Summary
توبرينتينج يهدف إلى قياس القدرة في المختبر نسخها الجيش الملكي النيبالي لنموذج المجمعات بدء الترجمة مع ريبوسوم تحت ظروف متنوعة. هذا البروتوكول وصف أسلوب للثدييات الجيش الملكي النيبالي توبرينتينج ويمكن استخدامها لدراسة الترجمة تعتمد على عملية النداءات الموحدة ويحركها إيريس.
Abstract
بدء الترجمة خطوة الحد من معدل تخليق البروتين ويمثل إحدى نقاط رئيسية التي تنظم الخلايا على إنتاج البروتين. التنظيم تخليق البروتين هو مفتاح الاستجابة الخلوية للإجهاد، والتقلبات المركزية للعديد من الدول الأمراض، مثل السرطان. على سبيل المثال، على الرغم من أن الإجهاد الخلوي يؤدي إلى تثبيط الترجمة العالمية المخففة كاب-تعتمد على الشروع، تترجم بعض البروتينات الاستجابة للإجهاد بشكل انتقائي بطريقة مستقلة عن عملية النداءات الموحدة. العناصر التنظيمية سرية الجيش الملكي النيبالي، مثل مواقع دخول الريبوسوم الداخلية الخلوية (إيريسيس)، تسمح لترجمة هذه مرناس محددة. تم تحديد هذه مرناس، وتوصيف آلياتها التنظيمية، مجالاً رئيسيا في البيولوجيا الجزيئية. توبرينتينج أسلوب لدراسة بنية الحمض النووي الريبي ووظيفة فيما يتعلق بالشروع في الترجمة. وهدف توبرينتينج لتقييم القدرة في المختبر نسخها من الحمض النووي الريبي تشكيل مجمعات مستقرة مع ريبوسوم تحت مجموعة متنوعة من الظروف، بهدف تحديد تسلسل أو العناصر الهيكلية التبعي العوامل التي تشترك في الريبوسوم ملزمة – مؤشر قبل بدء الترجمة الفعالة. جنبا إلى جنب مع أساليب أخرى، مثل تحليل الغربية والتنميط polysome، يسمح توبرينتينج لوصف قوي لآليات لتنظيم بدء الترجمة.
Introduction
كما الترجمة يستهلك الطاقة الخلوية أكثر، فمن المنطقي أن الترجمة هي محكم التنظيم1. على العكس من ذلك، من التقلبات للترجمة-والتعديلات اللاحقة في إنتاج البروتين-كثيرا ما يلاحظ في الدول الاستجابة للإجهاد والأمراض، مثل السرطان1،2. وميزة رئيسية لمراقبة متعدية الجنسيات هو السرعة التي يمكن أن يغير خلايا إنتاج البروتين من أجل الاستجابة لمختلف المحفزات3. وهكذا يمثل التنظيم الترجمة إليه هامة التي يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية والموت1،،من23. خطوات الترجمة، هو البدء بدرجة عالية من التنظيم والمعقدة معظم3. بإيجاز، مرناس الأكثر حقيقية النواة تحتوي على cap7ز م 5 ' ضروري دائماً تقريبا لترجمتها. يتطلب الشروع في كاب-تعتمد على بدء التوكسينات العوامل eIF4E، و eIF4A، و eIF4G (كاب-الاعتراف بالمجمع) للتفاعل مع نهاية 5 ' مرناً. 43S بريينيتييشن الريبوسوم المعقدة، التي تتضمن البادئ eIF2 زمنياً الحمض الريبي النووي النقال و eIF3، يتم تجنيده لنهاية 5 ' مرناً عن طريق تفاعل eIF4G مع eIF3. بريينيتييشن معقدة ويعتقد أن تفحص مرناً، بمساعدة eIF4A (الجيش الملكي النيبالي هيليكاز) حتى يقع كودون ابدأ (أغسطس). بدء 48S المعقدة هو شكلت لاحقاً ويتم تسليم الحمض الريبي النووي النقال في الرتبة فموقع الريبوسوم. أخيرا، متحدون مفارز الريبوسوم 40S و 60S تشكل بدء 80S المعقدة، تليها الترجمة الاستطالة1،،من34. وفي المقابل، تجاوز مواقع دخول الريبوسوم الداخلية (إيريسيس) شرط لسقف 5 ' بتجنيد الوحيدات ريبوسومال 40S مباشرة إلى كودون الشروع في3. تخفيف ظروف الإجهاد الفسيولوجية العالمية مرناً الترجمة بسبب تعديلات عوامل الرئيسية العامة بدء حقيقية النواة (ايفس). بيد أن الترجمة غير متعارف عليه الشروع في آليات تسمح بترجمة الانتقائي لبعض مرناس التي غالباً ما ترميز البروتينات الاستجابة للإجهاد وتورط التقلبات لبدء الترجمة غير متعارف عليه في الحالات المرضية مثل السرطان 1 , 2-العناصر التنظيمية "سرية الجيش الملكي النيبالي"، مثل إيريسيس الخلوية، تسمح لترجمة هذه2،مرناس3.
