Summary
Toeprinting 목표 체 외에서 의 능력을 측정 하는 다양 한 조건에서 리보솜과 양식 번역 개시 복합물에 RNA를 복사할 수 있습니다. 이 프로토콜 toeprinting 포유류 RNA에 대 한 메서드를 설명 하 고 모자-종속 및 IRES 기반 번역 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
번역 개시 단백질 합성의 속도 제한 단계 이며, 세포 단백질 출력을 조절 하는 핵심을 나타냅니다. 단백질 합성의 세포질 긴장 응답, 열쇠 이며 dysregulation 암 등 많은 질병 상태에 중앙 이다. 예를 들어, 세포 스트레스 글로벌 번역의 억제를 약하게 모자 종속 개시 리드, 비록 특정 스트레스 응답 단백질에 모자 독립적인 방식으로 선택적으로 변환 됩니다. 신중한 RNA 규제 등의 요소, 세포 내부 리보솜 입장 위치 (IRESes),이 특정 한 mRNAs의 번역에 대 한 수 있습니다. 이러한 mRNAs의 식별 및 그들의 규제 메커니즘의 특성 분자 생물학에는 핵심 영역 되었습니다. Toeprinting 번역 개시에 관련 된 RNA 구조와 기능 연구에 대 한 방법입니다. Toeprinting의 목표는 생체 외에서 의 능력을 평가 하는 시퀀스, 구조 요소 또는 액세서리 요인 리보솜에 참여를 결정 하기 위해 다양 한 조건에서 리보솜과 안정 되어 있는 복합물을 형성 하는 RNA 베 껴 바인딩-효율적인 번역 개시에 대 한 사전 커서. 서쪽 분석 및 polysome 프로 파일링와 같은 다른 기술 함께 toeprinting 번역 개시의 규칙에 대 한 메커니즘의 강력한 특성에 대 한 수 있습니다.
Introduction
으로 번역 가장 세포 에너지 소비, 그것은 말 번역은 단단히 규제1. 반대로, 번역의 dysregulation-그리고 단백질 출력에 따른 변경-암1,2등, 스트레스 반응과 질병의 상태에서 자주 관찰 됩니다. 변환 제어의 주요 장점은 속도는 셀 다양 한 자극3에 대응 하기 위해 그들의 단백질 출력 변경할 수입니다. 번역 규정 따라서 세포 생존과 죽음1,2,3에 영향을 미칠 수 있는 중요 한 메커니즘을 나타냅니다. 번역의 단계의 개시는 대부분 높은 규제 하 고 복잡 한3입니다. 짧게, 가장 진 핵 mRNAs 포함 5' m7G 모자는 거의 항상 그들의 번역에 대 한 필수. 모자-종속 개시 진 핵 개시 요인 eIF4E, eIF4A, 및 eIF4G 필요 (모자 인식 복합)는 mRNA의 5' 끝에 상호 작용. 43S preinitiation 리보솜, eIF2 바인딩된 초기자를 포함 하는 mRNA를 통해 eIF3와 eIF4G의 상호 작용의 5' 끝에 tRNA와 eIF3, 모집. 복잡 한 괴롭힘 스캔 mRNA, eIF4A에 의해도 왔 생각 된다 (RNA helicase) 시작 codon (8 월)는 때까지. 복잡 한 48S 개시 이후에 형성 그리고 tRNA는 리보솜의 P 사이트에 전달 됩니다. 마지막으로, 60와 40 리보솜 소 단위 번역 신장1,,34다음 80 개시, 복잡 한 형태로 결합 된다. 반면, 내부 리보솜 입장 위치 (IRESes) 개시 코 돈3에 직접 40 ribosomal 소 단위를 모집 하 여 5' 모자에 대 한 요구 사항을 무시할. 생리 적 스트레스 상태 감소 글로벌 mRNA 번역 키 일반 진 핵 개시 요인 (eIFs)의 수정으로 인. 그러나, 종종 스트레스 대응 단백질을 인코딩하는 특정 mRNAs의 선택적 번역 비 정식 번역 개시 메커니즘을 사용 하 고 비 정식 번역 개시의 dysregulation 암 같은 질병 상태에 연루 1 , 2. 세포 IRESes 등 신중 RNA 규제 요소 같은 mRNAs2,3의 번역에 대 한 허용.
