Summary
Toeprinting zielt darauf ab, die Möglichkeit der in-vitro- Messung transkribierte RNA zu Form Übersetzung Einleitung komplexe mit Ribosomen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Toeprinting Säugetieren RNA und kann zur GAP-abhängige und IRES-driven Übersetzung zu studieren.
Abstract
Übersetzung Einleitung ist der Rate-limiting Schritt der Proteinsynthese und ist einen wesentlichen Punkt, bei dem Zellen ihre Protein-Produktion regulieren. Verordnung der Proteinsynthese ist der Schlüssel zur zellulären Stressantwort und Dysregulation ist zentral zu vielen Krankheitszuständen, wie z. B. Krebs. Obwohl zellulären Stress zu die Hemmung der globalen Übersetzung durch mildernde GAP-abhängige Initiation führt, sind bestimmte Stressantwort Proteine beispielsweise selektiv auf GAP-unabhängige Weise übersetzt. Diskrete RNA regulatorische Elemente, wie z. B. zelluläre interne Ribosom Eintrag Websites (IRESes), ermöglichen die Übersetzung dieser spezifischen mRNAs. Identifizierung von solchen mRNAs und die Charakterisierung ihrer regulatorischen Mechanismen wurden ein wichtiger Bereich in der molekularen Biologie. Toeprinting ist eine Methode für die Untersuchung von RNA-Struktur und Funktion betrifft Übersetzung Einleitung. Das Ziel des Toeprinting ist zur Beurteilung der Fähigkeit von in-vitro- transkribierte RNA bilden stabile komplexe mit Ribosomen unter verschiedensten Bedingungen, um festzustellen, welche Sequenzen, Strukturelemente oder Zubehör Faktoren im Ribosom beteiligt sind verbindlich – ein Vorläufer für effiziente Übersetzung Einleitung. Neben anderen Techniken, wie westliche Analyse und Polysome profiling ermöglicht Toeprinting eine robuste Charakterisierung der Mechanismen zur Regulierung der Übersetzung Einleitung.
Introduction
Wie die Übersetzung die zelluläre Energie verbraucht, ist es sinnvoll, dass Übersetzung streng regulierte1ist. Umgekehrt, Dysregulation der Übersetzung- und den daraus resultierenden Änderungen in Protein-Ausgabe-oft in Stress-Reaktion und Krankheit Staaten, z. B. Krebs1,2eingehalten wird. Ein großer Vorteil der translational Control ist die Geschwindigkeit, mit der Zellen ihre Protein-Produktion verändern können, um auf verschiedene Reize3reagieren. Übersetzung-Verordnung stellt somit einen wichtigen Mechanismus, der Zelle überleben und Tod1,2,3beeinflussen können. Von den Stufen des Übersetzung ist Initiation die meisten hoch regulierten und komplexen3. Kurz, enthalten die meisten eukaryontischen mRNAs eine 5' m7G Mütze, die fast immer für ihre Übersetzung unerlässlich. GAP-abhängige Initiation erfordert eukaryotic Initiation Faktoren eIF4E, eIF4A und eIF4G (GAP-Anerkennung Komplex), mit 5'-Ende der mRNA zu interagieren. 43 preinitiation Ribosomen Komplex, enthält eIF2 gebundene Initiator tRNA und eIF3, wird eingestellt, um die 5'-Ende der mRNA durch eine Wechselwirkung von eIF4G mit eIF3. Die komplexen Preinitiation wird gedacht, um mRNA, unterstützt von eIF4A Scannen (ein RNA-Helikase) bis der Start-Codon (AUG) befindet. Die 48er Einleitung komplexer entsteht anschließend und tRNA wird in der P-Seite von dem Ribosom geliefert. Schließlich sind die 60er und 40er Ribosomen-Untereinheiten vereint bilden die 80er Jahre Einleitung Komplex, gefolgt von Übersetzung Dehnung1,3,4. Im Gegensatz dazu umgehen interne Ribosom Eintrag Websites (IRESes) die Voraussetzung für eine 5' Kappe durch die Rekrutierung der 40er Jahre ribosomalen Untereinheit direkt an die Einleitung Codon3. Physiologischen Spannungszustände dämpfen globale mRNA Übersetzung aufgrund von Änderungen der wichtigsten allgemeinen eukaryotischen Einleitung Faktoren (WDVS). Jedoch nicht-kanonischen Übersetzung Einleitung Mechanismen erlauben selektive Übersetzung bestimmter mRNAs, die oft Stressantwort Proteine codieren und Dysregulation der nicht-kanonischen Übersetzung Initiation ist bei Krankheitszuständen wie Krebs verwickelt 1 , 2. diskret RNA regulatorische Elemente, wie z. B. zelluläre IRESes zu ermöglichen, für die Übersetzung von solchen mRNAs2,3.