أحد جوانب مثيرة للاهتمام لا سيما مراقبة متعدية فهم آليات متعارف عليه مقابل الترجمة غير المقبول من مرناً معين. توبرينتينج هو أسلوب الذي يسمح آليا إلى الدراسة التفصيلية لبدء الترجمة محددة الكشف في المختبر. والهدف العام من توبرينتينج لتقييم قدرة الحمض النووي الريبي للفائدة على نوكليتي تشكيل بدء الترجمة المعقدة مع الريبوسوم تحت مجموعة متنوعة من الظروف، من أجل تحديد تسلسل، والعناصر الهيكلية، أو الملحقات عوامل مطلوبة من أجل الشروع في ترجمة تتسم بالكفاءة. على سبيل المثال، قد أعاق في غياب سقف 5 ' تجنيد الريبوسوم لكن يحفزه وجود آيريس.
ومبدأ هذه التقنية إلى في المختبر نسخ الحمض النووي الريبي للفائدة، احتضان ذلك حضور مقتطفات الخلوية التي تحتوي على مكونات الترجمة (أو مكونات المنقي) للسماح بالشروع في مجمعات للنموذج، وعكس نسخ الجيش الملكي النيبالي بكتاب معين. سوف يتسبب مستقرة الجيش الملكي النيبالي-الريبوسوم مجمعات النسخ العكسي المماطلة على حافة 3 '6،75،الريبوسوم، ما يسمى' توبرينت '.
في هذا البروتوكول ومفارز ريبوسومال، ايفس، ترنس وايريس ترانس-العوامل بالنيابة (إيتافس) هي أسهم مريح بأرنب خلية شبكية ليستي (ررل). وهناك ميزة أخرى لهذا البروتوكول هو استخدام تمهيدي المسمى فلوريسسينتلي وتصوير المستندة إلى جل الأسفار، بدلاً من كتاب راديولابيليد. وهذا يلغي خطوات إضافية، بما في ذلك راديولابيلينج التمهيدي، فضلا عن تجفيف الجل ويعرضها على شاشة تكثيف. تسجل العصابات الفلورسنت في الوقت الحقيقي، كما يدير هلام، مما يسمح للقرار أكبر. لم يسبق لهم اللعب المانع مرتبطة بالعاشر من البروتين (شياب) المبرمج آيريس رنا كمثال هنا، على الرغم من أن يمكن أيضا أن تحلل مرناس توج بهذا الأسلوب8.
