Summary
Toeprinting mira a misurare la capacità in vitro di trascritti di RNA per formare complessi di inizio di traduzione con i ribosomi in una varietà di condizioni. Questo protocollo descrive un metodo per toeprinting RNA dei mammiferi e può essere usato per studiare traduzione cap-dipendente sia IRES-driven.
Abstract
L'inizio della traduzione è la tappa limitante della sintesi proteica e rappresenta un punto chiave in cui le cellule regolano la loro produzione di proteine. Regolamento della sintesi proteica è la chiave di risposta allo stress cellulare, e disregolazione è centrale rispetto a molti Stati di malattia, come il cancro. Per esempio, anche se stress cellulare porta all'inibizione della traduzione globale di attenuante inizio PAC-dipendente, determinate proteine di risposta allo stress sono selettivamente tradotto in modo indipendente dal tappo. Elementi regolatori di RNA discreti, ad esempio siti di voce cellulare ribosoma interna (IRESes), consentono per la traduzione di questi specifici mRNA. Identificazione di tali mRNA e la caratterizzazione dei loro meccanismi di regolazione, sono stati un'area chiave nella biologia molecolare. Toeprinting è un metodo per lo studio della funzione e della struttura del RNA per quanto concerne l'inizio della traduzione. L'obiettivo di toeprinting è per valutare la capacità in vitro di trascritti di RNA per formare complessi stabili con i ribosomi in una varietà di condizioni, al fine di determinare quali sequenze, elementi strutturali o accessori fattori sono coinvolti in ribosoma associazione — un pre-cursore per l'inizio della traduzione efficiente. Accanto a altre tecniche, quali analisi occidentale e polisoma profilatura, toeprinting permette per una robusta caratterizzazione dei meccanismi per la regolazione dell'inizio di traduzione.
Introduction
Come traduzione consuma energia più cellulare, ha senso che la traduzione è strettamente regolato1. Al contrario, disregolazione della traduzione- e le conseguenti alterazioni nell'output di proteina-è spesso osservata negli Stati di risposta allo stress e malattia, ad esempio cancro1,2. Dei principali vantaggi del controllo traduzionale è la velocità con cui le cellule possono alterare la loro produzione di proteine al fine di rispondere a vari stimoli3. Regolamento di traduzione rappresenta quindi un meccanismo importante che può influenzare la sopravvivenza delle cellule e morte1,2,3. I passaggi di traduzione, l'iniziazione è la maggior parte altamente regolamentato e complesso3. Brevemente, il mRNA eucariotico più contenga un cappuccio di7G m di 5' è quasi sempre essenziale per la loro traduzione. Inizio PAC-dipendente richiede iniziazione eucariotica fattori eIF4E, eIF4A ed eIF4G (il complesso cap-riconoscimento) di interagire con l'estremità 5' del mRNA. 43S preinitiation ribosoma complesso, che contiene eIF2 associato iniziatore tRNA ed eIF3, viene reclutato all'estremità 5' del mRNA tramite un'interazione di eIF4G con eIF3. Il complesso di preinitiation è pensato per eseguire la scansione mRNA, aiutato da eIF4A (un RNA elicasi) fino a quando il codone di inizio (AUG) si trova. Successivamente si forma il complesso d'inizio 48S e tRNA viene consegnato al sito P del ribosoma. Infine, le subunità ribosomiale 60S e 40S sono unite per formare il complesso, d'inizio anni ' 80 seguito da traduzione allungamento1,3,4. Al contrario, siti di internal ribosome entry (IRESes) bypassare il requisito per un cappuccio 5' reclutando la subunità ribosomiale 40S direttamente per il codone di inizio3. Condizioni di stress fisiologico attenuano la traduzione di mRNA globale a causa di modifiche di fattori chiave di iniziazione eucariotica generale (eIFs). Tuttavia, meccanismi di iniziazione di traduzione non canonico consentono una traduzione selettiva di alcuni mRNA che codificano spesso proteine di risposta allo stress e disregolazione dell'inizio di traduzione non canonico è implicato negli Stati di malattia come il cancro 1 , 2. elementi regolatori discreti RNA, come IRESes cellulare, consentono per la traduzione di questi mRNAs2,3.
