Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

स्तनधारी mRNAs पर अनुवाद दीक्षा परिसर गठन का Toeprinting विश्लेषण

Published: May 10, 2018 doi: 10.3791/57519
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Chemistry and Biochemistry, Alberta RNA Research and Training Institute, University of Lethbridge, 2Department of Neuroscience and the Canadian Centre for Behavioral Neuroscience (CCBN), University of Lethbridge, 3Arnie Charbonneau Cancer Institute, University of Calgary

Summary

Toeprinting की क्षमता को मापने के लिए इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए की शर्तों के एक किस्म के तहत ribosomes के साथ अनुवाद दीक्षा परिसरों फार्म करने के लिए करना है । इस प्रोटोकॉल toeprinting स्तनधारी आरएनए के लिए एक विधि का वर्णन है और दोनों टोपी पर निर्भर है और आयरेस-चालित अनुवाद का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

अनुवाद दीक्षा दर-प्रोटीन संश्लेषण की सीमित कदम है और एक महत्वपूर्ण बिंदु है जिस पर कोशिकाओं को अपने प्रोटीन उत्पादन को विनियमित का प्रतिनिधित्व करता है । प्रोटीन संश्लेषण के विनियमन सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया की कुंजी है, और dysregulation कैंसर के रूप में कई रोग राज्यों के लिए केंद्रीय है । उदाहरण के लिए, हालांकि सेलुलर तनाव टोपी पर निर्भर दीक्षा क्षीणन द्वारा वैश्विक अनुवाद के निषेध की ओर जाता है, कुछ तनाव प्रतिक्रिया प्रोटीन चुनिंदा एक टोपी स्वतंत्र तरीके से अनुवाद कर रहे हैं । विचारशील आरएनए विनियामक तत्व, जैसे सेलुलर आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइटें (IRESes), इन विशिष्ट mRNAs के अनुवाद के लिए अनुमति देते हैं । ऐसे mRNAs की पहचान, और उनके विनियामक तंत्र के लक्षण वर्णन, आणविक जीवविज्ञान में एक महत्वपूर्ण क्षेत्र रहा है । Toeprinting आरएनए संरचना और समारोह के अध्ययन के लिए एक विधि के रूप में यह अनुवाद दीक्षा से संबंधित है । toeprinting का लक्ष्य है की क्षमता का आकलन करने के लिए इन विट्रो में ribosomes के साथ स्थिर परिसरों के रूप में शर्तों की एक किस्म है, जो निर्धारित करने के क्रम में, संरचनात्मक तत्वों, या गौण कारकों ribosome में शामिल हैं बाध्यकारी-एक पूर्व कुशल अनुवाद दीक्षा के लिए कर्सर । जैसे पश्चिमी विश्लेषण और polysome रूपरेखा के रूप में अंय तकनीकों, के साथ, toeprinting अनुवाद दीक्षा के विनियमन के लिए तंत्र का एक मजबूत लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है ।

Introduction

अनुवाद के रूप में सबसे सेलुलर ऊर्जा की खपत, यह समझ में आता है कि अनुवाद कसकर1विनियमित है । इसके विपरीत, अनुवाद के dysregulation-और प्रोटीन उत्पादन में फलस्वरूप परिवर्तन-अक्सर तनाव में मनाया जाता है-प्रतिक्रिया और रोग राज्यों, जैसे कि कैंसर1,2। शोधों के नियंत्रण का एक प्रमुख लाभ वह गति है जिसके साथ विभिन्न उत्तेजनाओं का जवाब देने के लिए कोशिकाएं अपने प्रोटीन उत्पादन को बदल सकती हैं3. अनुवाद विनियमन इस प्रकार एक महत्वपूर्ण तंत्र है कि सेल अस्तित्व और मौत1,2,3को प्रभावित कर सकते है का प्रतिनिधित्व करता है । अनुवाद के चरणों का, दीक्षा सबसे उच्च विनियमित और जटिल3है । संक्षेप में, सबसे eukaryotic mRNAs एक 5 ' एम7जी टोपी है कि लगभग हमेशा उनके अनुवाद के लिए आवश्यक है होते हैं । टोपी पर निर्भर दीक्षा eukaryotic दीक्षा कारकों eIF4E, eIF4A, और eIF4G (टोपी मान्यता जटिल) के लिए mRNA के 5 ' अंत के साथ बातचीत करने की आवश्यकता है. 43S दीक्षा ribosome परिसर, जिसमें eIF2-बाउंड सर्जक tRNA और eIF3 हैं, mRNA के साथ eIF4G के एक इंटरैक्शन के माध्यम से eIF3 के 5 ' अंत में भर्ती की जाती है. दीक्षा परिसर में mRNA स्कैन करने के लिए सोचा है, eIF4A द्वारा सहायता प्राप्त (एक आरएनए helicase) जब तक शुरू codon (AUG) स्थित है । बाद में 48S दीक्षा परिसर का गठन किया जाता है और tRNA को ribosome के पी-साईट में दिया जाता है । अंत में, 60 के दशकों और 40 ribosome उपइकाइयों के लिए 80 के दशक दीक्षा परिसर के रूप में एकजुट हैं, अनुवाद बढ़ाव1,3,4के बाद । इसके विपरीत, आंतरिक ribosome प्रवेश साइटों (IRESes) 40 राइबोसोमल उपइकाई की भर्ती द्वारा एक 5 ' टोपी के लिए सीधे दीक्षा codon3के लिए आवश्यकता बाईपास । शारीरिक तनाव की स्थिति के प्रमुख सामांय eukaryotic दीक्षा कारकों (eIFs) के संशोधनों के कारण वैश्विक mRNA अनुवाद क्षीण करना । तथापि, गैर-विहित अनुवाद दीक्षा तंत्र कुछ mRNAs के चुनिंदा अनुवाद के लिए अनुमति देते हैं, जो अक्सर तनाव-प्रतिसाद प्रोटीन को एनकोड करते हैं, और गैर-विहित अनुवाद दीक्षा के dysregulation कैंसर जैसे रोग राज्यों में फंसाया जाता है 1 , 2. विचारशील आरएनए विनियामक तत्व, जैसे सेलुलर IRESes, इस तरह के mRNAs के अनुवाद के लिए अनुमति देते हैं2,3.