Ein besonders interessanter Aspekt von translational Control ist es, Mechanismen der kanonischen versus nicht-kanonischen Übersetzung von einem bestimmten mRNA zu verstehen. Toeprinting ist eine Technik, die der mechanistischen Detailstudie über Übersetzung Einleitung der spezifischen RNAs in Vitroermöglicht. Das Ziel des Toeprinting ist die Fähigkeit einer RNA von Interesse, die Bildung von einer Übersetzung Initiation Komplex mit dem Ribosom unter verschiedensten Bedingungen, um festzustellen, welche Sequenzen, Strukturelemente oder Accessoire Keimbildung zu bewerten Faktoren sind für effiziente Übersetzung Einleitung erforderlich. Beispielsweise könnte Ribosom Rekrutierung in Ermangelung eines 5'-Cap behindert aber angeregt durch die Anwesenheit von einer IRES.
Das Prinzip der Technik ist, in-vitro- transkribieren eine RNA von Interesse, es in Anwesenheit von Zellextrakten mit Übersetzung (oder die gereinigten Komponenten) ermöglichen Einleitung komplexe zu bilden, und umgekehrt zu transkribieren inkubieren die RNA mit einem speziellen Primer. Stabile RNA-Ribosom komplexe verursacht reversen Transkription zum Strömungsabriss am 3' Rand der Ribosom-die so genannte 'Toeprint'5,6,7.
In diesem Protokoll der ribosomalen Untereinheiten, WDVS, tRNAs und IRES Trans-wirkenden Faktoren (ITAFs) werden bequem durch Kaninchen Retikulozytenzahl lysate (RRL) beigetragen. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Primer eindringmittel beschriftet und Fluoreszenz Gel-basierte Imager, anstatt einer radioaktiven Grundierung. Dadurch entfallen zusätzliche Schritte, einschließlich enzymatische die Grundierung sowie das Gel Trocknen und setzen Sie sie auf eine Intensivierung Bildschirm. Die fluoreszierende Bänder werden in Echtzeit, als die Gel läuft, ermöglicht größere Auflösung aufgezeichnet. Entdeckelte X-chromosomal-Inhibitor von Apoptosis Protein (XIAP) IRES RNA wird hier, als Beispiel verwendet, obwohl angeschnittene Ärmel mRNAs auch mit dieser Technik8analysiert werden kann.
Im Gegensatz zu westlichen Analyse, die die endgültige Ausgabe des Übersetzungsprozesses in Zelle Lysates misst, ist Toeprinting ein in-vitro- Ansatz zur Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf einer RNA zu messen. Diese reduktionistische Ansatz ermöglicht es, für die sehr detaillierte Untersuchung von Substraten oder Faktoren, die Übersetzung Einleitung zu regulieren (zB., angeschnittene Ärmel oder UN-angeschnittene Ärmel mRNA, IRES-Struktur, Vorhandensein oder Fehlen von Poly-A Tail, Bestimmung von spezifischen Proteins Faktoren, ( usw.). Daher kann Toeprinting verwendet werden, verschiedene Modi der Übersetzung8 oder die Auswirkungen der mRNA Strukturen, z. B. IRESes, am Protein Synthese9,10zu studieren.
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Protocol
Hinweis: RNA ist sehr anfällig gegen Abbau durch Ribonuclease (RNases). Vorkehrungen Sie treffen, standard, die RNA intakt zu halten. Ändern Sie häufig Handschuhe. Verwenden Sie gefilterte Pipettenspitzen, Nuklease-freie Plastikware und Nuklease-freie Chemikalien in allen Schritten des Protokolls. Nuklease-freie Nutzung oder Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltes Wasser für alle Lösungen.
1. Vorbereitung der Lösungen
- Toeprinting Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5 % (w/V) Saccharose, 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,5 mM Spermidine.
- Speichern Sie DVB-t und Spermidine in Einweg-Aliquote bei-20 ° C, wiederholte Frost-Tau-wechseln zu vermeiden.