على عكس التحليل الغربي، الذي يقيس الناتج النهائي لعملية الترجمة في الخلية ليساتيس، توبرينتينج نهج في المختبر لقياس الترجمة بدء تشكيل معقدة في الجيش الملكي النيبالي. يسمح هذا النهج التخفيضي لدراسة مفصلة للغاية من ركائز أو العوامل التي تنظم الشروع في ترجمة (على سبيل المثال-، توج أو الأمم المتحدة توج مرناً، إيريس الهيكل، ووجود أو عدم وجود الذيل بولي-أ، وتوفير عوامل محددة من البروتين، إلخ.). ومن ثم، يمكن استخدام توبرينتينج لدراسة أوضاع مختلفة للترجمة8 أو آثار هياكل مرناً، مثل إيريسيس، في البروتين التوليف9،10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: الجيش الملكي النيبالي عرضه للتدهور ب ribonucleases (رنسيس). اتخاذ الاحتياطات القياسية للحفاظ على سلامة الجيش الملكي النيبالي. تغيير القفازات في كثير من الأحيان. استخدام تصفية نصائح ماصة، وخالية من نوكلاس بلاستيكواري والمواد الكيميائية نوكلاس مجاناً في جميع الخطوات للبروتوكول. استخدام نوكلاس خالية أو ثنائي إثيل بيروكاربوناتي (ديبك)-معاملة المياه لجميع الحلول.
1-إعداد الحلول
- إعداد المخزن المؤقت توبرينتينج: 20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.6)، 100 ملم كوك، 2.5 مم Mg(OAc)2، 5% (w/v) السكروز، سبيرمدين ديثيوثريتول (DTT)، و 0.5 مم 2 مم.
- تخزين القيمة وسبيرمدين في مختبرين تستخدم مرة واحدة في-20 درجة مئوية لتجنب دورات تجميد أذاب المتكررة.
ملاحظة: أن DTT وسبيرمدين أن تضاف إلى المخزن المؤقت توبرينتينج فورا قبل الاستخدام. ويمكن تخزين حل تفتقر إلى DTT وسبيرمدين عند-20 درجة مئوية.
- تخزين القيمة وسبيرمدين في مختبرين تستخدم مرة واحدة في-20 درجة مئوية لتجنب دورات تجميد أذاب المتكررة.
- تحضير مختبرين من 85 ملم 5 '-جانيليل إيميدوديفوسفاتي (GMP PNP) و 91 مم الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). تخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
- إعداد 450 مل مزيج هلام اليوريا بولياكريلاميدي-7 م 6%: 67.5 مل من 40% acrylamide:bis-اكريلاميد (19:1)، ز 189 من اليوريا، مل 112.5 من 5 × TBE (حمض تريس/بورات/ثيلينيديامينيتيتراعسيتيك (يدتا))، و 120 مل من الماء. حل اليوريا واسطة الاحترار في حمام مائي 37 درجة مئوية أو على لوحة الساخن مع التحريك. تصفية الحل (مثلاً.، 0.2 ميكرومتر النيتروسليلوز فراغ تصفية).
ملاحظة: يمكن تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
تنبيه: هو الاكريلاميد أحادي عصبي التي يمكن استيعابها من خلال الجلد. الحرص على تجنب تماس الجلد (أي. وارتداء القفازات، ومعطف مختبر، وحماية العين). Polyacrylamide يجب أيضا التعامل مع الرعاية، كما البلمرة قد لا المضي قدما لإنجاز 100 ٪. - إعداد ميثلامين تحميل صبغ: 95% ميثلامين، يدتا 18 ملم، 0.025% (w/v) دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، والأزرق bromophenol 0.025% (w/v)، زايلين زيلين نفط 0.025% (w/v). مخزن في-20 درجة مئوية.
- حل نمول 1 من التمهيدي (5 'كتكجاتاتجتجكاتكتجتا؛ 5' نهاية المسمى مع 800 إيرديي) إلى 100 ميكروليتر من المياه من أجل تركيز عمل من 10 pmol/ميكروليتر. تخزين في-20 درجة مئوية في مختبرين تستخدم مرة واحدة (حوالي 10 ميليلتر)، محمية من الضوء.
2-إعداد مرناً
- تضخيم الحمض النووي قوالب لتوليف مرناً بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من القوالب المناسبة (أي.، الحمض النووي أو الحمض النووي بلازميد، حسب الاقتضاء). استخدام عالية دقة بوليميريز الحمض النووي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، مع رد فعل الشروط التالية (دورات 35): تذوب، 98 درجة مئوية، 10 ق؛ يصلب، 53 درجة مئوية، 20 ثانية؛ تمديد، 72 درجة مئوية، 30 ثانية.