अनुवाद नियंत्रण का एक विशेष रूप से दिलचस्प पहलू के लिए विहित बनाम गैर के तंत्र को समझने की है एक दिया mRNA के विहित अनुवाद । Toeprinting एक तकनीक है कि इन विट्रो मेंविशिष्ट RNAs के अनुवाद दीक्षा के विस्तृत यंत्रवत अध्ययन की अनुमति देता है । toeprinting के समग्र लक्ष्य के लिए ब्याज की एक आरएनए की क्षमता का आकलन करने के लिए एक किस्म की शर्तों के तहत ribosome के साथ एक अनुवाद दीक्षा परिसर के गठन nucleate है, क्रम में निर्धारित करने के लिए जो अनुक्रम, संरचनात्मक तत्वों, या गौण कारक कुशल अनुवाद दीक्षा के लिए आवश्यक हैं । उदाहरण के लिए, ribosome भर्ती एक 5 ' टोपी के अभाव में बाधा हो सकती है, लेकिन एक आयरेस की उपस्थिति से प्रेरित ।

तकनीक के सिद्धांत को इन विट्रो में ब्याज की एक आरएनए टाइप करना है, यह सेलुलर निष्कर्षों की उपस्थिति में अनुवाद घटकों (या शुद्ध घटकों) युक्त दीक्षा परिसरों के रूप में अनुमति है, और टाइप रिवर्स एक विशिष्ट प्राइमर के साथ आरएनए । स्थिर आरएनए-ribosome परिसरों रिवर्स प्रतिलेखन के लिए ribosome के ' 3 किनारे पर स्टाल का कारण होगा-तथाकथित ' toeprint '5,6,7।

इस प्रोटोकॉल में, राइबोसोमल उपइकाईयों, eIFs, tRNAs, और आयरेस ट्रांसअभिनय कारकों (ITAFs) सुविधाजनक रूप से खरगोश reticulocyte lysate (RRL) द्वारा योगदान कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ एक फ्लोरोसेंट-लेबल प्राइमर और प्रतिदीप्ति जेल आधारित imager के उपयोग के बजाय एक radiolabeled प्राइमर है । यह radiolabeling प्राइमर सहित अतिरिक्त कदम, समाप्त, साथ ही जेल सुखाने और यह एक तेज स्क्रीन को उजागर । फ्लोरोसेंट बैंड वास्तविक समय में दर्ज कर रहे हैं, जेल के रूप में चलाता है, अधिक से अधिक संकल्प के लिए अनुमति दी । apoptosis प्रोटीन (XIAP) आयरेस आरएनए के अनढकी एक्स-लिंक्ड अवरोधक यहां एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है, हालांकि छाया mRNAs भी इस तकनीक8द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।