변환 제어의 1 개의 특히 재미 있는 양상은 특정된 mRNA의 비 정식 번역 대 정식의 메커니즘을 이해 하는 것입니다. Toeprinting 특정 RNAs 체 외의 번역 개시의 상세한 기계 연구를 허용 하는 기술입니다. Toeprinting의 전반적인 목표는 시퀀스, 구조 요소 또는 액세서리 결정 하기 위해 다양 한 조건에서 리보솜으로 복잡 한 번역 개시의 형성을 nucleate 관심의 RNA의 능력을 평가 하는 요소는 효율적인 번역 개시에 대 한 필요 합니다. 예를 들어, 리보솜 모집 5' 캡의 부재에 방해 수도 있습니다 하지만 한 IRES의 존재에 의해 자극.
체 외에서 하는 것입니다 기술의 원리 개시 단지 형태로, 그리고 반전 녹음 수 있도록 변환 컴포넌트 (또는 순화 된 구성 요소)을 포함 하는 세포 추출의 존재 그것을 품 어 관심, RNA 녹음 특정 뇌관는 RNA 안정적인 RNA 리보솜 단지 반전 녹음 방송에 리보솜의 소위 'toeprint'5,,67의 3' 가장자리에 발생 합니다.
이 프로토콜, ribosomal 소 단위, eIFs, tRNAs, 및 IRES 트랜스-행동 요인 (ITAFs)는 편리 하 게 토끼 reticulocyte lysate (RRL)에 의해 기여. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 붙일 표시 된 뇌관 및 형광 젤 기반 영상, 보다는 오히려 방사선된 뇌관의 사용 이다. 이 등 radiolabeling 뇌관로 젤을 건조 강화 화면에 노출 하는 추가 단계를 제거 합니다. 형광 밴드는 큰 해상도 대 한 허용 젤 실행으로 실시간으로 기록 됩니다. 비록 출장된 mRNAs 또한이 기술을8에 의해 분석 될 수 있다 apoptosis 단백질 (XIAP) IRES RNA의 세척제 X 연결 억제제 여기, 예를 들어 사용 됩니다.
세포 lysates의 번역 과정의 최종 출력을 측정, 서쪽 분석, 달리 toeprinting은 번역 개시는 RNA에 복잡 한 대형을 측정 하기 위해 생체 외에서 접근 이다. 이 reductionist 접근 기판 또는 번역 개시 통제 요인의 매우 상세한 연구에 대 한 수 있습니다 (예., 출장 또는 취소 출장 mRNA, IRES 구조, 존재 또는 부재 특정 단백질 요인의, 폴 리 A 꼬리의 등)입니다. 따라서, toeprinting 번역8 다른 모드 또는 mRNA, 같은 구조 IRESes, 단백질 합성9,10의 효과 연구에 사용할 수 있습니다.
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Protocol
참고: RNA는 ribonucleases (RNases)에 의해 저하에 매우 취약. RNA를 그대로 유지 하는 표준 예방 조치. 글러브를 자주 변경 합니다. 프로토콜의 모든 단계에서 필터링 된 피 펫 팁, nuclease 무료 plasticware 및 nuclease 없는 화학 물질을 사용 합니다. Nuclease 무료 사용 또는 diethyl pyrocarbonate (DEPC)-모든 솔루션에 대 한 물 처리.
1입니다. 솔루션의 준비
- Toeprinting 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.6), 100 mM KOAc, 2.5 m m Mg(OAc)2, 5% (w/v) 자당, 2 m m dithiothreitol (DTT), 그리고 0.5 m m spermidine.
- DTT와 spermidine 반복된 freeze-thaw 주기를 피하기 위해-20 ° C에서 단일 사용 aliquots에 저장.