ملاحظة: التمهيدي إلى الأمام (5 ' آجكتاتاكجاكتكاكتاتاج) يتضمن التسلسل T7 المروج للسماح للجيش الملكي النيبالي النسخ؛ عكس التمهيدي (5 ' تي51جاتكجاتككجاككجتج) يتضمن 51 المخلفات ثيمين لتوفير ذيل بولي-أ للجيش الملكي النيبالي يدون. لاحظ أيضا أن الجيش الملكي النيبالي في المختبر نسخها من بلازميد الحمض النووي. - استخدام مجموعة مناسبة من نسخ إلى في المختبر نسخ الحمض النووي الريبي المحتوية على آيريس أو توج الجيش الملكي النيبالي من قالب الحمض النووي. اتبع إرشادات الشركة المصنعة. إعداد عينة الحمض النووي الريبي في معيار 20 ميكروليتر رد فعل وحدات التخزين. تعامل الجيش الملكي النيبالي حديثا توليفها مع وحدات 2 من الدناز رناسي مجاناً لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تخفف من الجيش الملكي النيبالي تعامل الدناز إلى 110 ميليلتر مع المياه خالية من نوكلاس إضافة 110 الفينول حمض ميليلتر ودوامه 5 s والطرد المركزي لمدة 3 دقائق في ز 20,000 x في درجة حرارة الغرفة. إزالة 100 ميليلتر المرحلة المائية إلى أنبوب [ميكروفوج] 1.5 مل جديدة وإضافة 10 ميليلتر من خلات الصوديوم 3 أمتار، ودوامه 2 س. إضافة، 3 مجلدات من 100% إيثانول، دوامة 5 ق، ويعجل بالجيش الملكي النيبالي في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- الطرد المركزي في > 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية. أغسل بيليه مع 500 ميليلتر من المثلج 70% (v/v) الإيثانول وكرر الطرد المركزي. نضح كجزء كبير من المادة طافية قدر الإمكان وأيردري بيليه 5-10 دقيقة أن يكون حريصا على عدم إزاحة بيليه.
- ريسوسبيند الجيش الملكي النيبالي في مناسبة حجم المياه خالية من نوكلاس تسفر عن تركيز عامل 0.5 ميكروغرام/ميكروليتر. وهذا يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.
3-توبرينتينج رد فعل
- ميكس 15 ميكروليتر من "الأرانب خلية شبكية ليستي" (ررل، لا يعامل نوكلاس)، 1 ميكروليتر (40 وحدة) "المانع رناسي"، 1 ميليلتر من 91 مم ATP (النهائي 1.82 مم) وميكروليتر 1 من 85 ملم GMP PNP (النهائي 1.7 مم) في أنبوب [ميكروفوج] 1.5 مل. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: ينبغي أن يكون ررل الكوتيد للاستخدام مرة واحدة لتجنب ذوبان التجميد المتكررة. عنصر تحكم حرجة رد فعل تفتقر ررل، بغية توضيح مؤقتاً الطبيعية من النسخ العكسي نظراً للهيكل الثانوي من الجيش الملكي النيبالي. إضافة المخزن المؤقت توبرينتينج لتحل محل ررل لعنصر التحكم هذا. - إضافة 0.5 ميكروغرام (1 ميليلتر) من الجيش الملكي النيبالي، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة 22 ميليلتر من المخزن المؤقت توبرينتينج واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- إضافة 0.5 ميليلتر (5 بمول) لأول كتاب المسمى إيرديي واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
- إضافة 2 ميليلتر من دنتبس 25 مم (التركيز النهائي: 1 ملم)، 2 ميليلتر من 100 مم Mg(OAc)2، 1 ميليلتر من "إنفلونزا الطيور ميلوبلاستوسيس الفيروس عكس المنتسخة" (امف-RT) وميليلتر 3.5 توبرينتينج المخزن المؤقت. وحدة التخزين النهائي 50 ميكروليتر.