Un aspetto particolarmente interessante del controllo traduzionale è quello di comprendere i meccanismi della canonica contro traduzione non canonico di un dato mRNA. Toeprinting è una tecnica che permette lo studio meccanicistico dettagliato di inizio di traduzione di specifici RNA in vitro. L'obiettivo generale del toeprinting è quello di valutare la capacità di un RNA di interesse di nucleazione la formazione di un complesso con il ribosoma sotto una varietà di condizioni, l'inizio della traduzione al fine di determinare quali sequenze, elementi strutturali o dell'accessorio fattori sono necessari per l'inizio della traduzione efficiente. Per esempio, ribosoma assunzione potrebbe essere ostacolato in assenza di un cappuccio 5' ma stimolato dalla presenza di un IRES.
Il principio della tecnica è quello in vitro trascrivere un RNA di interesse, viene quindi incubato in presenza di estratti cellulari contenenti componenti di traduzione (o le componenti purificate) per consentire a trascrivono complessi di iniziazione per forma e per invertire il RNA con un primer specifico. Complessi RNA-ribosoma stabili causerà la trascrizione inversa di stallo all'estremità 3' del ribosoma, il cosiddetto 'toeprint'5,6,7.
In questo protocollo, le subunità ribosomali, eIFs, tRNAs e IRES trans-fattori agenti (ITAFs) sono convenientemente fornite da lysate del reticulocyte del coniglio (RRL). Un altro vantaggio di questo protocollo è l'utilizzo di un primer marcato fluorescente e imager di gel a base di fluorescenza, piuttosto che un primer radiomarcato. Questo Elimina passaggi aggiuntivi, tra cui radiolabeling il primer, come pure asciugare il gel ed esporla ad uno schermo d'intensificazione. Le bande fluorescenti sono registrate in tempo reale, durante l'esecuzione del gel, consentendo una maggiore risoluzione. Scoperchiata inibitore X-linked di apoptosi (XIAP) proteina IRES RNA viene utilizzato come esempio qui, anche se capped mRNA può essere analizzata anche da questa tecnica8.
A differenza di analisi occidentale, che misura l'output finale del processo di traduzione in lisati cellulari, toeprinting è un approccio in vitro per misurare la formazione complessa di iniziazione di traduzione su un RNA. Questo approccio riduzionista consente lo studio altamente dettagliato di substrati o fattori che regolano l'inizio della traduzione (ad es., ridotta o ONU-capped mRNA, IRES struttura, presenza o assenza di coda poli-A, fornitura di fattori proteici specifici, ecc.). Quindi, toeprinting può essere utilizzato per studiare le diverse modalità di traduzione8 o gli effetti delle strutture di mRNA, come IRESes, su proteina sintesi9,10.
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Protocol
Nota: il RNA è altamente suscettibile alla degradazione da ribonucleasi (RNasi). Prendere precauzioni standard per mantenere intatto il RNA. Cambiare spesso i guanti. Utilizzare puntali filtrata, plasticware nucleasi-libero e privo di nucleasi prodotti chimici in tutte le fasi del protocollo. Uso della nucleasi-free o pirocarbonato dietilico (DEPC)-acqua per tutte le soluzioni trattata.
1. preparazione delle soluzioni
- Preparare il tampone di Toeprinting: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5% (p/v) di saccarosio, spermidina ditiotreitolo (DTT) e 0,5 mM 2 mM.
- Memorizzare il DTT e spermidina in monouso aliquote a-20 ° C per evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
Nota: DTT e spermidina deve essere aggiunto al buffer toeprinting immediatamente prima dell'uso. Una soluzione manca DTT e spermidina possa essere conservata a-20 ° C.
- Memorizzare il DTT e spermidina in monouso aliquote a-20 ° C per evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
- Preparare aliquote di 85 mM 5'-imidodiphosphate di guanylyl (GMP-PNP) e 91 mM l'adenosina trifosfato (ATP). Conservare le aliquote a-20 ° C.
- Preparare 450 mL di miscela di gel di 6% poliacrilammide - 7m urea: 67,5 mL di 40% acrylamide:bis-acrilammide (19:1), 189 g di urea, 112,5 mL di 5x TBE (Tris/borato/thylenediaminetetraacetic acido (EDTA)) e 120 mL di acqua. Sciogliere l'urea dal riscaldamento a bagnomaria a 37 ° C, o su una piastra calda con agitazione. Filtrare la soluzione (ad es., 0,2 μm filtro vuoto di nitrocellulosa).
Nota: La soluzione può essere conservata a 4 ° C per almeno un mese.