참고: DTT와 spermidine는 사용 하기 바로 전에 toeprinting 버퍼에 추가 되어야 합니다. DTT와 spermidine 솔루션-20 ° c.에 저장 될 수 있다
- DTT와 spermidine 반복된 freeze-thaw 주기를 피하기 위해-20 ° C에서 단일 사용 aliquots에 저장.
- 85 m m 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP PNP)와 91 m m 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 aliquots를 준비 합니다. -20 ° c.에 aliquots 저장
- 450 mL 6 %polyacrylamide-7 M 요소 젤 믹스의 준비: 40 %acrylamide:bis 67.5 mL-아크릴 (19:1), 요소, TBE (트리 스/borate/thylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)), x 5의 112.5 mL 및 물 120 mL의 189 g. 37 ° C 물 목욕 또는 감동과 뜨거운 접시에 온난 하 여는 요소를 분해. 필터링 솔루션 (예., 0.2 μ m 니트로 진공 필터).
참고: 솔루션 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 한 달 이상.
주의: 아크릴 단위체는 피부를 통해 흡수 될 수 있는 neurotoxin입니다. 피부 접촉을 피하기 위해 상당한 주의 (즉., 장갑, 실험실 외 투를 착용 하 고 눈 보호). 으로 중 합을 100% 완료 진행 하지 않을 수 있습니다 polyacrylamide 또한 주의 처리 되어야 합니다. - Formamide 로드 염료 준비: 95 %formamide, 18 mM EDTA, 0.025% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 0.025% (w/v) bromophenol 블루, 0.025% (w/v) 자일 렌 cyanol. -20 ° c.에 게
- 10 pmol/μ의 작업 집중에 대 한 물 100 μ로 1 nmol 뇌관 (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' 끝-IRDye 800으로 표시)의 분해. 빛에서 보호 하에 단일 사용 aliquots (약 10 µ L),-20 ° C에서 저장 합니다.
2입니다. mRNA의 준비
- 적절 한 서식 파일에서 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 mRNA의 합성에 대 한 서식 파일 DNA 증폭 (즉., 게놈 DNA 또는 플라스 미드 DNA, 적절 한). 높은 충실도 제조업체의 지침에 따라 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 다음 반응 조건 (35 주기): 녹기, 98 ° C, 10 s; anneal, 53 ° C, 20 s; 확장, 72 ° C, 30 s.
참고: 앞으로 뇌관 (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) 통합 RNA 녹음 방송; 있도록 T7 발기인 순서 반전 뇌관 (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) 51 thymine 잔류물 베낀된 RNA에 대 한 폴 리 A 꼬리를 제공 하기 위해 포함 되어 있습니다. Note RNA에 생체 외에서 플라스 미드 DNA에서에서 복사할 수도 있습니다. - 체 외에 적절 한 전송 키트를 사용 하 여 IRES 포함 된 RNA 또는 DNA 템플렛에서 출장된 RNA를 고쳐 쓰다 제조업체의 지침을 따릅니다. 표준 20 μ 반응 볼륨에서 RNA 샘플을 준비 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 RNase 무료 DNase의 2 대와 새로 합성 RNA를 취급
- 110 DNase 취급 RNA 희석 nuclease 무료 물 µ L 110 µ L 산 페 놀, 소용돌이 5 s와 3 분 동안 원심 분리기 실 온에서 20000 x g에 추가. 새로운 1.5 mL microfuge 관에 수성 단계의 100 µ L를 제거 3m 나트륨 아세테이트, 및 소용돌이 2 미 추가, 100% 에탄올, 소용돌이 5 s의 3 볼륨 10 µ L을 추가 하 고 하룻밤-20 ° C에서 RNA 침전.
- 원심 > 삭제는 상쾌한 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g. 얼음 처럼 차가운 70% (v/v) 에탄올의 500 µ L와 펠 릿을 세척 하 고는 원심 분리를 반복. 많은 가능한 상쾌한으로 발음 하 고 5-10 분에는 펠 릿을 꺼내 려 하지 않도록 주의 대 한 펠 릿을 건조.
- Nuclease 무료 물 0.5 μ g/μ의 작업 농도를 적절 한 볼륨에는 RNA를 resuspend. 이-80 ° C에 저장 하거나 즉시 사용 될 수 있습니다.