- تبني رد الفعل عند 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- إضافة 200 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس واستخراج فورا مع 250 ميليلتر من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل 25:24:1 (حوالي 8.0 درجة الحموضة). S دوامة 5 وأجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة المرحلة المائية إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب جديدة، وإضافة 3 مجلدات من 100% إيثانول، دوامة 5 ق، ويعجل في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- الطرد المركزي في > 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية. أغسل بيليه الحمض النووي مع 500 ميليلتر من المثلج 70% (v/v) الإيثانول. الطرد المركزي في > 20,000 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. أسبيراتي طافية قدر ممكن والهواء الجاف بيليه عن 5-10 دقيقة يجب الحرص على عدم إزاحة بيليه.
- حل بيليه في ميكروليتر 6 المياه خالية من نوكلاس وإضافة 3 ميكروليتر من ميثلامين تحميل صبغ.
4-تسلسل ردود الفعل
- استخدام قالب الحمض النووي من 2.1 والتمهيدي المسمى إيرديي من الخطوة 3، 4 لتفاعلات التسلسل القياسي، باستخدام ديديوكسينوكليوتيديس (ddNTPs) كسلسلة الوحدات الطرفية. استخدام مجموعة تسلسل الحمض النووي مناسبة واتبع إرشادات الشركة المصنعة.
- 6 مزيج ميكروليتر من كل رد فعل التسلسل مع 3 ميكروليتر من ميثلامين تحميل صبغ.
5-إعداد تسلسل جل والتفريد
ملاحظة: هذا البروتوكول يستخدم تصوير المستندة إلى جل الأسفار و 21 سم × 23 سم × 0.2 مم هلام، ولكن يمكن تكييفها للتعاقب أو هلام-أحجام أخرى إذا لزم الأمر.
- دقة تنظيف الفواصل 0.2 مم وكذلك قصيرة (23 × 25 سم) ولوحات الزجاج (30 × 25 سم) طويلة مع الإيثانول 100%. الهواء الجاف.
- مزيج مزيج 30 مل من جل اليوريا بولياكريلاميدي-7 م 6% مع 200 ميكروليتر من فوق كبريتات الأمونيوم 10% (w/v) (الجزائرية) و 20 ميكروليتر من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد). صب الجل، مع الحرص على تجنب فقاعات، وإدراج مشط جل 'القرش الأسنان'. السماح الهلام بلمرة ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- تجميع جهاز التسلسل، وملء الخزانات مع 1 x TBE.
- تشغيل مسبقاً لمدة 15 دقيقة في 1500 الخامس حتى يتم تحقيق درجة الحرارة المثلى من 55 درجة مئوية.
- تسخين المزيج صبغ العينة/تحميل (من الخطوات 3.9 أو 4.2) إلى 85 درجة مئوية ميكروليتر دقيقة 5 1 تحميل على جل التسلسل.
- تشغيل الهلام الساعة 1500 ت على ح 8. سيتم قراءة الجهاز العصابات في الوقت الحقيقي.
