Summary
Toeprinting целями для измерения способности в vitro транскрипции РНК формы перевода инициации комплексов с рибосомами при различных условиях. Этот протокол описывает метод для млекопитающих РНК toeprinting и могут быть использованы для изучения Кап зависимых и управляемая IRES перевод.
Abstract
Начало перевода является шагом ограничения скорости синтеза белка и представляет собой ключевой точку, в которой клетки регулируют их производства белка. Регуляции синтеза белка является ключом к сотовой стресс реакция, и регуляции является центральным элементом многих государств болезни, как рак. Например хотя сотовой стресс приводит к ингибированию глобальной перевод смягчающих Кап зависимых инициирования, некоторые белки стресс реакция выборочно переводятся в Кап независимым образом. Сдержанный РНК нормативных элементов, таких как сотовой внутренних рибосома запись сайтов (IRESes), позволяют для перевода этих конкретных мРНК. Идентификация такими мРНК и характеристика механизмов их регулирования, были одной из ключевых областей в молекулярной биологии. Toeprinting — это метод для изучения структуры РНК и функции, как она относится к инициации перевода. Цель toeprinting – оценить способность в vitro транскрипции РНК сформировать стабильные комплексы с рибосомами под целый ряд условий, с тем чтобы определить, какие последовательности, структурные элементы или аксессуар факторы участвуют в рибосомы Привязка — предварительно курсор для инициирования эффективного перевода. Наряду с других методов, таких как Западная анализа и Полисома профилирования toeprinting позволяет для надежной характеристика механизмов для регулирования возбуждения перевода.
Introduction
Как перевод потребляет наиболее клеточной энергии, это имеет смысл, что перевод является жестко регулируемых1. И наоборот, регуляции перевода- и последующего изменения объема белка-часто наблюдается в реакции на стресс и болезни государствах, таких как рак1,2. Основным преимуществом трансляционная управления является скорость, с которой клетки могут изменить их вывода белка для того, чтобы реагировать на различные раздражители3. Таким образом, перевод правил представляет собой важный механизм, который может повлиять на выживание клетки и смерти1,2,3. Шагов, перевода начало является наиболее высоко регулируемые и сложных3. Короче говоря наиболее эукариотические мРНК содержат 5' м7G колпачок, который почти всегда необходима для их перевода. Кап зависимых посвящения требует эукариотических инициации факторов eIF4E, eIF4A и eIF4G (Кап признание комплекс) взаимодействовать с 5' конца мРНК. 43S preinitiation рибосомы комплекс, который содержит eIF2-прыгните инициатор тРНК и eIF3, привлекается к 5' концу мРНК через взаимодействие eIF4G с eIF3. Считается, что preinitiation комплекс сканирования мРНК, опираясь на eIF4A (РНК-helicase) до начала кодон (Авг) расположен. 48S инициации комплекс впоследствии формируется и тРНК доставляется в P-сайт рибосомы. Наконец субблоки рибосома 60 и 40 объединились в начала 80-х годов комплекс, следуют перевод удлинение1,3,4. В отличие от внутренних рибосома запись сайтов (IRESes) обойти требование для 5' Кап, привлекая рибосомных субблока 40 лет непосредственно до начала кодон3. Физиологический стресс условиями ослабление глобальной мРНК перевод из-за изменения ключевых общих эукариотических инициации факторов (eIFs). Однако механизмы инициации неканонических перевод позволяют выборочный перевод некоторых мРНК, которые часто кодируют белки стресс реакция, и dysregulation неканонических перевод посвящения замешан в государствах заболевания как рак 1 , 2. сдержанный РНК нормативных элементов, таких как сотовые IRESes, позволяют для перевода таких mRNAs2,3.
Особенно интересным аспектом трансляционная управления — понять механизмы канонической против не канонический перевод заданный мРНК. Toeprinting — это метод, который позволяет детальное изучение механистический начало перевода конкретных РНК в пробирке. Общая цель toeprinting заключается в том, чтобы оценить способность РНК, представляющих интерес для nucleate формирования перевод посвящения, комплекс с рибосома под целый ряд условий, с тем чтобы определить, какие последовательности, структурные элементы или аксессуар факторы, необходимые для начала эффективного перевода. К примеру рибосома набора может быть препятствуют в отсутствие крышкой 5' но стимулируется наличием IRES.