3. Toeprinting 반응
- 토끼 1 μ (40 대) RNase 억제제, 1 µ L 91 mM ATP의 (최종 1.82 m m) 및 1.5 mL microfuge 관 85 mM GMP PNP (최종 1.7 m m)의 1 μ의 Reticulocyte Lysate (RRL, nuclease 치료 하지 않을)의 혼합 15 μ. 5 분 30 ° C에서 품 어.
참고:는 RRL 반복적인 동결 해빙을 피하기 위해 단일 사용에 대 한 aliquoted 이어야 한다. 중요 한 제어 RRL, 반전 녹음 방송 RNA의 이차 구조 때문의 자연 일시 중지를 명료 하 게 하기 위해 부족 한 반응입니다. Toeprinting 버퍼 RRL이이 컨트롤에 대 한 대체를 추가 합니다. - RNA의 0.5 µ g (1 µ L)를 추가 하 고 5 분 30 ° C에서 품 어.
- Toeprinting 버퍼의 22 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 30 ° C에서 품 어.
- IRDye 표시 된 뇌관의 0.5 µ L (5 pmol)를 추가 하 고 10 분 동안 얼음에 품 어.
- 2 µ L 25 mM dNTPs의 추가 (최종 농도: 1 m m), 2 µ L 100 mM Mg(OAc)2, 1 µ L의 조류 Myeloblastosis 바이러스 역전사 (AMV-RT)과 Toeprinting 버퍼의 3.5 µ L의. 마지막 볼륨은 50 μ.
- 45 분 30 ° C에서 반응을 품 어.
- Nuclease 무료 물 200 µ L을 추가 하 고 즉시 25:24:1 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (pH 약 8.0)의 250 µ L를 추출. 소용돌이 5 s 하 고 실 온에서 3 분 20000 x g에서 원심 분리기. 새로운 1.5 mL microfuge 관에 수성 단계 제거 100% 에탄올, 소용돌이 5 s의 3 볼륨을 추가 하 고 하룻밤-20 ° C에서 침전.
- 원심 > 삭제는 상쾌한 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g. 얼음 처럼 차가운 70% (v/v) 에탄올의 500 µ L로 DNA 펠 릿을 세척. 원심 > 20000 x g 4 ° c.에서 15 분 Aspirate 가능한 및 5-10 분에 대 한 펠 릿은 펠 릿을 꺼내 려 하지 않도록 주의 해야 건조 공기 만큼 표면에 뜨는.
- Nuclease 무료 물 6 μ에 펠 릿을 녹이 고 염료를 로드 하는 formamide의 3 μ를 추가.
4. 연속 반응
- 2.1에서 DNA 템플렛 및 3.4 단계에서 IRDye 라는 뇌관을 사용 하 여 체인 출현으로 dideoxynucleotides (ddNTPs)를 사용 하 여 표준 연속 반응에 대 한. 적절 한 DNA 시퀀싱 장비를 사용 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.
- Formamide 로드 하는 염료의 3 μ와 각 연속 반응의 믹스 6 μ
5입니다. 시퀀싱 하는 젤 전기 이동 법의 준비
참고:이 프로토콜 사용 하 여 형광 젤 기반 영상 고는 21 cm x 23cm x 0.2 m m 젤 하지만 필요한 경우 다른 시퀀서 또는 젤-크기, 적응 시킬 수 있다.
- 0.2 m m 간격으로 짧은 (23 × 25 cm) 및 긴 100% 에탄올 (30 × 25 cm) 유리 접시를 철저 하 게 청소. 건조 공기.
- 6 %polyacrylamide-7 M 우 레 아 젤의 믹스 30 mL 200 μ 10% (w/v) 암모늄 persulfate (AP)의 혼합 및 tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 μ. 젤, 거품을 피하기 위해 돌을 부 어 하 고 ' 상어 이빨 ' 젤 빗을 삽입 합니다. 실 온에서 1 h에 대 한 유해를 젤을 수 있습니다.
- 시퀀싱 기구를 조립 하 고 1 저수지를 채울 x TBE.
