenda o pellet EVs em 2 mL de PBS e em seguida armazenar a solução EVs a-80 ° C até uma análise mais aprofundada.
4. caracterização de EVs pela mancha ocidental
- Determine a concentração de proteína da amostra SjEVs, por exemplo, por meio de ensaio BCA.
- Prepare-se 10-20 µ g de EVs no buffer RIPA 22,5 µ l. Em seguida, adicione 7,5 µ l de 4x carregando buffer e calor durante 5 min à 95 ° C.
- Separe as proteínas SjEVs por gel de SDS-PAGE 12%.
- Transferência das proteínas à membrana PVDF e então sonda com anticorpos anti-CD63 (1:1, 000 diluição), seguidos por sondagem com IgG de coelho anti-HRP (1:5, 000 diluição).
- Utilizar o reagente de detecção de ECL para desenvolvimento de membrana e detectar os sinais por uma sistema de imagem de quimioluminescência.
5. caracterização de EVs por microscopia eletrônica de transmissão
- Adicionar 2 µ l de SjEVs isolado para 200 malha revestida formvar grades e depois deixe-o secar à temperatura ambiente.
- Mancha com 2% de ácido fosfotúngstico por 1 min e depois deixe-o secar à temperatura ambiente.
- Carregar as grades para porta-amostras de microscópio de elétron da transmissão e exposto a um feixe de elétrons 80 kV para captura de imagem.
6. SjEVs rótulo com PKH67 e ensaio de absorção de células
Notas: Todas as etapas subsequentes foram realizadas à temperatura ambiente (20-25 ° C), salvo indicação em contrário.
- Transferência de 5 µ g SjEVs solução para um tubo de polipropileno de fundo cónico e ajustar o volume de 12 mL pela adição de meio RPMI 1640.
- Centrifugue a SjEVs a 110.000 × g por 90 min a 4 ° C para SjEVs de Pelotas.
- Após a centrifugação, Aspire cuidadosamente o sobrenadante.
Nota: A tintura de etanol PKH67 não deve ser adicionada diretamente para a pelota de SjEV, pois isso iria resultar em coloração heterogênea e viabilidade celular reduzida. - Preparar uma solução a suspensão EV 2x, adicionando 1 mL de diluente C ao pellet SjEV; para garantir a completa dispersão, resuspenda com suave pipetagem.
- Antes de coloração em diluente C, prepare um fresco 2 x tintura solução adicionando 2 µ l da solução etanólica de tintura de PKH67 para 1 mL de diluente C num tubo de centrífuga de polipropileno e mistura bem para dispersar.
- Adicione rapidamente a 1 mL de 2x suspensão EV (etapa 6.4) a 1 mL de 2 x solução corante (passo 6.5) e imediatamente misture a amostra por pipetagem.
- Incube a mistura à temperatura ambiente durante 4 min.
- Parar a coloração adicionando 4 mL de FBS e então incubar durante 1 min.
- Adicione meio RPMI1640 para ajustar o volume de 12 mL e então centrifugar a 110.000 × g a 4 ° C por 90 min.
- Remover o sobrenadante e adicionar meio RPMI1640 para Ressuspender o PKH67 rotulado SjEV Pelotas.
- Centrifugar a 110.000 × g a 4 ° C por 90 min lavar uma vez e então adicione o PBS para Ressuspender as pelotas de SjEVs.
7. ensaio de absorção de células SjEVs
- Células de mamíferos de semente como NCTC clonagem células 1469 ou HEK293T em placas boas 6 (2 × 105 células por poço) e cultura das células durante a noite.
- Adicionar 5 µ g SjEVs PKH67-rotulados e cultura então células a 37 ° C, durante 2-4 h.
- Após a incubação, remover o meio e lavar as células com PBS duas vezes.
- Consertar as células com solução de formol 4% por 15 min e lavado duas vezes mais com PBS.
- Mancha do núcleo de células com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Observe as células usando microscopia de fluorescência.