पश्चिमी विश्लेषण, जो सेल lysates में अनुवाद की प्रक्रिया के अंतिम उत्पादन उपायों के विपरीत, toeprinting एक इन विट्रो दृष्टिकोण में एक आरएनए पर अनुवाद दीक्षा जटिल गठन को मापने के लिए है । इस गुटबंदी दृष्टिकोण सब्सट्रेट या कारकों है कि अनुवाद दीक्षा को विनियमित के अत्यधिक विस्तृत अध्ययन के लिए अनुमति देता है (उदा, छाया हुआ या संयुक्त राष्ट्र छाया हुआ mRNA, आयरेस संरचना, उपस्थिति या पाली की अनुपस्थिति-एक पूंछ, विशिष्ट प्रोटीन कारकों का प्रावधान, आदि। इसलिए, toeprinting अनुवाद के विभिंन तरीकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है8 या IRESes के रूप में mRNA संरचनाओं के प्रभाव, प्रोटीन संश्लेषण9,10पर ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: आरएनए ribonucleases (RNases) द्वारा क्षरण के लिए अत्यधिक अतिसंवेदनशील है । आरएनए को बरकरार रखने के लिए मानक एहतियात बरतें । दस्ताने अक्सर बदलें । प्रोटोकॉल के सभी चरणों में फ़िल्टर्ड पिपेट टिप्स, nuclease-फ्री plasticware, और nuclease-फ्री केमिकल्स का प्रयोग करें । nuclease-मुक्त या diethyl pyrocarbonate (DEPC) का प्रयोग करें-सभी समाधानों के लिए पानी का इलाज ।

1. समाधान की तैयारी

  1. Toeprinting बफर तैयार: 20 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ७.६), १०० मिमी KOAc, २.५ मिमी मिलीग्राम (OAc)2, 5% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज, 2 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), और ०.५ मिमी spermidine.
    1. स्टोर डीटीटी और spermidine एकल उपयोग aliquots में-20 ° c दोहराया रुक-गल चक्र से बचने के लिए.
      नोट: डीटीटी और spermidine toeprinting बफ़र के लिए तुरंत उपयोग करने से पहले जोड़ा जाना चाहिए । डीटीटी और spermidine कमी समाधान-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. ८५ mm 5 '-guanylyl imidodiphosphate (जीएमपी-PNP) और ९१ mm adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के aliquots तैयार करें । aliquots-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  3. 6% polyacrylamide-7M यूरिया जेल की ४५० मिलीलीटर तैयार करें मिक्स: ६७.५ मिलीलीटर की ४०% acrylamide: बीआईएस-acrylamide (19:1), यूरिया की १८९ ग्राम, 5x TBE की ११२.५ मिलीलीटर (Tris/बोराटे एसिड (thylenediaminetetraacetic)), और पानी की १२० मिलीलीटर । एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान या सरगर्मी के साथ एक गर्म थाली पर वार्मिंग से यूरिया भंग । समाधान (उदा, ०.२ माइक्रोन nitrocellulose वैक्यूम फ़िल्टर) को फ़िल्टर करें ।
    नोट: समाधान 4 डिग्री सेल्सियस से कम एक महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
    सावधानी: Monomeric acrylamide एक neurotoxin है जो त्वचा के माध्यम से अवशोषित किया जा सकता है । बहुत ध्यान रखना त्वचा से संपर्क (यानी, दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, और आंख संरक्षण पहनने से बचने के लिए) । Polyacrylamide भी देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए, के रूप में बहुलकीकरण १००% पूरा करने के लिए आगे नहीं हो सकता है ।
  4. तैयार formamide लोड हो रहा है डाई: ९५% formamide, 18 मिमी EDTA, ०.०२५% (डब्ल्यू/वी) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), ०.०२५% (डब्ल्यू/वी) bromophenol नीला, ०.०२५% (डब्ल्यू/वी) xylene cyanol । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  5. 1 nmol प्राइमर के भंग (5 ' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5 ' अंत-IRDye ८०० के साथ लेबल) के लिए पानी की १०० μL में 10 pmol/μL के एक काम एकाग्रता के लिए । एकल उपयोग aliquots में-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर (लगभग 10 µ एल), प्रकाश से सुरक्षित.