Hinweis: DVB-t und Spermidine sollte in den Puffer Toeprinting unmittelbar vor der Anwendung hinzugefügt werden. Eine Lösung ohne DVB-t und Spermidine kann bei-20 ° c gelagert werden
- Speichern Sie DVB-t und Spermidine in Einweg-Aliquote bei-20 ° C, wiederholte Frost-Tau-wechseln zu vermeiden.
- Bereiten Sie Aliquote von 85 mM-5'-Guanylyl-Imidodiphosphate (GMP-PNP) und 91 mM Adenosintriphosphat (ATP). Speichern der Aliquote bei-20 ° C.
- 450 mL 6 % Polyacrylamid - 7M Harnstoff Gel Mischung vorbereiten: 67,5 mL 40 % Acrylamide:bis-Acrylamid (19:1), 189 g Harnstoff, 112,5 mL 5 x TBE (Tris/Borat/Thylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)) und 120 mL Wasser. Lösen Sie den Harnstoff durch Erwärmung im Wasserbad 37 ° C oder auf einer Heizplatte unter Rühren auf. Filtern Sie die Lösung (zB., 0,2 μm Nitrozellulose Vakuumfilter).
Hinweis: Die Lösung kann bei 4 ° C für mindestens einen Monat aufbewahrt werden.
Achtung: Monomere Acrylamid ist ein Nervengift, das durch die Haut absorbiert werden kann. Achten sehr darauf, Kontakt mit der Haut zu vermeiden (zB., tragen Sie Handschuhe, einen Laborkittel und Augenschutz). Polyacrylamid sollte auch mit Sorgfalt, behandelt werden, wie Polymerisation nicht 100 % vollständig erfolgen kann. - Formamid laden Farbstoff vorbereiten: 95 % Formamid, 18 mM EDTA, 0,025 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 0,025 % (w/V) Bromophenol Blue, Xylol Cyanol 0,025 % (w/V). Shop bei-20 ° C.
- 1 Nmol Grundierung (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' Ende beschriftet mit IRDye 800) in 100 μl Wasser für eine arbeiten-Konzentration von 10 Pmol/μL auflösen. Bei-20 ° C in Einweg-Aliquote (ca. 10 µL), vor Licht geschützt aufbewahren.
2. Vorbereitung der mRNA
- DNA-Templates für die Synthese von mRNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus entsprechende Vorlagen zu verstärken (i.e., genomische DNA oder Plasmid DNA, je nach Bedarf). Verwenden Sie ein High-Fidelity-DNA-Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit den folgenden Reaktionsbedingungen (35 Zyklen): Schmelzen, 98 ° C, 10 s; Tempern, 53 ° C, 20 s; verlängern, 72 ° C, 30 s.
Hinweis: Der forward Primer (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) beinhaltet die T7 promotorsequenz für RNA-Transkription ermöglichen; die rückwärts-Primer (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) umfasst 51 Thymin Rückstände um ein Poly-A-Rute für die transkribierten RNA zu bieten. Beachten Sie, dass RNA auch in Vitro von Plasmid DNA transkribiert werden kann. - Einsatz eines entsprechenden Transkription-Kit zur in-vitro- Transkription IRES-haltigen RNA oder angeschnittene Ärmel RNA aus der DNA-Vorlage. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Die RNA-Probe in 20 μL Reaktion Standardvolumes vorbereiten. Behandeln Sie die neu synthetisierten RNA mit 2 Einheiten von RNase-freie DNase für 30 min bei 37 ° C.
- Verdünnen Sie die DNase-behandelten RNA auf 110 µL mit Nuklease-freies Wasser hinzufügen 110 µL Säure Phenol, Wirbel 5 s und Zentrifuge für 3 min bei 20.000 x g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie 100 µL der wässrigen Phase zu einem neuen 1,5 mL Microfuge Schlauch zu, fügen Sie 10 µL 3 M Natriumacetat und Vortex 2 s. hinzufügen, 3 Bände von 100 % Ethanol, Wirbel 5 s und überstürzen Sie sich die RNA bei-20 ° C über Nacht.
- Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C und der Überstand verwerfen. Waschen Sie die Tablette mit 500 µL eiskalte 70 % (V/V) Ethanol und wiederholen Sie die Zentrifugation. Aspirieren Sie so viel des Überstands wie möglich und trocknen Sie das Pellet für 5-10 min. vorsichtig nicht zu die Pellets zu verdrängen sein.