- تفكيك الجهاز، والتصرف بهلام الاكريلاميد وتشغيل المخزن المؤقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التي وصفناها سابقا قدرة "آيريس شياب" لدعم بدء الترجمة المستقلة كاب في المختبر8،10. وكان توبرينتينج هذه التقنية الرئيسية استجواب آليا إلى تفاصيل بدء "آيريس شياب" المعقدة. بنية الحمض النووي ترميز مرناً تتضمن "آيريس شياب" (الشكل 1أ) كان في المختبر نسخها وإخضاعها للتحليل توبرينتينج. يتم تمثيل المتغيرات متحولة من مرناً "آيريس شياب" المستخدمة هنا في الشكل 1ب. النسخ العكسي لمجمع مرناً-الريبوسوم شياب أسفرت عن توبرينتس نموذجي + 17 إلى + 19 nt المصب من أغسطس (الشكل 1ج، لين 1). وهذا يدل على التوظيف الريبوسوم إلى كودون ابدأ وتشكيل الريبوسوم مستقرة-الجيش الملكي النيبالي المجمعات5،،من67. كان ضعف التوظيف الريبوسوم بشدة في غياب ذيل بولي-A (الشكل 1ج، لين 9)، كما ذكر سابقا11. كان أيضا بشدة ضعف تشكيل توبرينت في غياب ررل و GMP PNP (الشكل 1ج، لين 8) والمسخ كودون ابدأ (الشكل 1ج، لين 7)، مما يؤكد أن توبرينت الملاحظة ليس الهيكل الناجم عن إيقاف مؤقت للنسخ العكسي بل، في الواقع، محددة للبدء في تشكيل معقدة. وكان تشكيل توبرينت البصر في 5 'بوليبيريميديني المسالك (PPT) المسخ (الشكل 1ج، لين 2) والمسخ 3' PPT (الشكل 1ج، لين 4)، مما يعطل هيكل آيريس (الشكل 1ب)8 ،،من1012. أعيد تشكيل توبرينت عندما تم نسخها طفرات PPT بحد أقصى 5 ' (الشكل 1ج، والممرات 3 و 5). كما أعيد تشكيل توبرينت PPT مزدوجة المسخ (الشكل 1ج، لين 6)، الذي يعيد هيكل الثانوية (الشكل 1ب)10. معا، هذه البيانات تشير إلى أن هيكل الثانوية "آيريس شياب" أمر حاسم لبدء الترجمة للأمم المتحدة توج الجيش الملكي النيبالي وهيكل آيريس يمكن الاستغناء عنها لبدء الترجمة تعتمد على عملية النداءات الموحدة. ولزيادة توضيح الشرط المحدد لسقف 5 ' في الغياب هيكل آيريس، تعرضت مرناً البشرية β-جلوبين (سداسي البروم ثنائي الفينيل) لتحليل توبرينتينج (الشكل 1د). لوحظ لا توبرينت في حالة عدم وجود حد أقصى 5 '(الشكل 1د، لين 1) ولكن بنجاح وتم تعيين ريبوسوم لتوج"رنا سداسي البروم ثنائي الفينيل" (الرقم 1د، لين 2).
الشكل 1 . ويؤكد تحليل توبرينتينج أهمية هيكل آيريس الثانوية لتشكيل مجمعات بدء الترجمة على لم يسبق لهم اللعب "شياب آيريس الجيش الملكي النيبالي". (أ) الرسم التخطيطي بناء الحمض النووي ترميز "الجيش الملكي النيبالي آيريس شياب" المستخدمة في هذا التحليل. 3 ' نهاية التمهيدي توبرينتينج هو 42 bp المصب من كودون ابدأ. (ب) الهياكل الثانوية آيريس شياب WT (أعلى اليسار)، 5 'PPT المسخ (أعلى اليمين)، 3' PPT المسخ (أدنى اليسار) والمسخ PPT مزدوجة (أسفل اليمين). 'PPT المسخ' يشير إلى طفرة نقطة (UU إلى AA) في قطعة بوليبيريميديني حرجة، مما يعطل هيكل الثانوي10،8،آيريس12. هو محاصر كودون ابدأ؛ يشار إلى الطفرات بالعلامات النجمية (*). (ج) تحليل قدرة المتغيرات "آيريس شياب" على شكل مجمعات الشروع في الترجمة في ررل توبرينتينج تعامل مع الحزب الوطني التقدمي GMP و ATP. استعيض عن أغسطس كودون ابدأ مع الجميح للسيارات في "المسخ كودون ابدأ". جعل الحمض النووي الريبي