2. mRNA की तैयारी

  1. उचित टेम्पलेट्स (यानी, जीनोमिक डीएनए या प्लाज्मिड डीएनए, के रूप में उपयुक्त) से पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा mRNA के संश्लेषण के लिए डीएनए टेम्पलेट्स को बढ़ाना. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का प्रयोग करें, निम्नलिखित प्रतिक्रिया शर्तों के साथ (३५ चक्र): पिघल, ९८ डिग्री सेल्सियस, 10 एस; ऐनी, ५३ ° c, 20 एस; विस्तार, ७२ ° c, 30 एस.
    नोट: आगे प्राइमर (5 ' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) T7 प्रवर्तक अनुक्रम को शामिल आरएनए प्रतिलेखन के लिए अनुमति देने के लिए; रिवर्स प्राइमर (5 ' T५१GAATTCGGATCCGACCGTGG) शामिल है ५१ thymine अवशेषों एक पाली प्रदान करने के लिए-प्रतिलिखित आरएनए के लिए एक पूंछ । कि आरएनए भी प्लाज्मिड डीएनए से लिखित विट्रो में हो सकता है कि ध्यान दें ।
  2. इन विट्रो में एक उचित प्रतिलेखन किट का प्रयोग करें आयरेस-युक्त आरएनए या डीएनए टेम्पलेट से ढकी आरएनए । निर्माता के निर्देशों का पालन करें । मानक 20 μL प्रतिक्रिया संस्करणों में आरएनए नमूना तैयार करें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए RNase-मुक्त DNase की 2 इकाइयों के साथ नव संश्लेषित आरएनए का इलाज ।
  3. DNase-इलाज आरएनए को पतला nuclease-मुक्त पानी के साथ ११० µ l में जोड़ें ११० µ l एसिड phenol, भंवर 5 एस और कमरे के तापमान पर २०,००० x g पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक । एक नया १.५ एमएल microfuge ट्यूब के लिए जलीय चरण के १०० µ एल निकालें, 3 एम सोडियम एसीटेट के 10 µ एल जोड़ने के लिए, और भंवर 2 एस जोड़ें, १००% इथेनॉल, भंवर 5 एस के 3 संस्करणों, और-20 डिग्री सेल्सियस रात भर में शाही सेना हाला ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए > 20, 000 x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । बर्फ के ५०० µ एल के साथ गोली धो-शीत ७०% (v/वी) इथेनॉल और दोहराने के केंद्रापसारक । संभव है और हवा के रूप में supernatant के रूप में ज्यादा महाप्राण-5-10 मिनट के लिए गोली सूखी । गोली को उखाड़ देना नहीं सावधान रहना ।
  5. ०.५ μg/μL के एक काम एकाग्रता उपज के लिए nuclease मुक्त पानी की उचित मात्रा में आरएनए reसस्पेंड । यह-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है या तुरंत इस्तेमाल किया ।

3. Toeprinting प्रतिक्रिया

  1. इसमें 15 μL के खरगोश Reticulocyte Lysate (RRL, न nuclease-स्वास्थ्यकर्मी), 1 μL (४० यूनिट) के RNase अवरोधक, 1 µ एल के ९१ मिमी एटीपी (१.८२ एमएम फाइनल) और 1 μL के ८५ मिमी जीएमपी-PNP (१.७ एमएम फाइनल) के एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में मिलाएं । 5 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    नोट: RRL एकल उपयोग के लिए aliquoted होना चाहिए दोहराए फ्रीज-गल से बचने के लिए । एक महत्वपूर्ण नियंत्रण RRL कमी प्रतिक्रिया है, आदेश में स्पष्ट शाही सेना की माध्यमिक संरचना के कारण रिवर्स प्रतिलिपि के प्राकृतिक pauses । इस नियंत्रण के लिए RRL को प्रतिस्थापित करने के लिए toeprinting बफ़र जोड़ें ।
  2. आरएनए के ०.५ µ g (1 µ l) जोड़ें और 5 मिनट के लिए 30 ° c पर मशीन ।
  3. Toeprinting बफर के 22 µ एल जोड़ें और 3 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  4. जोड़ें ०.५ µ l (5 pmol) के IRDye-लेबल प्राइमर और 10 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
  5. जोड़ें 2 µ एल के 25 मिमी dNTPs (अंतिम एकाग्रता: 1 मिमी प्रत्येक), 2 µ एल के १०० मिमी मिलीग्राम (OAc)2, 1 µ एल के एवियन Myeloblastosis वायरस रिवर्स Transcriptase (AMV-RT) और ३.५ µ एल के Toeprinting बफर. अंतिम मात्रा ५० μL है ।
  6. ४५ मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया की मशीन ।
  7. nuclease-नि: शुल्क पानी के २०० µ एल जोड़ें और तुरंत 25:24:1 phenol के २५० µ एल के साथ निकालने: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब (लगभग ८.० पीएच) । भंवर 5 एस और २०,००० एक्स जी में कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक । एक नया १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब करने के लिए जलीय चरण निकालें, १००% इथेनॉल, भंवर 5 एस के 3 संस्करणों को जोड़ने, और-20 डिग्री सेल्सियस रात भर में हाला ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए > 20, 000 x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । धो बर्फ के ५०० µ एल के साथ डीएनए गोली-शीत ७०% (v/ 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए > 20, 000 x g पर केंद्रापसारक । महाप्राण के रूप में ज्यादा संभव है और हवा 5-10 मिनट के लिए गोली सूखी के रूप में supernatant गोली को हटाना नहीं सावधान रहना ।
  9. nuclease के 6 μL में गोली भंग-नि: शुल्क पानी और formamide लोडिंग डाई के 3 μL जोड़ें ।

4. अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं

  1. २.१ से डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करें और मानक अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के लिए कदम ३.४ से IRDye-लेबल प्राइमर, श्रृंखला टर्मिनेटर के रूप में dideoxynucleotides (ddNTPs) का उपयोग कर. एक उचित डीएनए अनुक्रमण किट का प्रयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
  2. formamide लोडिंग डाई के 3 μL के साथ प्रत्येक अनुक्रमण प्रतिक्रिया के 6 μL मिश्रण ।

5. sequencing जेल और ट्रो की तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल एक प्रतिदीप्ति जेल आधारित imager और एक 21 सेमी x 23 सेमी x ०.२ mm जेल का उपयोग करता है, लेकिन अन्य sequencers या जेल आकार, यदि आवश्यक हो के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

  1. अच्छी तरह से ०.२ mm स्पेसर्स को साफ करने के साथ ही कम (23 × 25 सेमी) और लंबे समय (30 × 25 सेमी) ग्लास प्लेटें १००% इथेनॉल के साथ । हवा शुष्क ।
  2. 10% (w/v) अमोनियम persulfate (एपीएस) और 20 μL के tetramethylethylenediamine (TEMED) के २०० μL के साथ 6% polyacrylamide-7M यूरिया जेल मिश्रण की 30 मिलीलीटर मिलाएं । जेल डालो, बुलबुले से बचने के लिए देखभाल ले रही है, और ' शार्क टूथ जेल कंघी डालें । कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए polymerize करने के लिए जेल की अनुमति दें ।
  3. अनुक्रमण तंत्र को इकट्ठा करने और 1x TBE के साथ जलाशयों को भरने ।
  4. १५०० वी में 15 मिनट के लिए पूर्व भागो ५५ डिग्री सेल्सियस के इष्टतम तापमान तक प्राप्त की है ।
  5. 5 मिनट के लिए ८५ ° c के लिए नमूना/लोड हो रहा है डाई मिश्रण (कदम से ३.९ या ४.२) गर्मी sequencing जेल पर 1 μL लोड ।
  6. चलाने के लिए १५०० V पर जेल 8 ज । मशीन वास्तविक समय में बैंड पढ़ा होगा ।
  7. तंत्र जुदा है, और acrylamide जेल और चल बफर निपटान ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम पहले XIAP आयरेस की क्षमता इन विट्रो8,10में टोपी-स्वतंत्र अनुवाद दीक्षा का समर्थन करने के लिए बताया है । Toeprinting XIAP आयरेस दीक्षा परिसर के यंत्रवत विवरण से पूछताछ करने की प्रमुख तकनीक थी. एक डीएनए एक XIAP आयरेस युक्त mRNA एंकोडिंग का निर्माण (चित्रा 1) इन विट्रो में था लिखित और toeprinting विश्लेषण के अधीन । XIAP आयरेस mRNA के उत्परिवर्ती वेरिएंट यहां इस्तेमाल किया चित्रा 1बीमें प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । XIAP mRNA के रिवर्स प्रतिलेखन-ribosome परिसर ठेठ toeprints + 17 अगस्त के 19 nt बहाव (चित्रा 1सी, लेन 1) उपज । यह प्रारंभ codon और स्थिर ribosome-आरएनए कॉम्प्लेक्स5,6,7के गठन के लिए ribosome भर्ती का संकेत है. Ribosome भर्ती एक पाली के अभाव में दृढ़ता से बिगड़ा था-एक पूंछ (चित्रा 1सी, लेन 9), के रूप में पहले से11की सूचना दी । Toeprint गठन भी RRL और जीएमपी-PNP के अभाव में मजबूती से बिगड़ा था (चित्रा 1सी, लेन 8) और शुरू codon उत्परिवर्ती के लिए (चित्रा 1सी, लेन 7), पुष्टि है कि मनाया Toeprint एक संरचना प्रेरित नहीं है रिवर्स प्रतिलेखन के ठहराव पर है, वास्तव में, दीक्षा जटिल गठन के लिए विशिष्ट । Toeprint गठन 5 ' polypyrimidine पथ (पीपीटी) उत्परिवर्ती (चित्रा 1सी,के लिए ख़राब हो गया था लेन 2) और 3 ' पीपीटी उत्परिवर्ती (चित्रा 1सी, लेन 4), जो आयरेस संरचना बाधित (चित्रा 1बी)8 ,10,12. PPT म्यूटेंट एक 5 ' कैप (चित्रा 1सी, लेन 3 और 5) के साथ लिखित थे जब Toeprint गठन बहाल किया गया था । Toeprint गठन भी पीपीटी डबल उत्परिवर्ती (चित्रा 1सी, लेन 6) के लिए बहाल किया गया था, जो द्वितीयक संरचना (चित्रा 1बी)10पुनर्स्थापित करता है । साथ में, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि XIAP आयरेस की माध्यमिक संरचना संयुक्त राष्ट्र की छाया आरएनए के अनुवाद दीक्षा के लिए महत्वपूर्ण है और है कि आयरेस संरचना टोपी पर निर्भर अनुवाद दीक्षा के लिए औषधालय है । आगे एक आयरेस संरचना के अभाव में एक 5 ' टोपी के लिए विशिष्ट आवश्यकता को प्रदर्शित करने के लिए, मानव β-ग्लोबिन (HBB) mRNA toeprinting विश्लेषण (चित्रा 1डी) के अधीन किया गया था । कोई toeprint 5 ' टोपी (चित्रा 1डी, लेन 1) के अभाव में मनाया गया लेकिन ribosomes सफलतापूर्वक HBB आरएनए (चित्रा 1डी, लेन 2) के लिए भर्ती किया गया ।