- Aufschwemmen der RNS in das entsprechende Volumen der Nuklease-freies Wasser um eine arbeiten-Konzentration von 0,5 μg/μL zu erzielen. Dies kann bei-80 ° C gelagert oder sofort verwendet werden.
3. Toeprinting Reaktion
- Mix 15 μl der Kaninchen Retikulozytenzahl Lysate (RRL, nicht Nuklease behandelt), 1 μl RNase-Inhibitor, 1 µL 91 mM ATP (1,82 mM final) und 1 μL von 85 mM GMP-PNP-(1,7 mM final) in einer 1,5 mL Microfuge Röhre (40 Einheiten). Bei 30 ° C für 5 min inkubieren.
Hinweis: Die RRL regelmäñig für den einmaligen Gebrauch, sich wiederholende Einfrieren Auftauen zu vermeiden sollte. Eine kritische Kontrolle ist eine Reaktion fehlt RRL, um die natürlichen Pausen der reversen Transkription durch die sekundäre Struktur der RNA aufzuklären. Fügen Sie Toeprinting Puffer um RRL für dieses Steuerelement zu ersetzen. - Fügen Sie 0,5 µg RNA (1 µL) und bei 30 ° C für 5 min inkubieren.
- Fügen Sie 22 µL Toeprinting-Puffer und bei 30 ° C für 3 min inkubieren.
- Hinzufügen von 0,5 µL (5 Pmol) mit der Bezeichnung von IRDye Grundierung und inkubieren Sie für 10 min auf Eis.
- Fügen Sie 2 µL 25 mM dNTPs (Endkonzentration: 1 mM), 2 µL 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL des Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transkriptase (AMV-RT) und 3,5 µL Toeprinting-Puffer. Der letzte Band ist 50 μL.
- Inkubieren Sie die Reaktion bei 30 ° C für 45 min.
- 200 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen und sofort mit 250 µL 25:24:1 Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (pH-Wert ca. 8.0) zu extrahieren. Vortex 5 s und Zentrifuge bei 20.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Entfernen der wässrigen Phase zu einem neuen 1,5 mL Microfuge Schlauch, 3 Bände von 100 % Ethanol, Wirbel 5 s hinzufügen und über Nacht bei-20 ° C Niederschlag.
- Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C und der Überstand verwerfen. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 500 µL eiskaltes Ethanol 70 % (V/V). Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Aspirat soviel überstand als möglich und mit Luft trocknen das Pellet für 5-10 min. nicht zu verdrängen das Pellet vorsichtig sein.
- Das Pellet in 6 μL der Nuklease-freies Wasser auflösen und 3 μl Formamid laden Farbstoff hinzufügen.
4. Sequenzierung Reaktionen
- Verwenden Sie der DNA-Vorlage von 2.1 und die IRDye beschriftet Grundierung aus Schritt 3.4 für standard-Sequenzierung Reaktionen, mit Dideoxynucleotides (DdNTPs) als Kette Terminatoren. Verwenden Sie eine entsprechende DNA-Sequenzierung Kit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
- Mix 6 μL jeder Sequenzierung Reaktion mit 3 μl Formamid Farbstoff beladen.
5. Vorbereitung der Sequenzierung Gel und Elektrophorese
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine Fluoreszenz-Gel-basierten-Imager und eine 21 cm x 23 cm x 0,2 mm Gel, sondern kann bei Bedarf für andere Sequenzer oder Gel-Größen angepasst werden.
- Reinigen Sie 0,2 mm spacer sowie die kurzen (23 × 25 cm) und lange (30 × 25 cm) Glasplatten mit 100 % igem Ethanol gründlich. An der Luft trocknen.
- Mischung 30 mL 6 % Polyacrylamid - 7M Harnstoff Gel zu mischen, mit 200 μl 10 % (w/V) Ammonium Bleichen (APS) und 20 μL der Tetramethylethylenediamine (TEMED). Gießen Sie Gel, kümmert sich um die Vermeidung von Luftblasen, und fügen Sie den "Hai-Zahn" Gel Kamm. Lassen Sie das Gel für 1 h bei Raumtemperatur zu polymerisieren.
- Die Sequenzierung Apparat zusammenbauen und füllen Sie den Behälter mit 1 X TBE.
- Bereits für 15 min bei 1500 V laufen Sie, bis die optimale Temperatur von 55 ° C erreicht wird.