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Representative Results
Para quantificar o rendimento de SjEVs isolado usando o protocolo descrito, costumávamos ensaio da proteína BCA para acessar a concentração de proteína da SjEVs isolada de adultos schistosomes 28 dias. Conforme mostrado na tabela 1, a concentração de proteína SjEV variou de 208 µ g a 250 µ g por 100 mL de meio (tabela 1). O tamanho de partícula, conforme determinado pela análise de nanopartículas de Malvern, indicou que o isolado SjEVs variou de 100 nm a 400 nm, com a maior população, cerca de 220 nm em tamanho (Figura 1). Caracterização adicional da SjEVs por microscopia eletrônica de transmissão revelou EVs para ser rodadas vesículas de aproximadamente 100-200 nm de diâmetro (Figura 2). Análise de mancha ocidental indicou que o SjEVs isoladas foram reconhecidos usando anticorpos CD63, que é um marcador de EV típico (Figura 3). Observação de microscopia de fluorescência, indicado que o SjEVs PKH67-etiquetadas foram internalizados pelas 1.469 células NCTC clone e que os SjEVs foram distribuídos principalmente no citoplasma de células destinatários (Figura 4).
| Amostras | SVE / 100ml de meio de cultura |
| #1 | 250 µ g |
| #2 | 208 µ g |
| #3 | 220 µ g |
Tabela 1: SjEVs proteínas obtidas do meio de cultura; a quantidade de SjEVs acessado pelo ensaio BCA por 100 mL de meio de cultura, contendo ~ 500 pares de verme, é mostrada.
Figura 1 : Distribuição de SjEVs isolado do meio de cultura de tamanho. 20 µ l de solução de SjEVs foi diluído com 1000 µ l PBS; em seguida, a mistura foi analisada usando uma partícula de dois ângulo de alto desempenho e analisador de tamanho molecular. O resultado exibido é representante dos dados das três isolamentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Caracterização de SjEVs por microscopia eletrônica de transmissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Mancha análise do SjEVs isolado contra anticorpos CD63 ocidental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Captação de SjEVs pelas células mamíferas. O PKH rotulado SjEVs são mostrados em verde, enquanto os núcleos celulares são mostrados em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Estudos recentes sobre EVs têm demonstrado que esquistossomíase que EVS desempenham um papel importante nas interações patógeno-hospedeiro3,9,12,de16. Para endereço ainda mais suas funções reguladoras, é essencial para isolar EVs de schistosomes. Aqui, descrevemos um método alternativo para SjEV isolamento. Este método produz um tamanho de ampla gama de SjEVs, de 100 nm a 400 nm, em adultos S. japonicum. O ensaio de absorção de células seguintes indicado que EVs isolados sob o protocolo descrito com êxito foram internalizados pelas células destinatários e que seus associados miRNAs potencialmente desempenhar funções reguladoras17.
SVE, que pode ser secretadas por muitos tipos diferentes de células, também está presentes em vários tipos de fluidos corporais19. Por conseguinte, é importante evitar a introduzir artificialmente EVs exógenas durante o processo de isolamento SjEV. Por exemplo, o meio de cultura não deve conter soro. A densidade de worm na cultura em vitro deve ser razoável para minimizar a potencial reação de estresse e diminuir as taxas de mortalidade de vermes. Além disso, note-se que diferentes estágios de schistosomes ou worms de hosts diferentes podem apresentar diferentes EVs. Consequentemente, é imperativo manter os parasitas em ambientes em vitro que se assemelham o ambiente de host, e as condições sob as qual SjEV isolamento é realizado devem ser consistentes. Além disso, somos capazes de excluir a possibilidade de variação relacionada com SjEVs causado por estresse de cultura.
Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação de SjEVs de 2 h em vitro meios de cultura para adultos schistosomes. Uma vantagem deste protocolo é que tempo de cultura curta minimiza o stress a que estão expostas a parasitas, que pode resultar em não-fisiológico EV de secreção. Além disso, achamos que o SjEVs isolados conforme descrito neste protocolo foram internalizados pelas células destinatários, sugerindo que essas SjEVs podem ser biologicamente ativo17. No geral, o presente protocolo permite o isolamento eficiente de SjEVs do adulto vermes usando equipamentos laboratoriais padrão e permite que sua caracterização usando mancha ocidental e o ensaio de absorção de células. O SVE isolado pode ser usado para caracterizar mais interações patógeno-hospedeiro.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi, em parte ou no todo, suporte Nacional Natural Science Foundation da China (31472187 e 31672550) e a ciência agrícola e programa de inovação de tecnologia da Academia Chinesa de Ciências agrárias.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
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