- 사전 실행 15 분 1500 V에서 55 ° C의 최적의 온도 달성 될 때까지.
- 샘플/로드 염료 혼합 (3.9 또는 4.2 단계)에서 85 ° C 5 분 부하 1 μ 시퀀싱 젤에 대 한 열.
- 1500 V 8 h에 젤을 실행 합니다. 기계는 실시간으로 밴드를 읽을 것 이다.
- 분해 장치, 그리고 아크릴 아 미드 젤 실행 버퍼를 처분.
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Representative Results
우리는 이전 모자 독립적인 번역 개시 생체 외에서8,10을 지원 하기 위해 XIAP IRES의 능력을 설명 했습니다. Toeprinting 복잡 한 XIAP IRES 개시의 기계적 세부가 핵심 기술 했다. 인코딩 XIAP IRES (그림 1A)를 포함 하는 mRNA는 DNA 구조에 생체 외에서 복사할 및 toeprinting 분석을 받게 했다. 여기 사용 IRES XIAP mRNA의 돌연변이 변종 그림 1B에 표시 됩니다. 반전 녹음 방송 XIAP mRNA 리보솜 복잡 한의 전형적인 toeprints + 17 + 19 나왔고 nt 하류 (그림 1C, 레인 1) 8 월의. 이것은 리보솜 채용 시작 codon 그리고 안정적인 리보솜-RNA 단지5,,67의 대형의 지표 이다. 리보솜 모집 했다 이전에 보고 된11로 (그림 1C, 9 레인), 폴 리 A 꼬리의 부재에서 강력 하 게 손상 된다. Toeprint 형성 했다 또한 강력 하 게 관찰 된 toeprint는 구조 유도 확인 부재 RRL 및 GMP PNP (그림 1C, 레인 8) 및 (그림 1C, 7 레인), 시작 codon 돌연변이 대 한 장애 반전 녹음 방송의 일시 중지 하지만, 사실입니다, 시작 복잡 한 형성에 특정. Toeprint 형성 했다 IRES 구조 (그림 1B) 중단 5' polypyrimidine로 (PPT) 돌연변이 (그림 1C, 2 차선)과 3' PPT 돌연변이 (그림 1C, 4 레인), 대 한 장애인8 ,10,12. Toeprint 대형 PPT 돌연변이 했다 5' 모자 (그림 1C, 3, 5 차선)와 함께 문자 화 될 때 복구 되었다. Toeprint 형성 또한 PPT 이중 돌연변이 (그림 1C, 6 레인), 이차 구조 (그림 1B)10복원 합니다에 대 한 복원 되었습니다. 함께, 이러한 데이터는 XIAP IRES의 이차 구조는 유엔 출장된 RNA의 번역 개시에 대 한 중요 및 IRES 구조는 모자 종속 번역 개시를 위한 불가결을 나타냅니다. 더 설명 하기 위해 IRES 구조 부재에 5' 모자에 대 한 특정 요구 사항, 인간의 β-globin (HBB) mRNA는 toeprinting 분석 (그림 1의D)를 복종 되었다. 아니 toeprint 5' 모자 (그림 1D, 레인 1)의 부재에서 관찰 되었다 하지만 리보솜 성공적으로 출장된 HBB RNA (그림 12 차선)를 채용 했다.