- Erhitzen Sie den Probenaufnahme/Farbstoff-Mix (aus Schritte 3,9 oder 4.2) auf 85 ° C für 5 min. Last 1 μL auf die Sequenzierung Gel.
- Führen Sie das Gel bei 1500 V für 8 h. Das Gerät liest die Bands in Echtzeit.
- Zerlegen Sie das Gerät zu, und entsorgen Sie die Acrylamid-Gel und laufenden Puffer.
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Representative Results
Zuvor haben wir die Möglichkeit der XIAP IRES zur Unterstützung von GAP-unabhängige Übersetzung Einleitung in-vitro-8,10beschrieben. Toeprinting war der Key-Technik, die mechanistischen Details der komplexen XIAP IRES Einleitung zu befragen. Ein DNA-Konstrukt Codierung eine mRNA mit XIAP IRES (Abb. 1A) wurde in Vitro transkribiert und Toeprinting Analyse unterzogen. Die mutierten Varianten der hier verwendeten XIAP IRES mRNA sind in Abbildung 1Bvertreten. Reversen Transkription des XIAP mRNA-Ribosom komplexes ergab typische Toeprints + 17, + 19 nt stromabwärts des AUG (Abbildung 1C, Spur 1). Dies ist bezeichnend für Ribosom Anwerbung für die Start-Codon und die Bildung von stabilen Ribosom-RNA-komplexe5,6,7. Ribosom Rekrutierung wurde in Ermangelung eines Poly-A-Schwanzes (Abbildung 1C, Bahn 9), wie bereits berichtet11stark beeinträchtigt. Toeprint Bildung wurde auch stark beeinträchtigt, in Ermangelung der RRL und GMP-PNP (Abbildung 1C, Bahn 8) und für die Start-Codon-Mutante (Abbildung 1C, Bahn 7), bestätigt, dass die beobachteten Toeprint keine Struktur-induzierte Pause der reversen Transkription ist aber in der Tat, spezifisch für Einleitung Komplexbildung. Toeprint Bildung war für die 5' Polypyrimidine-Darm-Trakt (PPT) Mutante (Abbildung 1C, Lane 2) und die 3' PPT Mutante (Abbildung 1C, Bahn 4), die IRES-Struktur (Abb. 1B) stören beeinträchtigt8 ,10,12. Toeprint Bildung wurde wiederhergestellt, wenn die PPT-Mutanten mit einer 5' Kappe (Abbildung 1C, Bahnen 3 und 5) transkribiert wurden. Toeprint Bildung wurde auch für die PPT Doppel Mutante (Abbildung 1C, Bahn 6), die die Sekundärstruktur (Abbildung 1B)10wieder restauriert. Zusammen zeigen diese Daten, dass die Sekundärstruktur des XIAP IRES für Übersetzung Einleitung des UN-angeschnittene Ärmel RNA entscheidend und IRES-Struktur für GAP-abhängige Übersetzung Einleitung entbehrlich ist. Um den spezifischen Anforderungen ein 5'-Cap in Ermangelung einer IRES-Struktur weiter zu demonstrieren, wurde menschliche β-Globin (HBB) mRNA Toeprinting Analyse (Abbildung 1-D) unterzogen. Keine Toeprint wurde in Ermangelung eines 5' Cap (Abbildung 1D, Lane 1) beobachtet, aber Ribosomen waren erfolgreich, angeschnittene Ärmel HBB RNA (Abbildung 1D, Spur 2) eingestellt.