Принцип метода заключается в пробирке транскрибировать РНК интерес, проинкубируйте его присутствии клеточных экстрактов, содержащих перевод компонентов (или очищенный) чтобы транскрибировать инициации комплексы форме и обратить вспять РНК с конкретным грунт. Стабильные комплексы РНК рибосома приведет к обратной транскрипции зависает на краю 3' рибосомы так называемые «toeprint»5,6,7.
В этот протокол, рибосомных субблоков, eIFs, tRNAs и IRES транс-Исполняющий обязанности (ITAFs) удобно факторов, кролик ретикулоцитов lysate (РРЛ). Еще одно преимущество этого протокола является использование дневно меченых грунт и флуоресценции формирователя изображений на основе геля, а не radiolabeled грунтовка. Это устраняет дополнительные шаги, включая radiolabeling грунт, а также сушки геля и подвергая его активизация экран. Люминесцентных полосы регистрируются в режиме реального времени, как работает гель, позволяющий для большей резолюции. Раскрытый Х-хромосомой Ингибитор апоптоза РНК IRES белка (XIAP) используется в качестве примера здесь, хотя ограничен мРНК также могут быть проанализированы по этой технике8.
В отличие от западных анализ, который измеряет конечный результат процесса перевода в lysates клетки, toeprinting является подход в vitro для измерения перевода инициации комплекс формирования на РНК. Этот упрощенный подход позволяет весьма детальное изучение субстратов или факторов, которые регулируют перевод посвящения (например., ограничен или ООН ограничен мРНК, IRES структуру, наличие или отсутствие поли A хвост, предоставление конкретных белковых факторов, и т.д.). Таким образом toeprinting может использоваться для изучения различных видов перевод8 или эффекты мРНК структур, таких как IRESes, синтез белков9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: РНК очень восприимчивы к деградации рибонуклеаз (полиадениновый). Принимайте стандартные меры предосторожности, чтобы сохранить нетронутыми РНК. Часто менять перчатки. Использование фильтрации наконечники, свободной от нуклеиназы пластик и свободной от нуклеиназы химических веществ на всех этапах протокола. Использование свободной от нуклеиназы или диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды для всех решений.
1. Подготовка решений
- Подготовка Toeprinting буфера: 20 мм трис-HCl (рН 7,6), 100 KOAc, 2,5 мм Mg(OAc)2, 5% (w/v) сахарозы, Дитиотреитол (DTT) и 0,5 мм спермидина 2 мм.
- Хранить DTT и спермидина в одноразовых аликвоты при-20 ° C, чтобы избежать повторного замораживания оттаивания циклов.
Примечание: DTT и спермидина следует добавить в буфер toeprinting непосредственно перед использованием. Не хватает DTT и спермидина решение может храниться при температуре-20 ° C.
- Хранить DTT и спермидина в одноразовых аликвоты при-20 ° C, чтобы избежать повторного замораживания оттаивания циклов.
- Подготовьте аликвоты 85 мм 5'-что imidodiphosphate (GMP-PNP) и 91 мм аденозинтрифосфатом (АТФ). Хранить аликвоты при-20 ° C.
- Подготовить 450 мл 6% полиакриламида - 7M мочевины гель смеси: 67.5 мл 40% acrylamide:bis-акриламида (19:1), 189 г мочевины, 112.5 5 x TBE (Tris/Борат/thylenediaminetetraacetic кислоты (ЭДТА)) до 120 мл воды. Растворите мочевину потепления в ванну воды 37 ° C или на горячей плите с перемешиванием. Фильтр решение (например., 0,2 мкм нитроцеллюлоза вакуум-фильтр).
Примечание: Раствор может храниться при температуре 4 ° C для по крайней мере один месяц.
Предупреждение: Мономерных акриламида является нейротоксин, который могут проникать через кожу. Проявлять большую осторожность, чтобы избежать контакта с кожей (т.е., надевайте перчатки, лабораторный халат и защитные очки). Полиакриламида также должны быть обработаны с осторожностью, как полимеризации может не перейти к 100% завершения. - Подготовить формамид загрузки краска: 95% формамида, 18 мм ЭДТА, 0,025% (w/v) лаурилсульфат натрия (SDS), 0,025% (w/v) бромфеноловый синий, cyanol ксилол 0,025% (w/v). Хранить при температуре от-20 ° C.