그림 1 . Toeprinting 분석 IRES 세척제 XIAP IRES RNA에 번역 개시 복합물의 대형을 위한 이차 구조의 중요성을 확인합니다. (A) XIAP IRES RNA이이 분석에 사용 된 인코딩 DNA 구조물의 회로도. 3' toeprinting 뇌관의 끝은 42 시작 codon의 하류 혈압. (B) WT XIAP IRES (위 왼쪽), 5' PPT 돌연변이 (오른쪽 위), 3' PPT 돌연변이 (왼쪽 아래), 그리고 PPT 이중 돌연변이 (오른쪽 아래)의 보조 구조. 'PPT 돌연변이' IRES8,,1012의 이차 구조를 방해 하는 중요 한 polypyrimidine 관에서 점 돌연변이 (AA UU)를 말합니다. 시작 codon 박스형 이다; 점 돌연변이 별표 (*)로 표시 됩니다. (C) GMP PNP와 ATP RRL에서 양식 번역 개시 단지 XIAP IRES 이체의 수의 Toeprinting 분석 처리. 시작 codon 8 월 시작 Codon 돌연변이에서 AAC로 대체 되었습니다. RNA 폴 리 A 꼬리 부족을 하려면 역방향 뇌관 녹음 방송 생체 외에서 템플릿을 만드는 데 사용 되는 단순히 폴 리-T로 부족. (D) 에 (하지만 하지 취소 출장) 출장 5' UTR 인간의 β-globin (HBB)의 개시 복합체 형성 되었다. 패널 (C) (D), 가장 왼쪽 4 차선 각 레인; 위에 표시 된 미치기 뉴클레오티드와 시퀀싱 반응을 나타내는 시퀀스는 각 패널의 왼쪽에 표시 됩니다. 플로리다, 전체 길이입니다. 별도로 지정 하지 않는 한 모든 RNAs 초상 취소 되지 않았습니다. 이 그림은 이전 간행물8,10에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Toeprinting 직접 고도로 제어 된 상황에서 번역 개시 복합물의 대형을 지원 하기 위해의 RNA의 능력을 측정 하는 강력한 기술입니다. Toeprinting에 대 한 단순화 된이 프로토콜 설명 포유류 RNAs. 토끼 reticulocyte lysate (RRL) 리보솜, eIFs, 초기자의 편리한 원본으로 사용 되, tRNA와 IRES 트랜스-행동 요인 (ITAFs). 실험 선택의 그들의 RNA를 제공 하 고 또한 그들의 선택의 특정 공동 인자와 toeprinting 반응을 보충할 수 있다. 예를 들어, 번역 개시 단지 대 80 48S toeprints7의 형광 농도의 분포에 따라 분화 될 수 있습니다. 관찰 개시 복잡 한 사용 하는 구 아닌 뉴클레오티드의 종류에 따라 달라 집니다. 여기 논의 XIAP IRES 경우 GMP PNP 플러스 ATP 안정화 48S 전 개시 복합물, toeprint 메일 + 17≥ + 18 특징 > + 19. GMP PNP nonhydrolyzable GTP ribosomal 소 단위, 따라서 차단 48S 단계13번역 개시를 억제 하는 아날로그 이다. 반면, GTP, ATP, 또는 ATP와 GTP 80 개시 복합물, toeprint 메일 17 < 18 > + 198특징을 안정화.
사용자는 toeprint 하고자 하는 RNA의 유형을 고려해 야 해야 합니다. 목표 IRES 요소, 같은 모자 독립적인 메커니즘을 연구 하는 RNA에 생체 외에서 어떤 상용 키트와 함께 복사할 수 있습니다. 그러나, 어떤 포유류 RNA 5' 모자 구조는 제공이 toeprinting 메서드에 메시지를 받지 수 있습니다. 출장된 mRNA는 적절 한 키트를 사용 하 여 생성 되어야 합니다. 어떤 경우에, 제조 업체의 프로토콜 밀접 하 게 지켜져야 한다, 높은-품질 RNA의 준비 절차의 주요 단계를 나타냅니다. 또 다른 중요 한 요점은 중립 pH; 이상 단계 3.7에서에서 페 놀 추출 밖으로 실행 되어야 한다 이 단계에서 산 페 놀을 사용 하는 경우 새로 합성된 cDNA 손실 될 것입니다. 그것은 3.5 단계에서 사용 되는 마그네슘 아세테이트의 농도 반전 녹음 방송의 효율성에 영향을 미칠 수 및 각 mRNA에 대 한 최적화를 할 수 있습니다 지적 가치가 있다.