Abbildung 1 . Toeprinting Analyse bestätigt die Bedeutung der IRES Sekundärstruktur für die Bildung der Übersetzung Einleitung komplexe auf einer nicht begrenzten XIAP IRES RNA. (A) schematische Darstellung der Codierung der XIAP IRES RNA in dieser Analyse verwendeten DNA-Konstrukt. Die 3'-Ende des Primers Toeprinting ist 42 bp stromabwärts von der Start-Codon. (B) Sekundärstrukturen WT XIAP IRES (oben links), die 5' PPT Mutante (oben rechts), die 3' PPT Mutante (links) und die PPT Doppel-Mutante (unten rechts). "PPT Mutant" bezieht sich auf eine Punktmutation (UU auf AA) in eine kritische Polypyrimidine-Darm-Trakt, das stört die Sekundärstruktur der IRES8,10,12. Das Start-Codon ist boxed; die Punktmutationen sind mit Sternchen (*) gekennzeichnet. (C) Toeprinting Analyse der Fähigkeit von XIAP IRES Varianten, Form Übersetzung Einleitung komplexe in RRL mit GMP-PNP und ATP behandelt. Start-Codon AUG wurde mit AAC in das Start-Codon Mutante ersetzt. Um RNA fehlt ein Poly-A-Endstück zu machen, fehlte der rückwärts-Primer verwendet, um die in-vitro- Transkription Vorlage machen einfach einen Poly-V-Darm-Trakt. (D) Einleitung Komplex entstand auf die angeschnittene Ärmel (aber nicht die UN-angeschnittene Ärmel) 5' UTR von menschlichen β-Globin (HBB). In Seitenteile (C) und (D), die am weitesten links 4-spurig repräsentieren Sequenzierung Reaktionen mit den Dideoxy Nukleotiden angegeben über jeder Spur; die Reihenfolge ist auf der linken Seite jedes Panel angegeben. FL, in voller Länge. Alle RNAs waren UN-angeschnittene Ärmel, sofern nicht anders angegeben. Diese Zahl wurde von früheren Publikationen8,10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Toeprinting ist eine leistungsstarke Technik, die Möglichkeit einer RNA von Interesse, die Bildung von Übersetzung Einleitung komplexen unter sehr kontrollierten Bedingungen unterstützen direkt zu messen. Dieses Protokoll beschreibt eine vereinfachte Technik für Toeprinting Säugetieren RNAs. Kaninchen Retikulozytenzahl lysate (RRL) dient als bequeme Quelle von Ribosomen, WDVS, Initiator tRNA und IRES Trans-wirkenden Faktoren (ITAFs). Der Experimentator bietet ihre RNA der Wahl und kann auch die Toeprinting Reaktion mit bestimmten Cofaktoren ihrer Wahl ergänzen. Zum Beispiel können 48er versus 80er Übersetzung Einleitung komplexe basierend auf die Verteilung der Fluoreszenz-Intensität von Toeprints7unterschieden werden. Die Einleitung komplexer beobachtet hängt von der Art der Guanin-Nukleotid verwendet. Im Falle der XIAP IRES hier diskutiert, GMP-PNP plus ATP stabilisiert 48er vor Einleitung komplexe, zeichnet sich durch eine Toeprint Verteilung + 17≥ + 18 > + 19. GMP-PNP ist ein Nonhydrolyzable GTP analog, die ribosomalen Untereinheit verbinden, so blockieren Übersetzung Einleitung an der 48er Schritt13hemmt. Im Gegensatz dazu stabilisiert GTP, ATP, oder ATP und GTP 80er Jahre Einleitung komplexe, gekennzeichnet durch Toeprint Verteilung + 17 + 19 + < 18 >8.
Der Benutzer muss die Art der RNA zu betrachten, die sie Toeprint möchten. Wenn es darum geht, einen GAP-unabhängigen Mechanismus, z. B. eine IRES-Element zu studieren kann die RNA in Vitro mit jeder handelsüblichen Kit transkribiert. Jedoch kann jedes Säugetier RNA dieser Methode Toeprinting unterzogen werden, vorausgesetzt, es eine 5'-Cap-Struktur hat. Angeschnittene Ärmel mRNA muss mit einem geeigneten Kit generiert werden. Des Herstellers Protokolle müssen in jedem Fall engmaschig überwacht werden, da die Erstellung von qualitativ hochwertigen RNA einen wichtigen Schritt im Verfahren darstellt. Ein weiterer kritischer Punkt ist, dass die Phenol Extraktion im Schritt 3,7 bei oder über pH-neutralen erfolgen muss; Wenn Säure Phenol zu diesem Zeitpunkt verwendet wird, werden die neu synthetisierte cDNA verloren gehen. Es ist erwähnenswert, dass die Konzentration von Magnesium-Acetat in Schritt 3.5 verwendet auf die Effizienz der reversen Transkription Einfluss kann, und kann für jedes mRNA optimiert werden.