- Растворите 1 нмоль праймера (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' конца меченых с IRDye 800) в 100 мкл воды для рабочей концентрации 10 пмоль/мкл. Хранить при-20 ° C в одноразовых аликвоты (приблизительно 10 мкл), защищенном от света месте.
2. Подготовка мРНК
- Усилить ДНК шаблоны для синтеза мРНК полимеразной цепной реакции (ПЦР) из соответствующих шаблонов (т.е., геномной ДНК или плазмида ДНК, в соответствующих случаях). Используйте высококачественный ДНК-полимеразы согласно инструкциям производителя, с соблюдением следующих условий реакции (35 циклов): расплава, 98 ° C, 10 s; отжиг, 53 ° C, 20 s; продлить, 72 ° C, 30 s.
Примечание: Форвард грунт (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) включает в себя последовательность промоутер T7 для транскрипции РНК; Обратный грунт (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) включает в себя 51 тимин остатков предоставлять хвост поли A для транскрипции РНК. Обратите внимание, что РНК может быть также в vitro расшифрованный от плазмидной ДНК. - Использование соответствующей транскрипции Кит в vitro транскрибировать IRES-содержащие РНК или ограничен РНК из шаблона ДНК. Следуйте инструкциям производителя. Подготовка образца РНК в стандартных 20 мкл реакции томов. Лечить недавно синтезированных РНК с 2 единицы DNase РНКазы бесплатно 30 минут при 37 ° C.
- Разбавить DNase лечение РНК до 110 мкл с нуклеиназы свободной воды добавить 110 мкл кислоты фенола, вихрь 5 s и центрифуги на 3 мин на 20000 x g при комнатной температуре. Удаление 100 мкл водной фазы к новой пробке отцентрифугировать 1,5 мл, 10 мкл ацетат натрия 3 M и вихрь 2 s. Добавить, 3 тома 100% этанола, вихрь 5 s и осадок РНК при-20 ° C на ночь.
- Центрифуга на > 20000 x г за 30 мин при 4 ° C и удалить супернатант. Помыть лепешка с 500 мкл ледяной 70% (v/v) этанола и повторите центрифугирования. Аспирационная столько супернатанта как возможно и воздушно-сухой Пелле за 5-10 мин будьте осторожны, чтобы не вытеснить гранулы.
- Ресуспензируйте РНК в соответствующий объем свободной от нуклеиназы воды приносить рабочей концентрации 0,5 мкг/мкл. Это могут храниться при температуре-80 ° C или используется немедленно.
3. Toeprinting реакция
- Смесь 15 мкл кролик Lysate ретикулоцитов (РРЛ, не лечить нуклеиназы), 1 мкл (40 единиц) АБС битор РНКазы, 1 мкл 91 мм АТФ (1.82 окончательный мм) и 1 мкл 85 мм, GMP-PNP (окончательный 1.7 мм) в 1,5 мл отцентрифугировать. Инкубируйте на 30 ° C за 5 мин.
Примечание: РРЛ должна быть aliquoted для одноместного размещения избежать повторяющихся замораживания оттаивания. Критический элемент управления является реакцией хватает РРЛ, с целью выяснения природные паузы обратной транскрипции благодаря вторичной структуры РНК. Добавьте toeprinting буфер для замены RRL для данного элемента управления. - Добавить 0,5 мкг (1 мкл) РНК и Инкубируйте на 30 ° C за 5 мин.
- 22 мкл буфера Toeprinting и Инкубируйте на 30 ° C в течение 3 мин.
- Добавить 0,5 мкл (5 пмоль) IRDye меченых грунтовки и инкубировать на льду за 10 мин.
- 2 мкл дНТФ 25 мм (конечная концентрация: 1 мм), 2 мкл 100 мм Mg(OAc)2, 1 мкл из птичьего Myeloblastosis вирус обратной транскриптазы (AMV-RT) и 3,5 мкл буфера Toeprinting. Окончательный объем-50 мкл.