몇 가지 주요 컨트롤은 toeprint의 특이성을 보장 하기 위해 필요 하다. 첫째, RRL 또는 뉴클레오티드의 부재에서 더 강력한 toeprint은 관찰 해야. 그러면 관찰된 반전 녹음 방송 일시 중지 리보솜 RNA 복합물 보다는 안정적인 RNA 이차 구조 또는 자체 반전 녹음 방송 반응 몇 가지 결함을 예정 이다. 둘째, 아무 toeprint 해야 시작 codon 돌연변이 관찰. 이렇게 하면 리보솜 RNA의 시작 codon로 복잡 한 형성 시작 codon 3' 복잡 한 리보솜의 가장자리를 동일시 사용자가 올바르게 합니다. 이것은 양자 택일 시작 codon14리보솜을 모집 수 있습니다 IRES 요소에 대 한 특히 중요 하다입니다. 마찬가지로,는 toeprint XIAP IRES8의 경우 처럼 폴 리 A 꼬리의 부재에 손상 될 수도 있습니다. 그러나, 일부 IRES 요소 CrPV IRES10등 폴 리 A 꼬리의 부재에서 toeprints를 형성 한다. 마지막으로, 적절 한 toeprint 이외에 다른 반전 녹음 방송 일시를 관찰할 수 있습니다. 이들은 단순히 RNA에 안정 보조 구조 때문에 일시 중지를 나타낼 수 있습니다 또는 그들이 어떤 점에서 리보솜에서에서 슬라이드 시작 codon 다른 위치에 RNA15에 불리는 "리보솜 점프", 현상 때문일 수 있었다. 이러한 가능성을 구별, toeprinting 반응 존재 cycloheximide8, 효과적으로 시작 codon에서 리보솜을 움직이게 하 고 점프 하는 리보솜으로 대체 toeprints를 감소 해야 수행할 수 있습니다. 특히, 다른 mRNAs는 구조가 다른 보조, 수와의 반전 녹음 방송 일시 중지 의미 (즉., 밴드 배경) 다를 것 이다.
이 기술은의 가능한 한계가 이다 mRNA 시험관, 리보솜 채용을 측정 하지만 복잡 한 번역 개시의 형성 뜻은 아닙니다 번역에 비보를 발생 합니다. 따라서, toeprinting는 특히 강력한 기술로 vivo에서 번역을 측정 하기 위해 결합 될 때 (예.,16프로 파일링 polysome) 및 결과 단백질 수준 (예., 서쪽 분석).
최근 기술 이다 "리보솜 프로 파일링" ("리보솜 프린팅" 라고도 함) 총 세포 mRNA에 리보솜의 존재를 측정 하는 높은 처리량 RNA 시퀀싱 사용 됩니다. 이것은 리보솜 모집 transcriptome 전체 규모를 측정 하는 강력한 기술 이다. 고유한 리보솜 프로 파일링 시 약, cycloheximide, mRNAs에 리보솜 안정화 등의 사용이 이다. 이 잠재적으로 결점을, 리보솜의 불균형 수 비 특히 5' 되지 않은 지역에서 (UTR), 정식이 아닌 번역 개시17로 잘못 해석 될 수 있는 지연 수 있습니다 나타냅니다. 에 toeprinting, cycloheximide 같은 잘못 된 반응의 가능성을 negating 절차의 중요 한 부분이 아니다. 또한, 모든 단일 mRNA 공부 될 수 있다 더 자세히 toeprinting에 의해 그것이 많은 제어 실험 및 반복 실시 손쉬운 (예를 들어, 여러 점 돌연변이의 효과 또는 리보솜 모집에 폴 리 A 꼬리 없는 테스트). 그것은 시간과 해당 배열 제어 실험 실험을 프로 파일링 하는 리보솜의 맥락에서의 수행 비용 금지 것입니다. Toeprinting 따라서 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술, 상호 보완적인 접근 이며 명료 번역 규정8,,910의 메커니즘을 연구를 위해 아직도 일반적으로 사용 되 18.
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Disclosures
저자 관심을가지고 아무 충돌-의-공개.
Acknowledgments
이 작품 혁신 존 R. 에반스 지도자 기금 (35017), 캠퍼스 앨버타 혁신 프로그램 및 앨버타 정부는 자연과학 및 공학 연구 위원회의 캐나다 발견 그랜트 (RGPIN-2017-05463), 캐나다 기초에 의해 투자 되었다 경제 개발 및 무역입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