Ein paar wichtige Kontrollen sind notwendig, um die Spezifität der Toeprint zu gewährleisten. Erstens sind keine robusten Toeprint in Ermangelung RRL oder Nukleotid einzuhalten. Dadurch wird sichergestellt, dass die beobachteten reversen Transkription Pause ein Ribosom-RNA-Komplex als eine stabile RNA Sekundärstruktur oder irgendeinen defekt bei der reversen Transkription Reaktion selbst dürfte. Zweitens sollten keine Toeprint werden beobachtet, wenn das Start-Codon mutiert ist. Dies stellt sicher, dass das Ribosom einen Komplex speziell mit dem Start-Codon der RNA gebildet hat und, dass der Benutzer korrekt 3' Rand der Ribosomen im Komplex mit dem Start-Codon identifiziert. Dies ist besonders wichtig für IRES-Elemente, die das Ribosom zu einer alternative Start-Codon14rekrutieren könnte. In ähnlicher Weise könnte die Toeprint in Ermangelung eines Poly-A-Schwanzes beeinträchtigt werden, wie der Fall für die XIAP IRES8war. Jedoch bilden einige IRES Toeprints in Ermangelung eines Poly-A-Schwanzes, wie z. B. die CrPV IRES10. Zu guter Letzt könnte neben der richtigen Toeprint anderen reversen Transkription Pausen einzuhalten. Diese können einfach Pausen durch stabile Sekundärstrukturen in der RNA darstellen könnte, oder sie durch ein Phänomen genannt "Ribosom springen", wobei das Ribosom aus dem Start-Codon an andere Standorte auf der RNA-15 Folien. Um diese Möglichkeiten zu unterscheiden, kann die Toeprinting Reaktion in Anwesenheit von Cycloheximide8, durchgeführt werden, die effektiv lähmt das Ribosom auf dem Start-Codon und alternative Toeprints aufgrund Ribosom springen reduzieren sollte. Vor allem verschiedene mRNAs haben verschiedene Sekundärstrukturen, was bedeutet, dass die Anzahl und Intensität von Transkription Pausen Reverse (dh., Hintergrund-Bänder) wird auch variieren.
Eine mögliche Einschränkung dieser Technik ist, dass es Ribosom Anwerbung für eine mRNA in Vitro misst, aber die Bildung von einer Übersetzung Initiation komplexe nicht zwangsläufig bedeutet, dass die Übersetzung erfolgt in Vivo. Toeprinting ist daher besonders leistungsstark in Kombination mit in Vivo Techniken, um die Übersetzung zu messen (zB., Polysome Profilerstellung16) und die daraus resultierende proteingehalte (zB., westlichen Analyse).
Eine neuere Technik "Ribosom profiling" (auch genannt "Ribosom Footprinting"), wobei Hochdurchsatz-RNA Sequenzierung verwendet wird, um das Vorhandensein von Ribosomen auf insgesamt zellulären mRNA zu messen. Dies ist eine leistungsfähige Technik, Ribosom Rekrutierung auf einem Transkriptom-Maßstab zu messen. Inhärente, Ribosom Profilierung ist der Einsatz von Reagenzien, wie Cycloheximide Ribosomen auf mRNAs zu stabilisieren. Dies ist möglicherweise einen Nachteil, da eine unverhältnismäßig hohe Zahl der Ribosomen unspezifisch im 5' untranslatierten Bereich (UTR), abgewürgt werden kann, die als nicht-kanonischen Übersetzung Einleitung17fehlinterpretiert werden können. In Toeprinting ist Cycloheximide nicht Bestandteil des Verfahrens, die Möglichkeit, solche Fehlalarme zu negieren. Darüber hinaus jede einzelne mRNA kann studiert werden ausführlicher von Toeprinting, wie es oberflächlich, viele Experimente und Iterationen durchzuführen ist (zum Beispiel testen die Wirkung von mehreren Punktmutationen oder das Fehlen eines Poly-A-Schwanzes, am Ribosom Rekrutierung). Es wäre zeitaufwändig und kostspielig, gleichwertige verschiedenste Experimente im Zusammenhang mit einem Ribosom Profilerstellung Experiment durchzuführen. Toeprinting ist somit einen ergänzenden Ansatz für Hochdurchsatz-Sequenzierung-basierte Techniken und ist immer noch häufig verwendet für Studien mit dem Ziel, die Mechanismen der Übersetzung Verordnung8,9,10zu erhellen, 18.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikt-of-Interest, offen zu legen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch eine Natur- und Engineering Research Council von Kanada-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), der Kanada-Stiftung für Innovation-John R. Evans Leaders Fund (35017), am Campus Alberta innoviert Programm und das Ministerium für Alberta finanziert. Wirtschaftliche Entwicklung und Handel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
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