- Инкубируйте реакции при 30 ° C по 45 мин.
- Добавить 200 мкл нуклеиназы свободной воды и немедленно извлечь с 250 мкл 25:24:1 фенола: хлороформ: изоамилового спирта (рН около 8,0). Вихрь 5 s и центрифуги на 20000 x g 3 мин при комнатной температуре. Удалить водяной участок для новой трубки отцентрифугировать 1,5 мл, добавить 3 тома 100% этанола, вихрь 5 s и осадок при-20 ° C на ночь.
- Центрифуга на > 20000 x г за 30 мин при 4 ° C и удалить супернатант. Помойте лепешка ДНК с 500 мкл ледяной 70% (v/v) этанола. Центрифуга на > 20000 x g 15 мин при 4 ° C. Аспирационная столько супернатанта как можно и сухих гранул на 5-10 минут будьте осторожны, чтобы не вытеснить гранулы воздуха.
- Растворяют гранулы в 6 мкл нуклеиназы свободной воды и добавить 3 мкл формамид загрузки красителя.
4. последовательность реакций
- Используйте шаблон ДНК от 2.1 и IRDye меченых грунт из шага 3.4 для стандартной последовательности реакций, используя dideoxynucleotides (ddNTPs) как ограничители цепи. Используйте соответствующий комплект секвенирования ДНК и следуйте инструкциям производителя.
- Mix 6 мкл каждой последовательности реакции с 3 мкл формамид загрузки красителя.
5. Подготовка секвенирования гель и электрофорез
Примечание: Этот протокол использует флуоресценции Тепловизор на основе геля и 21 см x 23 см x 0.2 мм гель, но могут быть адаптированы для других секвенсоров или гель размеров, если требуется.
- Тщательно очистите распорки 0,2 мм, а также короткий (23 × 25 см) и долго (30 × 25 см) стекла с 100% этанола. Сухой воздух.
- Размешивать 30 мл 6% полиакриламида - 7M мочевины геля смешать с 200 мкл 10% (w/v) Аммония пероксодисульфат (APS) и 20 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED). Залейте гель, заботясь, чтобы избежать пузырей и вставьте гель «акула-гребень». Разрешить гель для полимеризации в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Соберите аппарат секвенирования и заполнения резервуаров с 1 x TBE.
- Предварительно баллотироваться 15 мин на 1500 V до достижения оптимальной температуры 55 ° С.
- Тепло образца/Загрузка краситель микс (от шагов 3.9 или 4.2) до 85 ° C за 5 мин нагрузки 1 мкл на гель последовательности.
- Побегите гель на 1500 V за 8 ч. Машина будет читать полосы в режиме реального времени.
- Разберите аппарат и распоряжаться гель акриламида и идущий буфер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ранее мы описали XIAP IRES способность поддерживать инициирование Кап независимые перевод в vitro8,10. Toeprinting был ключевым технику допросить механистический детали XIAP IRES посвящения комплекса. Конструкцию ДНК кодирования мРНК, содержащие XIAP IRES (рис. 1A) был в vitro расшифрованный и подвергнуты анализу toeprinting. Мутант варианты XIAP IRES мРНК, здесь представлены в Рисунок 1B. Обратная транскрипция XIAP мРНК рибосомы комплекса дали типичный toeprints + 17 до + 19 nt по течению августа (рис. 1C, переулок 1). Это свидетельствует о рибосома найма старт кодон и формирования стабильных рибосомы РНК комплексов5,6,7. Рибосома набора был сильно поврежден в отсутствие хвоста поли A (рис. 1C, Лейн 9), как сообщалось ранее11. Toeprint формирования также сильно был поврежден в отсутствие РРЛ и GMP-PNP (рис. 1C, переулок 8) и для начала кодон мутант (рис. 1C, переулок 7), подтверждающий, что наблюдаемые toeprint не структура индуцированной Пауза обратной транскрипции но, на самом деле, специфичные для инициации комплекс формирования. Toeprint формирования была нарушена для 5' polypyrimidine тракта (PPT) мутант (рис. 1C, переулок 2) и 3' PPT мутант (рис. 1C, переулок 4), которые нарушают IRES структуру (рис. 1Б)8 ,10,12. Формирование Toeprint было восстановлено когда PPT мутанты были расшифрованы с крышкой 5' (рис. 1C, майнах 3 и 5). Toeprint формирования была также восстановлена для двойной мутант PPT (рис. 1C, переулок 6), который восстанавливает вторичной структуры (рис. 1Б)10. Вместе эти данные показывают, что вторичная структура XIAP IRES имеет решающее значение для инициирования перевода ООН ограничен РНК и что IRES структура является необязательным для инициации перевода Кап зависимых. Чтобы продемонстрировать конкретные требования для 5' Кап в отсутствие структуры IRES, β-глобина человека (ГБД) мРНК был подвергнут toeprinting анализа (рис. 1D). Не toeprint было отмечено, в отсутствие 5' крышка (рис. 1D, переулок 1), но для максимум ГБД РНК (рис. 1D, переулок 2) успешно привлекались рибосом.