Figure 1
चित्र 1 . Toeprinting विश्लेषण एक अनछाया XIAP आयरेस आरएनए पर अनुवाद दीक्षा परिसरों के गठन के लिए आयरेस द्वितीयक संरचना के महत्व की पुष्टि करता है । (क) डीएनए के योजनाबद्ध आरेख XIAP आयरेस आरएनए इस विश्लेषण में प्रयुक्त एंकोडिंग का निर्माण । toeprinting प्राइमर के 3 ' अंत ४२ है शुरू codon के बीपी बहाव । (ख) WT XIAP आयरेस के माध्यमिक संरचनाओं (ऊपरी बाएँ), 5 ' पीपीटी उत्परिवर्ती (ऊपरी दाएँ), 3 ' ppt उत्परिवर्ती (कम बाएँ), और ppt डबल उत्परिवर्ती (कम सही). ' पीपीटी उत्परिवर्ती ' एक महत्वपूर्ण polypyrimidine पथ में एक बिंदु उत्परिवर्तन (ए. ए.) को संदर्भित करता है, जो आयरेस8,10,12के माध्यमिक संरचना बाधित । प्रारंभ codon बॉक्स्ड है; बिंदु उत्परिवर्तनों तारक (*) के साथ संकेत दिया है । (ग) XIAP आयरेस वेरिएंट की क्षमता का Toeprinting विश्लेषण जीएमपी-PNP और एटीपी के साथ इलाज RRL में अनुवाद दीक्षा परिसरों के रूप में । शुरू codon अगस्त AAC के साथ शुरू codon उत्परिवर्ती में बदल दिया गया था । आरएनए एक पाली की कमी बनाने के लिए-एक पूंछ, रिवर्स प्राइमर इन विट्रो प्रतिलेखन टेम्पलेट बस एक पाली-टी पथ की कमी बनाने के लिए इस्तेमाल किया । (घ) दीक्षा परिसर का गठन छाया हुआ (किन्तु न कि संयुक्त राष्ट्र में छाया हुआ) 5 ' UTR of human β-ग्लोबिन (HBB) पर गठित किया गया । पैनलों में (C) और (D), वाम सबसे 4 लेन प्रत्येक लेन के ऊपर संकेत dideoxy न्यूक्लियोटाइड के साथ sequencing प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधित्व; अनुक्रम प्रत्येक फलक के बाईं ओर इंगित है । FL, पूर्ण लंबाई । जब तक अंयथा निर्दिष्ट सभी RNAs अन-छाया रहे थे । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन8,10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Toeprinting एक शक्तिशाली तकनीक को सीधे ब्याज की एक आरएनए की क्षमता को मापने के लिए उच्च नियंत्रित परिस्थितियों में अनुवाद दीक्षा परिसरों के गठन का समर्थन है । इस प्रोटोकॉल toeprinting स्तनधारी RNAs के लिए एक सरलीकृत तकनीक का वर्णन है । खरगोश reticulocyte lysate (RRL) ribosomes, eIFs, सर्जक tRNA, और आयरेस ट्रांसअभिनय कारकों (ITAFs) के एक सुविधाजनक स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है । प्रयोगकर्ता पसंद की उनकी आरएनए प्रदान करता है, और उनके चयन के विशिष्ट cofactors के साथ toeprinting प्रतिक्रिया का पूरक भी हो सकता है । उदाहरण के लिए, 48S बनाम 80 अनुवाद दीक्षा परिसरों toeprints7के प्रतिदीप्ति तीव्रता के वितरण के आधार पर विभेदित किया जा सकता है । दीक्षा परिसर मनाया guanine न्यूक्लियोटाइड इस्तेमाल के प्रकार पर निर्भर करेगा । XIAP आयरेस के मामले में यहां चर्चा की, जीएमपी-PNP प्लस एटीपी स्थिर 48S पूर्व दीक्षा परिसरों, एक toeprint वितरण की विशेषता + 17 ≥ + 18 > + 19 । जीएमपी-PNP एक nonhydrolyzable GTP अनुरूप है कि राइबोसोमल उपइकाई में शामिल होने, इस प्रकार 48S चरण13पर अनुवाद दीक्षा अवरुद्ध रोकता है । इसके विपरीत, GTP, एटीपी, या एटीपी प्लस GTP के 80 के दशक दीक्षा परिसरों स्थिर, toeprint वितरण की विशेषता + 17 < + 18 > + 198।