التي تفتقر إلى ذيل بولي-ألف، ببساطة عكس التمهيدي تستخدم لجعل قالب النسخ في المختبر تفتقر إلى قطعة بولي-T. (د) الشروع في مجمع تشكلت على توج (ولكن ليس الأمم المتحدة توج) 5 ' UTR للإنسان β-جلوبين (سداسي البروم ثنائي الفينيل). في لوحات (ج) (د)، الحارات 4 أقصى اليسار تمثل تسلسل التفاعلات مع النيوكليوتيدات dideoxy المشار إليها أعلاه كل حارة؛ تتم الإشارة إلى التسلسل إلى اليسار من كل فريق. فلوريدا، كامل طول. وكان الكشف جميع الأمم المتحدة توج ما لم يحدد خلاف ذلك. وقد تم تعديل هذا الرقم من المنشورات السابقة8،10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توبرينتينج تقنية قوية لقياس قدرة الحمض النووي الريبي للفائدة لدعم تشكيل مجمعات بدء الترجمة تحت ظروف درجة عالية من التحكم مباشرة. هذا البروتوكول وصف تقنية مبسطة توبرينتينج الكشف الثدييات. أرنب خلية شبكية ليستي (ررل) يستخدم كمصدر مناسب ريبوسوم، ايفس، البادئ الحمض الريبي النووي النقال، وايريس ترانس-تعمل العوامل (إيتافس). المجرب ينص على الحمض النووي الريبي للاختيار، ويمكن أيضا تكملة رد فعل توبرينتينج مع العوامل المساعدة المحددة التي يختارونها. على سبيل المثال، يمكن أن تكون متباينة 48S مقابل 80S الترجمة الشروع في المجمعات استناداً إلى توزيع الكثافات الأسفار من توبرينتس7. بدء المعقدة ولاحظ سيتوقف على نوع النوكليوتيدات جوانين المستخدمة. وفي حالة "آيريس شياب" مناقشتها هنا، تستقر GMP PNP بالإضافة إلى ATP 48S قبل الشروع في المجمعات، وتميزت بتوزيع توبرينت + 17≥ + 18 > + 19. الحزب الوطني التقدمي GMP هي نونهيدروليزابل غتب التناظرية التي تثبط ريبوسومال فرعية للالتحاق بالعمل، وبالتالي عرقلة بدء الترجمة في خطوة 48S13. وفي المقابل، أنشئ، ATP، أو ATP زائد أنشئ تستقر المجمعات الشروع في 80S، وتميزت توبرينت التوزيع + 17 + 19 < + 18 >8.
وسيكون المستخدم النظر في النوع من الحمض النووي الريبي يرغبون في توبرينت. إذا كان الهدف دراسة إليه مستقلة عن عملية النداءات الموحدة، مثل عنصر آيريس، يمكن أن يكون الجيش الملكي النيبالي في المختبر نسخها مع أي مواد متاحة تجارياً. ومع ذلك، أي الحمض النووي الريبي الثدييات يمكن أن تخضع لهذا الأسلوب توبرينتينج، شريطة أن لديه بنية كاب 5 '. توج مرناً يجب أن يكون تم إنشاؤها باستخدام مجموعة مناسبة. على أي حال، بروتوكولات الشركة المصنعة ينبغي أن يكون عن كثب، إعداد الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة يمثل خطوة رئيسية في الإجراء. نقطة هامة أخرى أن استخراج الفينول في الخطوة 3، 7 يجب أن تنفذ في أو فوق الرقم الهيدروجيني محايدة؛ إذا كان يتم استخدام حمض الفينول في هذه المرحلة، سوف تضيع كدنا المركبة حديثا. تجدر الإشارة إلى أن تركيز خلات المغنيسيوم المستخدمة في الخطوة 3، 5 يمكن أن تؤثر في كفاءة النسخ العكسي، وقد يلزم أن يكون الأمثل لكل مرناً.
بعض عناصر التحكم الأساسية ضرورية لضمان خصوصية توبرينت. أولاً، ينبغي أن يراعي لا توبرينت قوية في غياب ررل أو النوكليوتيدات. وهذا ما يضمن أن إيقاف النسخ العكسي الملحوظ يرجع إلى مجمع الريبوسوم-الحمض النووي الريبي بدلاً من بنية الحمض النووي الريبي ثانوية مستقرة أو بعض العيوب مع رد فعل عكسي النسخ نفسها. وثانيا، ينبغي أن لا توبرينت ولاحظ إذا هو تحور كودون ابدأ. وهذا ما يضمن أن الريبوسوم شكلت معقدة على وجه التحديد مع كودون بداية من الجيش الملكي النيبالي وأن المستخدم لديه بشكل صحيح وحدد 3 ' حافة الريبوسوم في المجمع مع كودون ابدأ. وهذا أهمية خاصة بالنسبة للعناصر آيريس، التي يمكن تعيين الريبوسوم إلى كودون بداية بديلة14. وبالمثل، قد ضعف في توبرينت في غياب ذيل بولي-أ، كما كان الحال بالنسبة "آيريس شياب"8. ومع ذلك، تشكل بعض العناصر آيريس توبرينتس في غياب ذيل بولي-أ، مثل "آيريس كربف"10. وأخيراً، بالإضافة إلى توبرينت السليم، قد لاحظ توقف عكس النسخ الأخرى. وهذه يمكن أن يمثل ببساطة مؤقتاً بسبب الهياكل الثانوية مستقرة في الجيش الملكي النيبالي، أو أنها يمكن أن تكون بسبب ظاهرة أطلق عليها اسم "القفز" من الريبوسوم، حيث الريبوسوم شرائح من كودون ابدأ إلى مواقع أخرى في الجيش الملكي النيبالي15. للتفريق بين هذه الاحتمالات، يمكن إجراء رد فعل توبرينتينج حضور cycloheximide8، الذي يشل الريبوسوم في كودون بداية فعالية وينبغي تقليل توبرينتس البديلة بسبب الريبوسوم القفز. جدير بالذكر أن مرناس مختلفة سوف يكون مختلف الهياكل الثانوية، مما يعني أن عدد وكثافة عكس النسخ مؤقتاً (أي.، خلفية العصابات) سوف تختلف أيضا.
حد ممكن من هذا الأسلوب هو أنها تدابير التوظيف الريبوسوم مرناً في المختبر، ولكن تشكيل الشروع في ترجمة معقدة لا يعني بالضرورة أن الترجمة سوف تحدث في فيفو. ولذلك توبرينتينج قوية بشكل خاص عندما يقترن في فيفو تقنيات قياس الترجمة (مثلاً.، polysome التنميط16) ومستويات البروتين الناتجة (مثلاً.، تحليل الغربية).
تقنية أكثر حداثة هو "الريبوسوم التنميط" (تسمى أيضا "footprinting الريبوسوم")، حيث يستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي الفائق لقياس وجود ريبوسوم في مجموع مرناً الخلوية. هذا أسلوب قوي لقياس الريبوسوم التوظيف على نطاق واسع الترنسكربيتوم. الملازمة للتنميط الريبوسوم استخدام الكواشف، مثل سيكلوهيكسيميدي، لتحقيق الاستقرار في ريبوسوم في مرناس. يحتمل أن يمثل هذا عيب، كما يمكن توقفت عددا غير متناسب من ريبوسوم غير تحديداً في 5 ' غير مترجمة المنطقة (UTR)، التي يمكن أن يساء تفسيره الترجمة غير متعارف عليه الشروع في17. في توبرينتينج، سيكلوهيكسيميدي ليست جزءا لا يتجزأ من الإجراءات، يلغي إمكانية من هذا القبيل إيجابيات كاذبة. وعلاوة على ذلك، أي واحد مرناً يمكن دراستها بمزيد من التفصيل من توبرينتينج، كما أنها سهلة لإجراء العديد من تجارب التحكم والتكرار (على سبيل المثال، اختبار تأثير عدة الطفرات، أو عدم وجود ذيل بولي-أ، على تجنيد الريبوسوم). سيكون مضيعة للوقت وباهظة التكاليف الاضطلاع في صفيف مكافئ لتجارب التحكم في سياق الريبوسوم التنميط التجربة. توبرينتينج ومن ثم اتباع نهج متكاملة للتقنيات القائمة على التسلسل الفائق، وهو لا يزال استخداماً لدراسات تهدف إلى توضيح آليات لترجمة اللائحة8،،من910، 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد المؤلفون لا صراع المصالح الكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل علوم الطبيعية والهندسة المجلس من كندا-اكتشاف "منحة بحثية" (رجبين-2017-05463)، و "المؤسسة الكندية" للابتكار-جون ر. إيفانز قادة الصندوق (35017) وبرنامج يبتكر ألبرتا للحرم الجامعي ووزارة ألبرتا التنمية الاقتصادية والتجارة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W.
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
