Summary
Toeprinting wil het vermogen meten van in vitro Getranscribeerd RNA naar formulier vertaling initiatie complexen met ribosomen onder een aantal voorwaarden. Dit protocol wordt een methode beschreven voor de toeprinting zoogdieren RNA en kan worden gebruikt voor het bestuderen van de GLB-afhankelijke zowel IRES gestuurde vertaling.
Abstract
Inleiding van de vertaling is de snelheidslimieten stap voor eiwitsynthese en vertegenwoordigt een belangrijk punt op die cellen hun productie van eiwitten regelen. Verordening voor eiwitsynthese is de sleutel tot cellulaire stress-respons, en disregulatie staat centraal in veel landen van de ziekte, zoals kanker. Bijvoorbeeld, hoewel cellulaire stress tot de remming van de globale vertaling door geluidwerende GLB-afhankelijke initiatie leidt, zijn bepaalde stressrespons eiwitten selectief vertaald in een GLB-onafhankelijke manier. Discrete RNA regelgevende elementen, zoals cellulaire interne ribosome entry sites (IRESes), toestaan voor de vertaling van deze specifieke mRNAs. Identificatie van dergelijke mRNAs, en de karakterisatie van hun regulerende mechanismen, zijn een belangrijk gebied in de moleculaire biologie. Toeprinting is een methode voor de studie van RNA structuur en functie als het gaat om de initiatie van de vertaling. Het doel van toeprinting is om te beoordelen van het vermogen van in vitro Getranscribeerd RNA tot stabiele complexen met ribosomen onder uiteenlopende omstandigheden, om te bepalen welke sequenties, structurele elementen of bijkomende factoren zijn betrokken bij ribosoom bindende — een pre-cursor voor efficiënte vertaling initiatie. Naast andere technieken, zoals de analyse van de westerse en Polysoom profielen, zorgt toeprinting voor een robuuste karakterisering van mechanismen voor de regulering van de inleiding van de vertaling.
Introduction
Als vertaling meest cellulaire energie verbruikt, is het zinvol dat de vertaling strak gereguleerde1 is. Omgekeerd, disregulatie van de vertaling- en de daaruit voortvloeiende wijzigingen in de uitvoer van de eiwit-wordt vaak waargenomen in stress-respons en ziekte, zoals kanker1,2. Een groot voordeel van translationeel controle is de snelheid waarmee cellen hun productie van eiwitten veranderen kunnen om te reageren op verschillende stimuli3. Vertaling verordening vormt aldus een belangrijk mechanisme die invloed op de overleving van de cel en dood1,2,3 hebben kan. Van de stappen van de vertaling is Inleiding de meeste zeer gereglementeerde en complexe3. Kort, meest eukaryotische mRNAs bevatten een 5' m7G GLB dat bijna altijd essentieel is voor de vertaling ervan. Aanvang van de GLB-afhankelijke vereist eukaryotische initiatie factoren eIF4E, eIF4A en eIF4G (de GLB-erkenning complex) om te interageren met het 5' einde van de mRNA. Het 43S preinitiation ribosoom complex, waarin eIF2-gebonden initiator tRNA en eIF3, is aangeworven aan het einde 5' van de mRNA via een interactie tussen eIF4G en eIF3. De complexe preinitiation wordt beschouwd als het scannen van mRNA, geholpen door de eIF4A (een RNA helicase) totdat de start codon (AUG) ligt. De 48S Inleiding complexe vervolgens wordt gevormd en tRNA wordt geleverd in de P-site van het ribosoom. Tot slot zijn de 60S en 40S ribosoom subeenheden Verenigd om te vormen van de complexe, 80S-inleiding gevolgd door vertaling rek1,3,4. In tegenstelling, omzeilen interne ribosome entry sites (IRESes) de eis voor een 5'-cap door de indienstneming van de subeenheid 40S ribosomal rechtstreeks naar de inleiding codon3. Fysiologische stress voorwaarden verzachten globale vertaling van mRNA als gevolg van wijzigingen van belangrijke algemene eukaryotische initiatie factoren (eIFs). Echter niet-canonieke vertaling initiatie mechanismen kunnen voor selectieve vertaling van bepaalde mRNAs die vaak stressrespons eiwitten coderen en disregulatie van niet-canonieke vertaling inleiding is betrokken bij ziekte staten zoals kanker 1 , 2. discrete RNA regelgevende elementen, zoals cellulaire IRESes, toestaan voor de vertaling van dergelijke mRNAs2,3.
Een bijzonder interessant aspect van translationeel controle is te begrijpen van de mechanismen van canonieke versus niet-canonieke vertaling van een bepaalde mRNA. Toeprinting is een techniek waarmee de mechanistische detailstudie van vertaling inleiding van specifieke RNAs in vitro. Het algemene doel van toeprinting is om te beoordelen van het vermogen van een RNA van belang om de vorming van een complex met het ribosoom onder uiteenlopende omstandigheden, vertaling-initiatie ervoor om te bepalen welke sequenties, structurele elementen of accessoire factoren zijn vereist voor het initiëren van de efficiënte vertaling. Bijvoorbeeld, misschien ribosoom werving worden belemmerd in het ontbreken van een 5'-cap maar gestimuleerd door de aanwezigheid van een IRES.
Het principe van de techniek is in vitro transcriberen een RNA van belang, het broeden in de aanwezigheid van cellulaire extracten met vertaling onderdelen (of de gezuiverde componenten) zodat de inleiding complexen te vormen en om te keren transcriberen het RNA met een specifieke primer. Stabiele complexen van RNA-ribosoom zal leiden tot omgekeerde transcriptie tot stilstand op de 3'-rand van het ribosoom-de zogenaamde 'toeprint'5,6,7.
In dit protocol, de ribosomal subeenheden, eIFs, tRNAs en IRES trans-acteren factoren (ITAFs) zijn gunstig bijgedragen door konijn Retikulocyt lysate (RRL). Een ander voordeel van dit protocol is het gebruik van een primer fluorescently-label en fluorescentie gel gebaseerde imager, in plaats van een radiolabeled primer. Dit elimineert de extra stappen, met inbegrip van radiolabeling van de primer, evenals de gel drogen en blootstelling aan een toenemende scherm. De fluorescerende bands van gasten worden geregistreerd in real time als de gel loopt, waardoor voor grotere resolutie. Afgetopte X-gebonden remmer van apoptosis eiwit (XIAP) IRES RNA wordt gebruikt als een voorbeeld hier, hoewel afgetopte mRNAs kan ook door deze techniek8worden geanalyseerd.
In tegenstelling tot westerse analyse, die de uiteindelijke uitvoer van het vertaalproces in cel lysates meet, is toeprinting een in vitro -benadering voor het meten van de vertaling initiatie complexvorming op een RNA. Deze reductionistische aanpak zorgt voor de zeer gedetailleerde studie van substraten of factoren die vertaling initiatie regelen (bv., afgetopte of un-afgetopte mRNA, IRES structuur, aan- of afwezigheid van poly-A-staart, bepaling van specifieke proteïne factoren, enz.). Vandaar, toeprinting kunnen worden gebruikt om te bestuderen van de verschillende wijzen van vertaling8 of de effecten van mRNA structuren, zoals IRESes, op eiwit synthese9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: RNA is zeer gevoelig voor afbraak door ribonucleasen (RNases). Standaard voorzorgsmaatregelen nemen om de RNA intact te houden. Handschoenen vaak worden gewijzigd. Gebruik gefilterd Pipetteer tips, nuclease-gratis plasticware en chemicaliën nuclease-vrij in alle stappen van het protocol. Gebruik nuclease-vrije of diethyl-pyrocarbonate (DEPC)-behandeld water voor alle oplossingen.
1. bereiding van de oplossingen
- Toeprinting buffer bereiden: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2.5 mM Mg(OAc)2, 5% (m/v) sacharose, 2 mM dithiothreitol (DTT) en 0,5 mM spermidine.
- DTT en spermidine opslaan in eenmalig gebruik aliquots bij-20 ° C tot het voorkomen van herhaalde bevriezen-ontdooien cycli.
Opmerking: DTT en spermidine moeten worden toegevoegd aan de buffer van de toeprinting onmiddellijk vóór gebruik. Een oplossing ontbreekt DTT en spermidine kan worden opgeslagen bij-20 ° C.
- DTT en spermidine opslaan in eenmalig gebruik aliquots bij-20 ° C tot het voorkomen van herhaalde bevriezen-ontdooien cycli.
- Bereid hoeveelheden van 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) en 91 mM adenosinetrifosfaat (ATP). Opslaan van de aliquots bij-20 ° C.
- Bereiden van 450 mL van 6% polyacrylamide - 7M ureum gel mix: 67,5 mL van 40% acrylamide:bis-acrylamide (19:1), 189 g ureum, 112,5 mL 5 x FSME (Tris/boraat/thylenediaminetetraacetic azijnzuuroplossing (NA2EDTA)) en 120 mL water. Los de ureum door opwarming van de aarde in een waterbad 37 ° C of op een hete plaat met roeren. Filtreer de oplossing (bijv., 0,2 micrometer nitrocellulose vacuüm filter).
Opmerking: De oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende ten minste één maand.
Let op: Monomeer acrylamide is een neurotoxine dat kan worden geabsorbeerd door de huid. Neem grote zorg om te voorkomen dat contact met de huid (dwz., het dragen van handschoenen, een laboratoriumjas, en oogbescherming). Polyacrylamide moet ook voorzichtig behandeld worden, als polymerisatie kan niet overgaan tot 100% voltooid. - Bereiden van formamide laden kleurstof: 95% formamide, 18 mM EDTA, 0,025% (m/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS), 0,025% (m/v) bromophenol blauw, 0,025% (m/v) xyleen cyanol. Winkel bij-20 ° C.
- Los 1 nmol primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' einde-aangeduid met IRDye 800) in 100 μl van water voor een werkende concentratie van 10 pmol/l. Bewaren bij-20 ° C in eenmalig gebruik aliquots (ongeveer 10 µL), beschermd tegen licht.
2. voorbereiding van mRNA
- Versterken van DNA sjablonen voor de synthese van mRNA door de polymerase-kettingreactie (PCR) van passende sjablonen (dwz., genomic DNA of de plasmide DNA, voorkomend). Gebruik een hifi-polymerase van DNA volgens de instructies van de fabrikant, met de volgende voorwaarden voor reactie (35 cycli): smelten, 98 ° C, 10 s; anneal, 53 ° C, 20 s; uitbreiden, 72 ° C, 30 s.
Opmerking: De voorwaartse primer (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) omvat de T7 promotor volgorde te voorzien van RNA transcriptie; de omgekeerde primer (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) omvat 51 thymine residuen een poly-A-staart voorzien de getranscribeerde RNA. Opmerking dat RNA kan ook in vitro transcriptie van plasmide DNA. - Gebruik een passende transcriptie kit voor in vitro transcriberen IRES-bevattende RNA of afgetopte RNA van de DNA-sjabloon. Volg de instructies van de fabrikant. Voorbereiding van het monster RNA in standaard 20 μL reactie delen. Behandelen van de nieuw-gesynthetiseerd RNA met 2 eenheden van RNase-vrije DNase gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Verdun de RNA DNase behandeld tot 110 µL met nuclease-gratis water toevoegen 110 µL zure fenol, vortex 5 s en centrifuge voor 3 min bij 20.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijderen van 100 µL van de waterfase aan een nieuwe 1,5 mL microfuge buis, voeg 10 µL van 3 M natriumacetaat en vortex 2 s. toevoegen, 3 volumes van 100% ethanol, vortex 5 s, en neerslag van het RNA bij-20 ° C's nachts.
- Centrifugeer bij > 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C en negeren de bovendrijvende substantie. Wassen van de pellet met 500 µL ijskoude ethanol van 70% (v/v) en herhaal het centrifugeren. Zo veel van het supernatans dat mogelijk gecombineerd en drogen van de pellet voor 5-10 min. oppassen niet te verjagen van de pellet.
- Resuspendeer de RNA in de juiste hoeveelheid water nuclease-vrije opleveren van een concentratie van de werken van 0.5 μg/μL. Dit kan worden opgeslagen bij-80 ° C of onmiddellijk gebruikt.
3. Toeprinting reactie
- Mix 15 μL van konijn Retikulocyt Lysate (RRL, niet nuclease-behandeld), 1 μL (40 eenheden) van RNase Inhibitor, 1 µL van 91 mM ATP (1.82 definitieve mM) en 1 μL van 85 mM GMP-PNP (1,7 mM definitieve) in een 1,5 mL microfuge buis. Incubeer bij 30 ° C gedurende 5 minuten.
Opmerking: De RRL moet aliquoted voor eenmalig gebruik om te voorkomen dat repetitieve bevriezen-ontdooien. Een kritische controle is een reactie die RRL, ontbreekt om te verhelderen van de natuurlijke pauzes van omgekeerde transcriptie als gevolg van de secundaire structuur van het RNA. Toeprinting buffer ter vervanging van RRL voor dit besturingselement toevoegen. - Voeg 0,5 µg (1 µL) van RNA toe en Incubeer bij 30 ° C gedurende 5 minuten.
- Voeg 22 µL van Toeprinting buffer en Incubeer bij 30 ° C gedurende 3 minuten.
- Voeg 0,5 µL (5 pmol) IRDye-geëtiketteerden primer en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
- Voeg 2 µL van 25 mM dNTPs (eindconcentratie: elke 1 mM), 2 µL van 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL van aviaire Myeloblastosis Virus Reverse-Transcriptase (AMV-RT) en 3,5 µL van Toeprinting buffer. Het eindvolume is 50 μl.
- Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 45 min.
- Voeg 200 µL nuclease-gratis water en direct uitpakken met 250 µL van 25:24:1 fenol: chloroform: Isoamylalcohol (pH ongeveer 8.0). Vortex 5 s en centrifuge op 20.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Verwijderen van de waterfase aan een nieuwe 1,5 mL microfuge buis, 3 volumes van 100% ethanol, vortex 5 s, toevoegen en neerslag bij-20 ° C's nachts.
- Centrifugeer bij > 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C en negeren de bovendrijvende substantie. Wassen van de DNA-pellet met 500 µL ijskoude ethanol van 70% (v/v). Centrifugeer bij > 20.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C. Aspirate zoveel supernatant mogelijk en lucht droog dat de pellet voor 5-10 min. oppassen niet te verjagen van de pellet.
- Los van de pellet in 6 μL van de nuclease-gratis water en voeg 3 μL van formamide laden kleurstof.
4. sequencing reacties
- De DNA-sjabloon van 2.1 en de primer met het IRDye-label uit stap 3.4 gebruiken voor standaard sequencing reacties, met behulp van dideoxynucleotides (ddNTPs) als keten afsluitweerstanden. Gebruik een geschikte DNA sequencing kit en volg de instructies van de fabrikant.
- Mix 6 μL van elke reactie sequencing met 3 μL van formamide laden kleurstof.
5. bereiding van de Sequencing van Gel en elektroforese
Opmerking: Dit protocol gebruikt een fluorescentie gel gebaseerde imager en een 21 x 23 cm x 0,2 mm gel, maar kan worden aangepast voor andere sequencers of gel-maten, indien nodig.
- Grondig schoon de 0,2 mm afstandhouders, alsmede de korte (23 × 25 cm) en lang (30 × 25 cm) glasplaten met 100% ethanol. Droge lucht.
- Mix-30 mL van 6% polyacrylamide - 7M ureum gel meng met 200 μl van 10% (m/v) ammonium persulfate (APS) en 20 μL van tetramethylethylenediamine (TEMED). Giet de gel, verzorgen om te voorkomen dat bubbels, en de ' haai ' gel kam invoegen. Laat de gel te polymeriseren gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Bouw de opstelling sequencing en vul de reservoirs met 1 x TBE.
- Vooraf een looptijd van 15 min op 1500 V totdat de optimale temperatuur van 55 ° C is bereikt.
- Verwarm de monster/laden kleurstof mix (vanaf stappen 3.9 of 4.2) tot 85 ° C voor 5 min. belasting 1 μL op de sequencing-gel.
- De gel op 1500 V voor 8 h uitvoeren. De machine zal het lezen van de bands in real-time.
- Demonteren van het apparaat, en gooi de acrylamide gel en lopende buffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij hebben eerder beschreven van het vermogen van de XIAP IRES GLB-onafhankelijke vertaling initiatie in vitro8,10te steunen. Toeprinting was de belangrijkste techniek te ondervragen de mechanistische details van de complexe XIAP IRES-initiatie. Een DNA-construct codering een mRNA met de XIAP IRES (Figuur 1A) werd in vitro transcribeerde en onderworpen aan de toeprinting analyse. De mutant varianten van de XIAP IRES mRNA die hier gebruikt zijn vertegenwoordigd in Figuur 1B. Omgekeerde transcriptie van het XIAP mRNA-ribosoom complex opgeleverd typische toeprints +17 tot + 19 nt stroomafwaarts van AUG (Figuur 1C, 1 lane). Dit is een indicatie van het ribosoom werving voor de start codon en de vorming van stabiele ribosoom-RNA complexen5,6,7. Ribosoom aanwerving was het sterk verminderde bij gebrek aan een poly-A-staart (Figuur 1C, lane 9), zoals eerder gemeld11. Vorming van de Toeprint was ook sterk verminderde in de afwezigheid van RRL en GMP-PNP (Figuur 1C, lane 8) en voor de start codon mutant (Figuur 1C, lane 7), waarin wordt bevestigd dat de waargenomen toeprint niet een structuur-geïnduceerde is pauze van omgekeerde transcriptie is maar, in feite, specifiek voor initiatie complexvorming. Toeprint formatie was voor de 5' polypyrimidine tract (PPT) mutant (Figuur 1C, lane 2) en de 3' PPT mutant (Figuur 1C, lane 4), die IRES structuur (Figuur 1B verstoren) verminderde8 ,10,12. Toeprint formatie was hersteld wanneer de PPT-mutanten werden getranscribeerd met een cap 5' (Figuur 1C, stegen 3 en 5). Vorming van de Toeprint werd ook hersteld voor de PPT dubbele mutant (Figuur 1C, lane 6), die herstelt van de secundaire structuur (Figuur 1B)10. Samen, blijkt deze gegevens dat er sprake is van cruciaal belang voor het initiëren van de vertaling van de niet-afgetopte RNA de secundaire structuur van de XIAP IRES en dat IRES structuur overbodig voor aanvang van de GLB-afhankelijke vertaling is. Om aan te tonen verder de specifieke eisen voor een 5' cap in de afwezigheid van een IRES structuur, werd menselijke β-globine (HBB) mRNA onderworpen aan toeprinting analyse (Figuur 1D). Geen toeprint werd waargenomen in de afwezigheid van een GLB 5' (Figuur 1D, lane 1) maar ribosomen met succes werden gerekruteerd om afgetopte HBB RNA (Figuur 1D, lane 2).
Figuur 1 . Toeprinting analyse bevestigt het belang van de secundaire structuur IRES voor de vorming van vertaling initiatie complexen op een afgetopte XIAP IRES RNA. (A) schematisch diagram van de DNA-construct codering van de XIAP IRES RNA gebruikt in deze analyse. De 3'-eind van de toeprinting primer is 42 bp stroomafwaarts van de start codon. (B) secundaire structuren van de WT XIAP IRES (linkerbovenhoek), de 5' PPT mutant (rechtsboven), de 3' PPT mutant (lager links) en de PPT dubbele mutant (rechtsonder). 'PPT Mutant' verwijst naar een punt Mutatie (UU aan AA) in een kritische polypyrimidine-darmkanaal, die de secundaire structuur van de IRES8,10,12 verstoort. De start codon is boxed; de puntmutaties worden aangeduid met een sterretje (*). (C) Toeprinting analyse van de mogelijkheid van XIAP IRES varianten om formulier vertaling initiatie complexen in RRL behandeld met GMP-PNP en ATP. De start codon AUG werd vervangen door AAC in de Start Codon Mutant. De omgekeerde primer gebruikt te maken van de in vitro transcriptie sjabloon ontbrak om RNA ontbreekt een poly-A-staart, gewoon een poly-T-stuk. (D) Inleiding complex ontstond op de afgetopte (maar niet de niet-afgetopte) 5' UTR van menselijke β-globine (HBB). In panelen (C) en (D), de meest linkse 4 rijstroken vertegenwoordigen sequencing reacties met de dideoxy-nucleotiden aangegeven boven elke baan; de volgorde wordt aangegeven links van elk paneel. FL, Full-length. Alle RNAs waren un-afgetopte tenzij anders aangegeven. Dit cijfer is gewijzigd van eerdere publicaties8,10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toeprinting is een krachtige techniek om direct het vermogen meten van een RNA van belang ter ondersteuning van de vorming van vertaling initiatie complexen onder zeer gecontroleerde omstandigheden. Dit protocol beschrijft een vereenvoudigde methode voor toeprinting zoogdieren RNAs. Konijn Retikulocyt lysate (RRL) wordt gebruikt als een handige bron van ribosomen, eIFs, initiator tRNA en IRES trans-handelend factoren (ITAFs). De experimentator biedt hun RNA van keuze en kan ook het aanvullen van de reactie van de toeprinting met specifieke cofactoren van hun keuze. Bijvoorbeeld, kunnen 48S versus 80S vertaling initiatie complexen op basis van de verdeling van de intensiteit van de fluorescentie van de toeprints7worden gedifferentieerd. De inleiding complexe waargenomen zal afhangen van het soort guanine nucleotide gebruikt. In het geval van de XIAP IRES hier besproken, GMP-PNP plus ATP stabiliseert 48S pre initiatie complexen, gekenmerkt door een verdeling van de toeprint + 17≥ + 18 > + 19. GMP-PNP is een nonhydrolyzable GTP analoge dat ribosomal subeenheid toetreden remt, aldus blokkeren vertaling initiatie in het 48S stap13. In tegenstelling, stabiliseert GTP, ATP, of ATP plus GTP 80S initiatie complexen, gekenmerkt door toeprint distributie +17 < + > 18 + 198.
De gebruiker zal moeten overwegen de soort RNA die zij te toeprint wensen. Als het doel is het bestuderen van een GLB-onafhankelijk mechanisme, zoals een IRES element, kan het RNA worden in vitro transcriptie met alle verkrijgbare kit. Echter kan alle zoogdieren RNA onderworpen worden aan deze toeprinting-methode, mits het heeft een 5' GLB structuur. Afgetopte mRNA moet worden gegenereerd met behulp van een passende kit. In ieder geval moeten de fabrikant protocollen worden gevolgd, zoals de voorbereiding van hoogwaardige RNA een belangrijke stap in de procedure vertegenwoordigt. Een ander punt van kritiek is dat de winning van fenol in stap 3.7 op of boven de neutrale pH plaatsvinden moet; als zure fenol wordt gebruikt in dit stadium, is de onlangs samengestelde cDNA zullen verloren gaan. Het is vermeldenswaard dat de concentratie van magnesium acetaat gebruikt in stap 3.5 invloed op de efficiëntie van omgekeerde transcriptie uitoefenen kan, en kan worden geoptimaliseerd voor elke mRNA.
Een paar essentiële controles zijn nodig om ervoor te zorgen de specificiteit van de toeprint. Eerst, moet geen robuuste toeprint worden waargenomen in de afwezigheid van RRL of nucleotide. Dit zorgt ervoor dat de waargenomen omgekeerde transcriptie pauze is te wijten aan een ribosoom-RNA-complex in plaats van een stabiele RNA secundaire structuur of aantal defect met de omgekeerde transcriptie reactie zelf. Ten tweede, geen toeprint moet worden waargenomen als de start codon is gemuteerd. Dit zorgt ervoor dat het ribosoom is een complex specifiek met de start codon van RNA gevormd en de rand 3' van het ribosoom in complex dat de gebruiker correct heeft geïdentificeerd met de start codon. Dit is vooral belangrijk voor IRES elementen, die misschien het ribosoom naar een alternatieve start codon14werven. Ook zou kunnen de toeprint worden geschaad in de afwezigheid van een poly-A-staart, zoals het geval voor de XIAP IRES8 was. Echter, sommige IRES elementen vormen toeprints bij gebrek aan een poly-A-staart, zoals de CrPV IRES10. Ten slotte, naast de goede toeprint, andere omgekeerde transcriptie pauzes kunnen worden waargenomen. Deze kunnen gewoon vertegenwoordigen pauzes als gevolg van stabiele secondaire structuren in het RNA, of ze kunnen te wijten zijn aan een verschijnsel genaamd "ribosoom springen", waarin het ribosoom dia's uit de start codon naar andere locaties op de RNA-15. Om te differentiëren tussen deze mogelijkheden, kan de toeprinting reactie plaatsvinden in aanwezigheid van cycloheximide8, die effectief het ribosoom op de start codon ummobiliseerd en alternatieve toeprints als gevolg van ribosoom springen moeten verlagen. Met name verschillende mRNAs zal hebben verschillende secondaire structuren, wat betekent dat het aantal en de intensiteit van transcriptie pauzes omgekeerde (dwz., achtergrond bands) zal ook variëren.
Een mogelijke beperking van deze techniek is dat het ribosoom werving voor een mRNA in vitromeet, maar de vorming van een complexe vertaling-initiatie betekent niet noodzakelijkerwijs dat de vertaling in vivo optreden zal. Toeprinting is daarom vooral krachtig wanneer deze gecombineerd met in vivo technieken voor het meten van de vertaling (bv., Polysoom profilering16) en de resulterende eiwitniveaus (bv., westelijke analyse).
Een meer recente techniek is "ribosoom profiling" (ook wel "ribosoom footprinting" genoemd), waarin hoge gegevensdoorvoer RNA sequencing wordt gebruikt voor het meten van de aanwezigheid van ribosomen op totale cellulaire mRNA. Dit is een krachtige techniek voor het meten van ribosoom werving op transcriptome-schaal. Inherent aan het ribosoom profiling is het gebruik van de reagentia, zoals cycloheximide, te stabiliseren ribosomen op mRNAs. Dit vertegenwoordigt mogelijk een nadeel zijn, aangezien een onevenredig aantal ribosomen kan niet-specifiek vastgelopen in de 5' niet-vertaalde regio (UTR), die kan worden geïnterpreteerd als niet-canonieke vertaling initiatie17. Cycloheximide is in toeprinting, niet een integraal onderdeel van de procedure, ontkenning van de mogelijkheid van dergelijke valse positieven. Bovendien, elke één mRNA kan bestudeerd worden in meer detail door toeprinting, aangezien er te veel controle experimenten en iteraties facile (bijvoorbeeld het effect van verschillende puntmutaties, of het ontbreken van een poly-A-staart, op het ribosoom werving testing). Het zou tijdrovende en kosten-verbiedend voor het uitvoeren van een gelijkwaardige matrix van controle experimenten in het kader van een ribosoom profilering experiment zijn. Toeprinting is dus een complementaire benadering van high-throughput sequencing gebaseerde technieken, en wordt nog steeds vaak gebruikt voor onderzoek gericht op het ophelderen van de mechanismen van vertaling verordening8,9,10, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflict-van-belang om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een natuurwetenschappen, Engineering Raad van Canada-Discovery onderzoeksbeurs (RGPIN-2017-05463) en de Stichting van Canada voor innovatie-John R. Evans leiders Fonds (35017), de Campus Alberta innoveert programma en de Alberta-ministerie van Economische ontwikkeling en handel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