उपयोगकर्ता को आरएनए वे toeprint की इच्छा के प्रकार पर विचार करना होगा । यदि उद्देश्य एक टोपी-स्वतंत्र तंत्र, जैसे कि एक आयरेस तत्व का अध्ययन करने के लिए है, आरएनए किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के साथ लिखित इन विट्रो में हो सकता है । हालांकि, किसी भी स्तनधारी आरएनए इस toeprinting विधि के अधीन किया जा सकता है, बशर्ते कि यह एक 5 ' कैप संरचना है. छाया हुआ mRNA एक उपयुक्त किट का उपयोग कर उत्पंन किया जाना चाहिए । किसी भी मामले में, निर्माता के प्रोटोकॉल बारीकी से पालन किया जाना चाहिए, के रूप में उच्च गुणवत्ता आरएनए की तैयारी प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है. एक और महत्वपूर्ण बात यह है कि कदम ३.७ में phenol निष्कर्षण बाहर या तटस्थ पीएच ऊपर किया जाना चाहिए; इस स्तर पर एसिड phenol का प्रयोग किया जाता है, तो नव संश्लेषित सीडीएनए खो जाएगा । यह ध्यान देने योग्य है कि मैग्नीशियम एसीटेट की एकाग्रता चरण ३.५ में इस्तेमाल रिवर्स प्रतिलेखन की दक्षता को प्रभावित कर सकते है लायक है, और प्रत्येक mRNA के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

कुछ महत्वपूर्ण नियंत्रण toeprint की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं । सबसे पहले, कोई मजबूत toeprint RRL या न्यूक्लियोटाइड के अभाव में मनाया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करता है कि स्वीकार्य रिवर्स प्रतिलेखन ठहराव एक ribosome-आरएनए परिसर के बजाय एक स्थिर आरएनए माध्यमिक संरचना या रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के साथ ही कुछ दोष के कारण है । दूसरा, कोई toeprint अगर शुरू codon रूपांतरित किया जाता है मनाया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करता है कि ribosome आरएनए के प्रारंभ codon के साथ विशेष रूप से एक जटिल का गठन किया है और यह है कि उपयोगकर्ता सही ढंग से ribosome के 3 के किनारे की पहचान की है शुरू codon के साथ जटिल. यह आयरेस तत्वों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जो ribosome को एक वैकल्पिक प्रारंभ codon14पर भर्ती हो सकता है । इसी तरह, toeprint एक पाली के अभाव में बिगड़ा जा सकता है-एक पूंछ, के रूप में XIAP आयरेस के लिए मामला था8। तथापि, कुछ आयरेस तत्व एक पाली-एक पूंछ के अभाव में toeprints रूप में, जैसे CrPV आयरेस10। अंत में, toeprint उचित के अलावा, अंय रिवर्स प्रतिलेखन pauses मनाया जा सकता है । ये बस आरएनए में स्थिर माध्यमिक संरचनाओं के कारण ठहरावों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, या वे एक डब घटना के कारण हो सकता है "ribosome कूद", जिसमें शुरू codon से ribosome की स्लाइड आरएनए पर अन्य स्थानों के लिए15. इन संभावनाओं के बीच अंतर करने के लिए, toeprinting प्रतिक्रिया cycloheximide की उपस्थिति में किया जा सकता है8, जो प्रभावी ढंग से ribosome को प्रारंभ codon पर स्थिर करता है और toeprints जंपिंग के कारण वैकल्पिक ribosome को कम करना चाहिए । विशेष रूप से, अलग mRNAs विभिन्न माध्यमिक संरचनाओं होगा, जिसका अर्थ है कि संख्या और रिवर्स प्रतिलेखन की तीव्रता pauses (यानी, पृष्ठभूमि बैंड) भी भिन्न हो जाएगा.