Рисунок 1 . Toeprinting анализ подтверждает важность IRES вторичной структуры для формирования комплексов инициации перевода на раскрытый РНК IRES XIAP. (A) принципиальная схема конструкции ДНК кодирования РНК IRES XIAP, используемый в этом анализе. 3' конца toeprinting грунт составляет 42 bp вниз по течению от начала кодон. (B) вторичные структуры IRES XIAP WT (вверху слева), мутант 5' PPT (справа вверху), мутант 3' PPT (нижний левый) и двойной мутант PPT (внизу справа). «PPT мутант» относится к Точечная мутация (UU для AA) в критических polypyrimidine тракта, которая нарушает вторичную структуру IRES8,10,12. Кодон Пуск упаковке; точечные мутации обозначаются звездочками (*). (C) Toeprinting анализ способности XIAP IRES вариантов перевода формы инициации комплексов в РРЛ относиться с GMP-PNP и СПС. Начало августа кодон был заменен AAC в мутанта начать кодон. Чтобы сделать РНК, не хватает поли A хвост, обратный грунт, используемый для сделать в vitro транскрипция шаблон просто не хватало поли T тракта. (D) начало комплекс был сформирован на максимум (но не ООН ограничен) 5' УТР из β-глобина человека (ГБД). В панели (C) и (D), левый 4 полосы представляют собой последовательности реакций с катализированные нуклеотидов, указанных выше каждой полосы; последовательности указан слева от каждой группы. FL, полнометражный. Все РНК были ООН ограничен, если не указано иное. Эта цифра была изменена от предыдущих публикаций8,10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toeprinting – это мощный метод непосредственно измерить РНК интерес способность поддерживать образование комплексов инициации перевода высоко контролируемых обстоятельствах. Этот протокол описывает упрощенную технику для toeprinting РНК у млекопитающих. Кролик ретикулоцитов lysate (РРЛ) используется как удобный источник рибосомы, eIFs, инициатор тРНК и IRES транс-действующих факторов (ITAFs). Экспериментатор обеспечивает их РНК выбора и может также дополнять toeprinting реакция с конкретными кофакторов по их выбору. К примеру 48с по сравнению с 80-х годов перевод инициации комплексы могут быть продифференцированы основаны на распределении интенсивности флуоресценции toeprints7. Начало комплекс наблюдается будет зависеть от типа нуклеотида гуанина используется. В случае XIAP IRES обсуждали здесь, GMP-PNP плюс СПС стабилизирует 48S до инициации комплексов, характеризуется распределением toeprint + 17≥ + 18 > + 19. GMP-PNP является nonhydrolyzable GTP аналоговый, который подавляет субъединицы рибосомальной присоединения, таким образом блокируя инициации перевода на 48S шаг13. В противоположность этому ГТФ, СПС, или СПС плюс GTP стабилизирует 80-х начало комплексов, характеризуется toeprint распределения + 17 + 19 + < 18 >8.
Пользователю будет необходимо учитывать тип РНК, они хотят toeprint. Если целью является изучение Кап независимый механизм, например IRES элемент, РНК может быть в vitro трансляции с любого коммерчески доступных комплект. Однако любой млекопитающих РНК могут быть подвергнуты этот метод toeprinting, условии, что он имеет структуру крышка 5'. Capped мРНК должны создаваться с использованием соответствующего набора. В любом случае производитель протоколы тесно следует, как подготовка высокого качества РНК является ключевым шагом в процедуре. Другой критической точки, что извлечение фенола в шаге 3.7 должны осуществляться на уровне или выше нейтральный pH; Если кислоты фенол используется на данном этапе, недавно синтезированных cDNA будут потеряны. Стоит отметить, что концентрация магния ацетат, используемые на шаге 3.5 может повлиять на эффективность обратной транскрипции и могут быть оптимизированы для каждого мРНК.
Несколько ключевых элементов управления необходимы для обеспечения специфика toeprint. Во-первых нет надежных toeprint должны соблюдаться в отсутствие РРЛ или нуклеотидов. Это гарантирует, что наблюдается обратная транскрипция паузы обусловлено комплекс рибосомы РНК вместо стабильного вторичной структуры РНК или некоторые дефекта с обратной транскрипции реакции, сам. Во-вторых, не toeprint должно быть отмечено, если начало кодон мутировали. Это гарантирует, что рибосома сформировала комплекс специально с начала кодон РНК, и что пользователь правильно определил 3' край рибосома в комплексе с начала кодон. Это особенно важно для IRES элементов, которые может набрать рибосома кодон альтернативного начала14. Аналогичным образом toeprint может быть снижена в отсутствие поли A хвост, как в случае XIAP IRES8. Однако некоторые элементы IRES образуют toeprints в отсутствие поли A хвост, таких как CrPV IRES10. Наконец Помимо надлежащего toeprint, могут наблюдаться другие обратной транскрипции пауз. Они могут просто представляют собой паузы благодаря стабильной вторичных структур в РНК, или они могут быть связано явление под названием «прыжки» рибосомы, которой рибосома слайды от начала кодон в других местах на РНК15. Различать эти возможности, toeprinting реакция может выполняться при наличии циклогексимида8, который эффективно обездвиживает рибосома в начале кодон и следует уменьшить альтернативные toeprints благодаря рибосома прыжки. В частности, различных мРНК будет иметь различные вторичные структуры, означает, что количество и интенсивность вспять транскрипции пауз (т.е., фон полосы) также будет меняться.
Возможным ограничением этой методики является, что он измеряет рибосома вербовку в мРНК в пробирке, но формирование посвящения сложный перевод не обязательно означает, что перевод будет выполнен в vivo. Таким образом, toeprinting является особенно мощным в сочетании с методами в естественных условиях для измерения перевода (например., Полисома, профилирование16) и результирующие уровни белка (например., Западная анализ).
Более поздние техника является «рибосома профилирования» (также называется «рибосома footprinting»), где высок объём РНК последовательности используется для измерения присутствия на общее сотовой мРНК рибосомы. Это мощный метод для измерения рибосома набора транскриптом масштабе. Присущие рибосома профилирования является использование реагентов, таких как циклогексимида, чтобы стабилизировать на мРНК рибосомы. Это потенциально представляет недостаток, как несоразмерное количество рибосом могут неспецифически тупик в 5' непереведенные регионе (утр), который может быть неправильно истолковано как нестандартные перевод начало17. В toeprinting циклогексимида не является неотъемлемой частью процедуры, отрицая возможность таких ложных срабатываний. Кроме того, любой одной мРНК может быть изучен более подробно toeprinting, как его поверхностным для проведения многих экспериментов управления и итераций (например, тестирование эффект нескольких точечные мутации, или отсутствие поли A хвост, на рибосомы набора). Было бы много времени и непомерно проводить эквивалентный массив управления экспериментов в контексте рибосомы, профилирование эксперимент. Toeprinting таким образом дополнительный подход к методам на основе виртуализации высокой пропускной способности и до сих пор широко используется для исследования в целях выяснения механизмов перевода правил8,9,10, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют без конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась естественных наук и инженерно-исследовательский совет Канады-Discovery Грант (RGPIN-2017-05463), Канадский фонд для инноваций-Джон р. Эванс лидеров фонда (35017), инновационную программу кампуса Альберта и в министерстве Альберты Экономического развития и торговли.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W.
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