Attenzione: L'acrilammide monomerica è una neurotossina che può essere assorbita attraverso la pelle. Fare molta attenzione per evitare il contatto con la pelle (cioè., indossare un camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi). Poliacrilammide anche deve essere maneggiato con cura, come polimerizzazione non può procedere al 100% di completamento. - Preparare la formammide tintura di caricamento: 95% formammide, 18 mM EDTA, 0.025% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS), blu di bromofenolo 0.025% (p/v) e 0.025% (p/v) xilene cianolo. Conservare a-20 ° C.
- Sciogliere 1 nmol di primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' fine-etichettati con 800 IRDye) in 100 μL di acqua per una concentrazione di lavoro di 10 pmol/μL. Conservare a-20 ° C in aliquote monouso (circa 10 µ l), al riparo dalla luce.
2. preparazione del mRNA
- Amplificare i modelli del DNA per la sintesi di mRNA da reazione a catena della polimerasi (PCR) da modelli appropriati (cioè., il DNA genomico o il DNA del plasmide, a seconda dei casi). Utilizzare un'ad alta fedeltà della polimerasi di DNA secondo le istruzioni del produttore, con le seguenti condizioni di reazione (35 cicli): sciogliere, 98 ° C, 10 s; temprare, 53 ° C, 20 s; estendere, 72 ° C, 30 s.
Nota: Il primer forward (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) incorpora la sequenza del promotore T7 per consentire per la trascrizione del RNA; il primer reverse (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) comprende 51 residui di timina per fornire una coda poli-A per il RNA trascritto. Si noti che il RNA può anche essere in vitro trascritto dal DNA del plasmide. - Utilizzare un kit di trascrizione appropriato per in vitro trascrivere IRES-contenente RNA o RNA ridotta dal modello del DNA. Seguire le istruzioni del produttore. Preparare il campione di RNA in volumi di reazione μL 20 standard. Trattare il nuova sintesi RNA con 2 unità di dnasi RNAsi-libera per 30 min a 37 ° C.
- Diluire il RNA dnasi-trattati a 110 µ l con acqua priva di nucleasi aggiungere 110 fenolo acido µ l, vortice 5 s e centrifugare per 3 min a 20.000 x g a temperatura ambiente. Rimuovere 100 µ l della fase acquosa ad un nuovo tubo microfuge 1,5 mL, aggiungere 10 µ l di acetato di sodio 3 M e vortex 2 s. Add, 3 volumi di etanolo al 100%, vortice 5 s e precipitare il RNA a-20 ° C durante la notte.
- Centrifugare a > 20.000 x g per 30 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Lavare la pallina con 500 µ l di etanolo al 70% (v/v) ghiacciata e ripetere la centrifugazione. Aspirare tanto del surnatante possibili e asciugare all'aria il pellet per 5-10 min. fare attenzione a non spostare la pallina.
- Risospendere il RNA nel volume appropriato di acqua priva di nucleasi per produrre una lavoro di concentrazione di 0,5 μg/μL. Questo può essere conservato a-80 ° C o utilizzato immediatamente.
3. Toeprinting reazione
- Mix 15 μL di coniglio del Reticulocyte Lysate (RRL, non nucleasi-trattati), 1 μL (40 unità) di RNAsi inibitore, 1 µ l di 91 mM ATP (1,82 mM finale) e 1 μL di 85mm GMP-PNP (1,7 mM finale) in una provetta da 1,5 mL microfuge. Incubare a 30 ° C per 5 min.
Nota: Il RRL devono essere titolati monouso evitare congelamento-scongelamento ripetitivo. Un controllo critico è una reazione carente RRL, per delucidare le pause naturali di trascrizione d'inversione a causa della struttura secondaria del RNA. Aggiungi toeprinting buffer per sostituire RRL per questo controllo. - Aggiungere 0,5 µ g (1 µ l) di RNA e incubare a 30 ° C per 5 min.
- Aggiungere 22 µ l di tampone di Toeprinting e incubare a 30 ° C per 3 min.
- Aggiungere 0,5 µ l (5 pmol) di IRDye-labeled primer e incubare in ghiaccio per 10 min.
- Aggiungere 2 µ l di 25 mM dNTPs (concentrazione finale: 1 mM ciascuno), 2 µ l di 100 mM Mg(OAc)2, 1 µ l di aviaria Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase (AMV-RT) e 3,5 µ l di tampone di Toeprinting. Il volume finale è 50 μL.
- Incubare la reazione a 30 ° C per 45 min.
- Aggiungere 200 µ l di acqua priva di nucleasi ed estrarre immediatamente con 250 µ l di 25:24:1 fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (pH circa 8.0). Vortice 5 s e centrifugare a 20.000 x g per 3 min a temperatura ambiente. Rimuovere la fase acquosa ad un nuovo tubo microfuge 1,5 mL, aggiungere 3 volumi di etanolo al 100%, vortice 5 s e precipitare a-20 ° C durante la notte.
- Centrifugare a > 20.000 x g per 30 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Lavare la pallina di DNA con 500 µ l di etanolo al 70% (v/v) ghiacciata. Centrifugare a > 20.000 x g per 15 min a 4 ° C. Aspirato tanto surnatante possibile e aria secca che il pellet per 5-10 minuti fare attenzione a non spostare la pallina.
- Dissolva la pallina in 6 μL di acqua esente da nucleasi e aggiungere 3 μL di formammide tintura di caricamento.
4. sequenza di reazioni
- Utilizzare il modello di DNA da 2.1 e il primer IRDye-etichettati dal passaggio 3.4 per reazioni di sequenziamento standard, utilizzando didesossiribonucleotidi (ddNTP) come terminatori di catena. Utilizzare un apposito kit di sequenziamento del DNA e seguire le istruzioni del produttore.
- Mix 6 μL di ogni reazione di sequenziamento con 3 μL di formammide tintura di caricamento.
5. preparazione del sequenziamento Gel e l'elettroforesi
Nota: Questo protocollo utilizza un imager di gel a base di fluorescenza e un 21 cm x 23 cm x gel di 0,2 mm, ma può essere adattato per altri sequencer o gel-dimensioni, se necessario.
- Pulire accuratamente i distanziali di 0,2 mm, nonché a breve (23 × 25 cm) e lastre di vetro a lungo (30 × 25 cm) con etanolo al 100%. Asciugare all'aria.
- Mix 30 mL di 6% gel di poliacrilammide - 7m urea mescolare con 200 μL di 10% (p/v) ammonio persolfato (APS) e 20 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED). Versare il gel, avendo cura di evitare le bolle e inserire il pettine di gel di dente di squalo. Lasciare che il gel di polimerizzare per 1 h a temperatura ambiente.
- Montare l'apparecchiatura di sequenziamento e riempire i serbatoi con 1 x TBE.
- Pre-corsa per 15 min a 1500 V fino a quando non viene raggiunta la temperatura ottima di 55 ° C.
- Riscaldare la miscela colorante di caricamento del campione (da passaggi 3.9 o 4.2) a 85 ° C per 5 min carico 1 μL in gel di sequenziamento.
- Esegua il gel a 1500 V per 8 h. La macchina leggerà le bande in tempo reale.
- Smontare l'apparecchio e smaltire il gel dell'acrilamide e il buffer in esecuzione.
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Representative Results
Precedentemente abbiamo descritto la capacità dell'IRES XIAP per sostenere l'inizio della traduzione cap-indipendente in vitro8,10. Toeprinting era la chiave tecnica per interrogare i dettagli meccanicistici del complesso d'inizio XIAP IRES. Un costrutto di DNA che codifica un mRNA contenente l'IRES XIAP (Figura 1A) era in vitro trascritto e sottoposti ad analisi di toeprinting. Le varianti mutante del mRNA XIAP IRES utilizzati qui sono rappresentate in Figura 1B. Trascrizione d'inversione del complesso mRNA-ribosoma XIAP fruttato tipico toeprints + 17 a + 19 nt a valle di agosto (Figura 1C, corsia 1). Questo è indicativo di reclutamento ribosoma per il codone di inizio e la formazione del ribosoma-RNA stabile complessi5,6,7. Reclutamento del ribosoma è stata fortemente alterata in assenza di una coda poli-A (Figura 1C, corsia 9), come precedentemente segnalati11. Toeprint formazione è stato anche fortemente alterato in assenza di RRL e GMP-PNP (Figura 1C, lane 8) e per il mutante di codone di inizio (Figura 1C, lane 7), confermando che il toeprint osservato non è indotta da una struttura pausa di trascrizione inversa ma è, infatti, specifico per la formazione di complessi di iniziazione. Formazione di Toeprint è stato alterato per il tratto (PPT) mutante polipirimidinico 5' (Figura 1C, lane 2) e il 3' PPT mutante (Figura 1C, lane 4), che disturbano la struttura IRES (Figura 1B)8 ,10,12. Formazione di Toeprint è stata ristabilita quando i mutanti PPT sono state trascritte con un cappuccio 5' (Figura 1C, vicoli 3 e 5). Toeprint formazione fu anche restaurato per PPT doppio mutante (Figura 1C, corsia 6), che ripristina la struttura secondaria (Figura 1B)10. Insieme, questi dati indicano che la struttura secondaria dell'IRES XIAP è critica per l'inizio della traduzione di ONU-capped RNA e che struttura IRES è superflua per l'inizio della traduzione cap-dipendente. Per illustrare ulteriormente il requisito specifico per un cappuccio 5' in assenza di una struttura di IRES, β-globina umana (HBB) mRNA è stato sottoposto ad analisi toeprinting (Figura 1D). Nessun toeprint è stato osservato in assenza di un cappuccio 5' (Figura 1D, corsia 1) ma i ribosomi con successo sono stati reclutati per capped HBB RNA (Figura 1D, corsia 2).
Figura 1 . Toeprinting analisi conferma l'importanza della struttura secondaria di IRES per la formazione di complessi di inizio di traduzione su un RNA di IRES XIAP scoperchiata. (A) diagramma schematico del costrutto di DNA che codifica il RNA di IRES XIAP usato in questa analisi. L'estremità 3' del primer toeprinting è 42 bp a valle del codone di inizio. (B) strutture secondarie di WT XIAP IRES (in alto a sinistra), il 5' PPT mutante (alto a destra), il mutante 3' PPT (in basso a sinistra) e PPT doppio mutante (basso a destra). 'PPT mutante' si riferisce a una mutazione di punto (UU AA) in un tratto polipirimidinico critiche, che interrompe la struttura secondaria dell'IRES8,10,12. Il codone di inizio è boxed; le mutazioni puntiformi sono contrassegnate con un asterisco (*). (C) Toeprinting analisi della capacità delle varianti di XIAP IRES per formare complessi di inizio traduzione in RRL trattata con GMP-PNP e ATP. L'AUG del codone di inizio è stato sostituito con AAC nel avviare codone mutante. Per rendere RNA manca una coda poli-A, il reverse primer utilizzato per rendere il modello di trascrizione in vitro mancava semplicemente un tratto di poli-T. (D) iniziazione complesso fu creato il ridotta (ma non l'ONU-capped) 5' UTR della β-globina umana (HBB). Nei pannelli (C) e (D), la più a sinistra 4 corsie rappresentano reazioni di sequenziamento con i nucleotidi dideossi indicati sopra ogni corsia; la sequenza è indicata a sinistra di ogni pannello. FL, full-length. Tutti gli RNA sono stati ONU-capped se non diversamente specificato. Questa figura è stata modificata da precedenti pubblicazioni8,10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Toeprinting è una tecnica potente per misurare direttamente la capacità di un RNA di interesse per sostenere la formazione dei complessi di inizio traduzione in circostanze altamente controllate. Questo protocollo descrive una tecnica semplificata per toeprinting mammiferi RNAs. Reticolociti di coniglio lisato (RRL) viene utilizzato come una comoda fonte di ribosomi, eIFs, iniziatore tRNA e IRES trans-in qualità di fattori (ITAFs). Lo sperimentatore fornisce loro RNA di scelta e può anche completare la reazione di toeprinting con cofattori specifici di loro scelta. Per esempio, 48S contro 80S complessi di inizio traduzione possono essere differenziati basato sulla distribuzione di intensità di fluorescenza del toeprints7. Il complesso d'inizio osservato dipenderà il tipo di nucleotide guanina utilizzato. Nel caso dell'IRES XIAP discusso qui, GMP-PNP plus ATP stabilizza complessi di pre-iniziazione 48S, caratterizzate da una distribuzione di toeprint + 17≥ + 18 > + 19. GMP-PNP è un nonhydrolyzable GTP analogico che inibisce la subunità ribosomiche unentesi, bloccando così l'inizio della traduzione presso la 48S passaggio13. Al contrario, GTP, ATP, o ATP e GTP stabilizza complessi di inizio anni ' 80, caratterizzate da toeprint distribuzione + 17 + 19 + < 18 >8.
L'utente dovrà considerare il tipo di RNA che desiderano toeprint. Se l'obiettivo è quello di studiare un meccanismo indipendente dal tappo, ad esempio un elemento di IRES, il RNA può essere in vitro trascritto con qualsiasi kit disponibile in commercio. Tuttavia, qualsiasi mammifero RNA possa essere sottoposti a questo metodo di toeprinting, condizione che ha una struttura cap 5'. Con un massimo di mRNA deve essere generato tramite un apposito kit. In ogni caso, protocolli del produttore dovrebbero essere seguiti da vicino, come la preparazione di RNA di alta qualità rappresenta un passo fondamentale nella procedura. Un altro punto critico è che l'estrazione del fenolo nel passaggio 3.7 deve essere effettuato pari o superiore a pH neutro; Se acido fenolo è utilizzato in questa fase, il cDNA recentemente sintetizzato andranno perso. Vale la pena notare che la concentrazione di acetato di magnesio utilizzato nel passaggio 3.5 può influenzare l'efficienza di trascrizione inversa e potrebbe essere necessario essere ottimizzata per ogni mRNA.
Alcuni controlli chiavi sono necessari per garantire la specificità della toeprint. In primo luogo, nessun toeprint robusto dovrebbe essere osservato in assenza di RRL o dei nucleotidi. Questo assicura che la pausa di trascrizione inversa osservata è dovuta ad un complesso ribosoma-RNA anziché una struttura secondaria di RNA stabile o qualche difetto con la reazione di retrotrascrizione si. In secondo luogo, nessun toeprint dovrebbe essere osservata se il codone di inizio è mutato. Questo assicura che il ribosoma ha formato un complesso specificamente con il codone di inizio del RNA e che l'utente abbia correttamente identificato il bordo 3' del ribosoma in complesso con il codone di inizio. Ciò è particolarmente importante per gli elementi di IRES, che potrebbero assumere il ribosoma per un codone di inizio alternativi14. Allo stesso modo, il toeprint potrebbe essere alterato in assenza di una coda di poly-A, come è avvenuto per l' IRES XIAP8. Tuttavia, alcuni elementi di IRES formano toeprints in assenza di una coda di poly-A, ad esempio l' IRES CrPV10. Infine, oltre il toeprint corretto, potrebbero essere osservate altre pause di trascrizione inversa. Questi possono rappresentare semplicemente pause a causa di strutture secondarie stabili nel RNA, o potrebbero essere a causa di un fenomeno soprannominato "ribosoma jumping", in cui il ribosoma scivola dal codone di inizio ad altre posizioni il RNA15. Per distinguere tra queste possibilità, la reazione di toeprinting può essere eseguita in presenza di cicloesimmide8, che efficacemente immobilizza il ribosoma al codone di inizio e dovrebbe ridurre alternativo toeprints a causa del ribosoma saltando. In particolare, diversi mRNAs avrà diverse strutture secondarie, che significa che il numero e l'intensità di invertire trascrizione pause (cioè., bande di base) variano anche.
Una possibile limitazione di questa tecnica è che misura il reclutamento ribosoma per un mRNA in vitro, ma la formazione di un complesso d'inizio di traduzione non significa necessariamente che la conversione viene eseguita in vivo. Pertanto, è particolarmente potente quando combinato con tecniche in vivo per misurare traduzione toeprinting (ad es., polisoma profilatura16) e i livelli di proteina risultante (ad es., analisi occidentale).
Una tecnica più recente è "ribosoma profilazione" (chiamato anche "footprinting ribosoma"), in cui il sequenziamento di RNA ad alte prestazioni viene utilizzato per misurare la presenza di ribosomi su mRNA cellulare totale. Si tratta di una tecnica potente per misurare reclutamento ribosoma sulla scala del trascrittoma. Inerente alla profilatura ribosoma è l'uso di reagenti, come cicloesimmide, per stabilizzare i ribosomi su mRNA. Questo potenzialmente rappresenta uno svantaggio, come un numero sproporzionato di ribosomi può essere bloccato non specifico nella regione 5' non tradotta (UTR), che può essere interpretata come traduzione non canonico l'inizio17. In toeprinting, cicloesimmide non è parte integrante della procedura, negando la possibilità di falsi positivi. Inoltre, qualsiasi singolo mRNA possa essere studiati più in dettaglio di toeprinting, come è facile per condurre molti esperimenti di controllo e iterazioni (per esempio, prova l'effetto delle diverse mutazioni puntiformi, o l'assenza di una coda di poly-A, il reclutamento del ribosoma). Sarebbe lungo e dispendioso per svolgere una matrice equivalente di esperimenti di controllo nel contesto di un ribosoma esperimento di profilatura. Toeprinting è quindi un approccio complementare alle tecniche di base di sequenziamento ad alta velocità ed è ancora comunemente usato per studi volti a chiarire i meccanismi di traduzione regolamento8,9,10, 18.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interesse a divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da un scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), la Fondazione canadese per fondo di innovazione-John R. Evans leader (35017), il programma di Innova Alberta Campus e il Ministero di Alberta di Sviluppo economico e commercio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
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