इस तकनीक की एक संभव सीमा है कि यह इन विट्रो मेंएक mRNA के लिए ribosome भर्ती उपाय है, लेकिन एक अनुवाद दीक्षा परिसर के गठन जरूरी है कि अनुवाद vivo मेंहो जाएगा मतलब नहीं है । इसलिए, toeprinting विशेष रूप से शक्तिशाली है जब vivo में तकनीक के साथ संयुक्त अनुवाद को मापने के लिए (उदा., polysome profiling16) और जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन का स्तर (उदा., पश्चिमी विश्लेषण) ।

एक और हाल ही में तकनीक है "ribosome profiling" ("ribosome पदचिह्न" भी कहा जाता है), जिसमें उच्च प्रवाह आरएनए अनुक्रमण कुल सेलुलर mRNA पर ribosomes की उपस्थिति को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह एक transcriptome व्यापक पैमाने पर ribosome भर्ती को मापने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है । ribosome रूपरेखा के लिए अंतर्निहित cycloheximide के रूप में रिएजेंट, का उपयोग है, को mRNAs पर ribosomes स्थिर । यह संभावित रूप से एक खामी का प्रतिनिधित्व करता है, ribosomes की आय से अधिक संख्या के रूप में गैर विशेष रूप से 5 ' unअनुवादित क्षेत्र (UTR) है, जो गैर के रूप में गलत व्याख्या की जा सकती में ठप हो सकता है विहित अनुवाद दीक्षा17। toeprinting में, cycloheximide प्रक्रिया का एक अभिंन हिस्सा नहीं है, इस तरह के झूठे सकारात्मक की संभावना को नकारने । इसके अलावा, किसी भी एकल mRNA toeprinting द्वारा अधिक से अधिक विस्तार में अध्ययन किया जा सकता है, के रूप में यह कई नियंत्रण प्रयोगों और पुनरावृत्तियों का संचालन करने के लिए सतही है (उदाहरण के लिए, कई बिंदु उत्परिवर्तनों के प्रभाव का परीक्षण, या एक पाली की अनुपस्थिति-एक पूंछ, ribosome भर्ती पर). यह समय लेने वाली और लागत के लिए एक ribosome रूपरेखा प्रयोग के संदर्भ में नियंत्रण प्रयोगों के एक समकक्ष सरणी बाहर ले जाने के लिए निषेध होगा । Toeprinting इस प्रकार उच्च प्रवाह अनुक्रमण आधारित तकनीक के लिए एक पूरक दृष्टिकोण है, और अभी भी सामांयतः अनुवाद विनियमन8,9,10के स्पष्ट तंत्र को लक्ष्य अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया, 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का कोई संघर्ष-हित का खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

यह काम एक प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा के परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया-डिस्कवरी अनुदान (RGPIN-2017-05463), अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन-जॉन आर इवांस नेताओं कोष (३५०१७), परिसर अलबर्टा नया कार्यक्रम और अलबर्टा मंत्रालय के आर्थिक विकास और व्यापार ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma D5758-100ML
TRIS base, Ultrapure JT Baker 4109-01
KOAc (Potassium acetate) Bio Basic PB0438
Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) Bio Basic MB0326
Sucrose, molecular biology grade Calbiochem 573113-1KG
Spermidine Sigma 85558
GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution Sigma G0635
ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution Sigma A6559
19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% Bio Basic A0006
Urea Bio Basic UB0148
500mL bottle top filtration units, 0.2 µm Sarstedt 83.1823.101
Formamide Sigma F9037-100ML
EDTA (disodium salt, dihydrate) Bio Basic EB0185
SDS Bio Basic SB0485
Bromophenol blue Bio Basic BDB0001
Xylene cyanol FF Bio Basic XB0005
MEGAshortscript T7 transcription kit Ambion AM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit Ambion AM1344
Acid Phenol:Chloroform (5:1) Ambion AM9722
25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Invitrogen 15593-049
Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. Green Hectares, USA Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) Thermo Fisher E00382
100 mM dNTPs Invitrogen 56172, 56173, 56174, 56175 Mix equal parts for a stock of 25 mM each.
AMV-RT, 10 U/µL Promega M5101
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit Thermo Fisher 707701KT
Model 4200 IR2 DNA analyzer LI-COR Product has been discontinued
APS (Ammonium Persulfate) Bio Basic AB0072
TEMED Bio Basic TB0508
Phusion High Fidelity Polymerase New England Biolabs M0530
Turbo Dnase Thermo Fisher AM2238

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
  3. Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
  4. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
  5. Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
  6. Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
  7. Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
  8. Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
  9. Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
  10. Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
  11. Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
  12. Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
  13. Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
  14. Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
  15. Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
  16. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
  17. Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
  18. Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).

Tags

जैव रसायन अंक १३५ Toeprinting अनुवाद विनियमन अनुवाद दीक्षा सेलुलर आयरेस 5 ' कैप कैप-स्वतंत्र mRNA eukaryotic दीक्षा कारक eIFs
स्तनधारी mRNAs पर अनुवाद दीक्षा परिसर गठन का Toeprinting विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ross, J. A., Thakor, N. Toeprinting… More

Ross, J. A., Thakor, N. Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs. J. Vis. Exp. (135), e57519, doi:10.3791/57519 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter