Summary
Vitro becerisini ölçmek için Toeprinting amaçları için formu çeviri başlatma kompleksleri ile ribozomlara koşulları çeşitli altında RNA transkripsiyonu. Bu iletişim kuralı toeprinting memeli RNA için bir yöntem açıklanır ve kap-bağımlı ve IRES uygulamalı çeviri çalışma için kullanılabilir.
Abstract
Çeviri başlatma hızı sınırlaması adım protein sentezi ve hangi hücrelerin protein çıktılarını düzenleyen önemli bir nokta temsil eder. Düzenleme protein sentezi, hücresel stres tepkisi anahtarıdır ve bozukluk birçok hastalık durumlarında, kanser gibi merkezi bir noktada bulunuyor. Örneğin, hücresel stres küresel çeviri inhibisyonu inceltiyorum kap bağımlı başlatma tarafından leads rağmen bazı stres tepkisi proteinler seçerek bir kap bağımsız şekilde çevrilir. Hücresel iç ribozom giriş siteleri (IRESes), gibi sağduyulu RNA düzenleyici elemanlarının bu belirli mRNA'ların çeviri için izin. Böyle mRNA'ların tanımlaması ve düzenleyici mekanizmaları, karakterizasyonu Moleküler biyolojide önemli bir alan olmuştur. Gibi çeviri başlatma için ilgilidir Toeprinting, RNA yapısı ve işlevi için bir yöntemdir. Toeprinting vitro yeteneği değerlendirmek için hangi dizileri, yapı elemanlarının veya aksesuar faktörler ribozom içinde söz konusu belirlemek için koşullar, çeşitli altında ribozomlar ile kararlı kompleksler oluşturmak için RNA transkripsiyonu hedeftir bağlama — için verimli çeviri başlatma öncesi bir imleç. Batı analiz ve polysome profil oluşturma, gibi diğer teknikleri ile birlikte çeviri başlatma düzenlenmesi için mekanizmalar sağlam bir karakterizasyonu için toeprinting sağlar.
Introduction
Çevirisi en hücresel enerji tüketir gibi bu çeviri sıkıca düzenlenmiş1olduğunu mantıklı. Diğer taraftan, bozukluk çeviri-protein çıktı bunun sonucunda değişiklik ve -genellikle kanser1,2gibi stres tepkisi ve hastalık durumları görülmektedir. Translasyonel kontrol önemli bir avantajı olan çeşitli uyaranlara3' e cevap için protein çıktılarını hücreleri değiştirebilirsiniz hızıdır. Çeviri yönetmelik böylece hücre yaşam ve ölüm1,2,3etkileyebilecek önemli bir mekanizma temsil eder. Çeviri adımlardan inisiyasyon en son derece düzenli ve karmaşık3' tür. Kısaca, en ökaryotik mRNA'ların hemen hemen her zaman onların çeviri için gerekli olan bir 5' m7G başlık içerir. Cap-bağımlı başlatma gerektirir ökaryotik başlama faktörleri eIF4E, Eıf4a ve eIF4G (cap-tanıma kompleksi 5' uç mRNA ile etkileşim kurmak için). EIF2 bağlı Başlatıcı içeren 43S preinitiation ribozom karmaşık, tRNA ve eIF3, 5' sonuna kadar mRNA yolu ile eIF4G eIF3 ile bir etkileşim işe. Karmaşık preinitiation Eıf4a tarafından destekli mRNA, tarama düşünülmektedir (RNA helikaz) başlama kodonu (AUG) bulunana kadar. Karmaşık 48S başlatma sonradan oluşmuş ve tRNA ribozom P-site teslim edilir. Son olarak, 60'lar ve 40'lı ribozom alt birimleri karmaşık, 80S başlatma oluşturmak için çeviri uzama1,3,4tarafından takip Birleşmiş. Buna ek olarak, iç ribozom giriş siteleri (IRESes) 40'lı ribozomal altbirimde başlama kodonu3için doğrudan işe alma tarafından 5' başlık gereksinimini devre dışı. Fizyolojik stres koşulları küresel mRNA çeviri değişikliklerini anahtar genel ökaryotik başlama faktörleri (mantolama) nedeniyle azalt. Ancak, kanonik olmayan çeviri başlatma mekanizmaları genellikle stres tepkisi protein kodlamak belirli mRNA seçici çeviri için izin ve kanonik olmayan çeviri inisiyasyon bozukluk gibi kanser hastalığı Devletleri'nde karıştığı 1 , 2. gizli RNA gibi hücresel IRESes, düzenleyici elemanlarının izin böyle mRNA'ların2,3çeviri için.
Bir özellikle ilginç yönü translasyonel kontrol mekanizmaları karşı verilen bir mRNA kanonik olmayan çeviri kurallı anlamaktır. Toeprinting belirli RNA'ların içinde vitroinisiyasyon çeviri ayrıntılı mekanik çalışma sağlayan bir tekniktir. Toeprinting genel amacı bir RNA ilgi hangi dizileri, yapı elemanlarının veya aksesuar belirlemek için bir çeviri başlatma koşulları, çeşitli altında ribozom ile karmaşık oluşumu nucleate yeteneği değerlendirmek etmektir verimli çeviri kabul töreni için gerekli faktörlerdir. Örneğin, ribozom işe alım 5' başlık yokluğunda engel ama bir IRES varlığı ile uyarılmış.
Vitro için teknik bir ilkesidir ilgi bir RNA uyarlamak başlatma kompleksleri forma ve tersine çevirmek için uyarlamak izin vermek için çeviri bileşenleri (veya saf bileşenleri) içeren hücre özleri huzurunda kuluçkaya RNA ile belirli bir astar. İstikrarlı RNA-ribozom kompleksleri 3' kenarında ribozom sözde 'toeprint'5,6,7durak ters transkripsiyon neden olur.
Bu iletişim kuralı, ribozomal alt birimleri, mantolama, tRNA ve IRES trans-oyunculuk faktörler (ITAFs) uygun tarafından tavşan Retikülosit lysate (RRL) katkıda bulunmuştur. Bu iletişim kuralı bir diğer avantajı radiolabeled astar yerine fluorescently etiketli bir astar ve floresan jel tabanlı Imager kullanmaktır. Bu astar, radiolabeling gibi jel kurutma ve kuvvetlenmesine ekranına açığa dahil olmak üzere ek adımlar ortadan kaldırır. Floresan bantları gerçek zamanlı olarak, daha fazla çözümleme için izin jel ishal olarak kaydedilir. Her ne kadar çok Millî olan mRNA'ların da bu tekniği8tarafından analiz edilebilir kapağını X'e inhibitörü Apoptozis protein (XIAP) IRES RNA'ın burada, bir örnek kullanılır.
Hücre lysates çeviri sürecinde son çıktı ölçer, Batı analiz farklı olarak, toeprinting bir RNA çeviri başlatma karmaşık oluşumu ölçmek için vitro yaklaşımıdır. Bu indirgemeci yaklaşımın yüzeylerde veya çeviri başlatma düzenleyen faktörler son derece ayrıntılı bir çalışma için izin verir (örn., kaplama veya un kepli mRNA, IRES yapısı, varlığı ya da yokluğu Poli-A kuyruk, belirli protein faktörler, hükmü vs.). Bu nedenle, toeprinting çeviri8 farklı mod veya protein sentezi9,10IRESes gibi bir mRNA yapıları etkileri eğitimi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: RNA ribonükleazlar (RNases) tarafından bozulması için son derece açıktır. RNA sağlam tutmak için standart önlemler almak. Eldiven sık sık değiştirin. Filtre uygulanmış pipet ipuçları, nükleaz ücretsiz plasticware ve kimyasallar nükleaz ücretsiz iletişim kuralının tüm adımlarını kullanın. Kullanım nükleaz içermeyen veya Dietil pyrocarbonate (DEPC)-tedavi su tüm çözümleri.
1. hazırlanması çözümleri
- Toeprinting arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2.5 mM Mg(OAc)2, %5 (w/v) Sükroz, 2 mM dithiothreitol (DTT) ve 0,5 mM spermidine.
- DTT ve spermidine tek kullanımlık aliquots tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek için-20 ° C'de depolayın.
Not: Kullanmadan önce hemen toeprinting arabelleğine DTT ve spermidine eklenmelidir. DTT ve spermidine yoksun bir çözümü-20 ° C'de depolanan
- DTT ve spermidine tek kullanımlık aliquots tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek için-20 ° C'de depolayın.
- Aliquots 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) ve 91 mM adenozin trifosfat (ATP) hazırlayın. Aliquots-20 ° C'de depolayın
- 450 mL % 6 polyacrylamide - 7 M üre jel karışımı hazırlayın: 67,5 mL % 40 acrylamide:bis-Akrilamid (19:1), üre, 112.5 mL 5 x TBE (Tris/Bor/thylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) ve 120 mL su 189 g. Üre 37 ° C su banyosu ya da sıcak bir tabak karıştırma ile ısınma tarafından çözülür. Çözüm filtre (örn., 0,2 mikron nitroselüloz vakum filtre).
Not: Çözüm 4 ° C'de en az bir ay depolanabilir.
Dikkat: Monomeric Akrilamid deri yoluyla absorbe edilebilir bir nörotoksin var. Cilt teması önlemek için büyük özen (i.e., eldiven, önlük, giyim ve göz koruma). Polimerizasyon için % 100 tamamlanma devam edemeyebilirsiniz gibi polyacrylamide da bakım ile ele alınmalıdır. - Formamide boya yükleme hazırlamak: % 95'i formamide, 18 mM EDTA, % 0,025 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), % 0,025 (w/v) bromophenol mavi, (w/v) % 0,025 Ksilen cyanol. -20 ° C'de mağaza
- 10 pmol/μL bir çalışma konsantrasyonu su 100 μL içine astar (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' IRDye 800 ile son etiketli) 1 nmol geçiyoruz. Işıktan korunan-20 ° c tek kullanımlık aliquots (yaklaşık 10 µL), içinde saklayın.
2. mRNA hazırlanması
- Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) uygun şablonları tarafından mRNA sentezi için DNA şablonları yükseltmek (i.e., genomik DNA veya uygun olarak plazmid DNA). Bir yüksek-sadakat DNA polimeraz üreticinin talimatlarına göre aşağıdaki reaksiyon koşulları (35 döngüleri) ile kullanın: eritmek, 98 ° C, 10 s; TAV, 53 ° C, 20 s; genişletmek, 72 ° C, 30 s.
Not: İleri astar (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) RNA transkripsiyonu için izin vermek için T7 organizatörü sıra içerir; ters astar (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) Poli-A kuyruk için transkripsiyonu RNA sağlamak için 51 timin kalıntıları içerir. Vitro plazmid DNA transkripsiyonu RNA da olabileceğine dikkat edin. - Kullanım bir uygun transkripsiyon kiti vitro için uyarlamak IRES içeren RNA veya DNA şablonundaki kepli RNA. Üreticinin yönergeleri izleyin. RNA örnek standart 20 μL tepki cilt olarak hazırlayın. 37 ° C'de 2 adet RNase free Dnaz 30 dk ile yeni sentezlenmiş RNA tedavi
- Dnaz tedavi RNA 110 seyreltik µL nükleaz ücretsiz su ile 20.000 x g oda sıcaklığında de 110 µL asit fenol, girdap 5 s ve 3 dk santrifüj ekleyin. Sulu faz için yeni bir 1.5 mL microfuge tüp 100 µL kaldırmak, 3 M sodyum asetat ve girdap 2 s. Ekle, % 100 etanol, girdap 5 s, 3 Cilt 10 µL eklemek ve RNA-20 ° C'de gecede çökelti.
- Santrifüj kapasitesi > 20.000 x g 4 ° C ve atma süpernatant 30 dk için. Pelet 500 µL buz gibi % 70 (v/v) etanol ile yıkayın ve aralıklarla tekrarlayın. Büyük bir kısmını süpernatant mümkün olduğunca Aspire edin ve pelet pelet çıkarmak değil dikkatli olmak da 5-10 dakika kuruması.
- RNA nükleaz ücretsiz su bir çalışma konsantrasyonu 0.5 μg/μL vermeye uygun hacmi resuspend. Bu-80 ° C'de depolanan veya hemen kullanılabilir.
3. Toeprinting tepki
- Mix 15 μL, tavşan Retikülosit Lysate (RRL, nükleaz tedavi), RNase inhibitörü, 1 µL 91 mm ATP (1.82 mM son) ve 85 mm GMP-PNP (nihai 1.7 mM) 1.5 mL microfuge tüp içinde 1 μL 1 μL (40 adet). 30 ° c 5 min için kuluçkaya.
Not: RRL tekrarlayan donma-çözülme önlemek Tek Kişilik Kullanım için bölünmemeli olmalıdır. Kritik kontrol RRL, RNA'ın ikincil yapı nedeniyle ters transkripsiyon doğal duraklar aydınlatmak için eksik bir tepkidir. Bu denetim için RRL eski yerine koymak için toeprinting tampon ekleyin. - RNA'ın 0,5 µg (1 µL) ekleyin ve 5 min için 30 ° C'de kuluçkaya.
- Toeprinting arabellek 22 µL ekleyin ve 3 dakika 30 ° C'de kuluçkaya.
- IRDye etiketli astar 0.5 µL (5 pmol) ekleyin ve 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
- 25 mM dNTPs 2 µL ekleyin (son konsantrasyonu: 1 mM), 2 µL 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL kuş Myeloblastosis virüs ters transkriptaz (AMV-RT), ve Toeprinting arabelleği 3,5 µL. Son 50 μL birimdir.
- Tepki için 45 dk 30 ° C'de kuluçkaya.
- 200 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin ve hemen 25:24:1 fenol: kloroform: izoamil alkol (pH yaklaşık 8.0) 250 µL ile ayıklayın. Girdap 5 s ve oda sıcaklığında 3 min için 20.000 x g, santrifüj. Yeni 1.5 mL microfuge Tube sulu faz kaldırmak, % 100 etanol, girdap 5 s, 3 cilt eklemek ve -20 ° C'de gecede çökelti.
- Santrifüj kapasitesi > 20.000 x g 4 ° C ve atma süpernatant 30 dk için. DNA Pelet 500 µL buz gibi % 70 (v/v) etanol ile yıkayın. Santrifüj kapasitesi > 4 ° C'de 15 dakika 20.000 x g Aspire edin kadar süpernatant mümkün ve hava kuru 5-10 dakika süreyle pelet pelet çıkarmak değil dikkatli olun.
- Pelet 6 μL nükleaz ücretsiz su içinde dağıtılması ve boya yükleme formamide 3 μL ekleyin.
4. sıralama tepkiler
- 2.1 DNA şablondan ve adım 3.4 IRDye etiketli astar standart sıralama reaksiyonlar, dideoxynucleotides (ddNTPs) zincir sonlandırıcılar kullanma için kullanın. Uygun bir DNA sıralama setini kullanın ve üreticinin yönergeleri izleyin.
- Formamide boya yükleniyor 3 μL ile Mix 6 μL her sıralama tepki.
5. hazırlık, jel ve Elektroforez sıralama
Not: Bu protokol bir floresan Imager jel tabanlı ve bir 21 cm x 23 cm x 0.2 mm jel kullanır, ancak diğer sıralayıcılar veya jel-boyutları, gerekirse adapte edilebilir.
- İyice 0.2 mm boşluk ekleyiciler yanı sıra kısa (23 × 25 cm) ve uzun (30 × 25 cm) cam plakanın % 100 etanol ile temizleyin. Hava kuru.
- % 6 polyacrylamide - 7M üre jel karışımı 30 mL % 10 (w/v) amonyum persülfat (APS) 200 μL ile karıştırın ve tetramethylethylenediamine (TEMED) 20 μL. Kabarcıklar, önlemek için dikkat çekici jel dökmek ve 'köpekbalığı-dişli' jel tarak ekleyin. Oda sıcaklığında 1 h için polimerize jel izin.
- Sıralama cihazı montajı ve rezervuarlar 1 ile doldurun x TBE.
- 55 ° C en uygun sıcaklık elde kadar 15dk için 1500 V'de önceden çalıştırın.
- (Kimden adım 3.9 veya 4.2) örnek/yükleme boya karıştırmak için sıralama jel üzerine 5 dk. yük 1 μL için 85 ° C ısı.
- Jel 1500 V 8 h için çalıştırın. Makine gerçek zamanlı bantlarında okuyacaktır.
- Aparatı sökmeye ve Akrilamid jel ve çalışan tampon atmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
XIAP IRES kap bağımsız çeviri başlatma vitro8,10destek yeteneği daha önce anlatmıştık. Toeprinting mekanik ayrıntıları karmaşık XIAP IRES inisiyasyon sorguya çekmek için anahtar yöntem oldu. XIAP IRES (şekil 1A) içeren bir mRNA kodlama bir DNA yapısı transkripsiyonu ve toeprinting analize tabi vitro yapıldı. Burada kullanılan XIAP IRES mRNA mutant türevleri şekil 1' deBtemsil edilir. XIAP mRNA-ribozom kompleks ters transkripsiyon vermiştir tipik toeprints +17 +19 için nt aşağı Ağustos (şekil 1C, lane 1). Ribozom işe başlama kodonu ve istikrarlı ribozom RNA kompleksi5,6,7oluşumu göstergesi bu. Ribozom işe alım güçlü daha önce bildirilen11(şekil 1C, lane 9), Poli-A kuyruk yokluğunda Engelli. Toeprint oluşumu da güçlü gözlenen toeprint yapı kaynaklı değil teyit yokluğunda RRL ve GMP-PNP (şekil 1C, lane 8) ve (şekil 1C, lane 7), başlangıç kodon mutant için Engelli Duraklat ters transkripsiyon ama, aslında, inisiyasyon karmaşık oluşumuna özgüdür. Toeprint oluşumu 5' polypyrimidine yolu (PPT) mutant (şekil 1C, lane 2) ve 3' PPT mutant (şekil 1C, lane 4), için IRES yapısı (şekil 1B) engel Engelli8 ,10,12. PPT mutantlar bir 5' başlık ile (şekil 1C, yolları 3 ve 5) transkripsiyonu ne zaman Toeprint oluşumu geri yüklendi. Toeprint oluşumu da ikincil yapı (şekil 1B)10geri PPT Çift Kişilik mutant için (Resim 1C, lane 6), geri yüklendi. Birlikte, bu veri XIAP IRES ikincil yapı un kepli RNA çeviri kabul töreni için kritik olduğunu ve IRES yapısı kap bağımlı çeviri kabul töreni için gereksiz olduğunu gösterir. 5' başlık yokluğunda belirli gereksinimini bir IRES yapısının daha fazla göstermek için insan β-globin (HBB) mRNA toeprinting analizi (şekil 1D) maruz bırakıldı. Hiçbir toeprint bir 5' başlık (şekil 1D, lane 1) yokluğunda gözlendi ama ribozomlara başarıyla kepli HBB RNA (şekil 1D, lane 2) için işe.
Resim 1 . Toeprinting analiz IRES ikincil yapı çeviri başlatma kompleksleri kapağını XIAP IRES RNA üzerinde oluşumu için önemini teyit etmektedir. (A) XIAP IRES RNA bu analizde kullanılan kodlama DNA yapısı şematik diyagramı. 3' toeprinting astar 42 bitti kan basıncı aşağı başlama kodonu ile. (B) ikincil yapılar WT XIAP IRES (sol üst), 5' PPT mutant (sağ üst), 3' PPT mutant (sol alt) ve PPT Çift Kişilik mutant (sağ alt). 'PPT Mutant' IRES8,10,12ikincil yapısını bozan bir kritik polypyrimidine yolu içinde bir nokta mutasyon (UU AA için) anlamına gelir. Başlama kodonu kutulu; nokta mutasyonlar yıldız ile (*) gösterilir. (C) Toeprinting analiz formu çeviri başlatma kompleksleri RRL XIAP IRES versiyonlarının yetenek GMP PNP ve ATP ile tedavi. Başlangıç kodon Ağustos başlamak kodon Mutant AAC ile değiştirildi. Poli-A kuyruk eksik RNA yapmak, vitro transkripsiyon şablon yapmak için kullanılan ters astar sadece Poli-T yolu yoktu. (D) başlatma karmaşık kaplama (ama değil un kaplama) 5' üzerinde UTR, insan β-globin (HBB) kuruldu. Panelleri (C) ve (D), en soldaki 4 şeritli her lane; belirtilen dideoxy nükleotit ile sıralama reaksiyonlar temsil sıra her paneli solunda belirtilir. FL, tam uzunlukta. Tüm RNA'ların aksi belirtilmedikçe un kaplama. Bu rakam önceki yayınları8,10değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toeprinting doğrudan ilgi bir RNA çeviri başlatma kompleksleri son derece kontrollü koşullar altında oluşumunu desteklemek yeteneği ölçmek için güçlü bir tekniktir. Bu iletişim kuralı toeprinting için basitleştirilmiş bir teknik anlatılmaktadır memeli RNA'ların. Tavşan Retikülosit lysate (RRL) ribozomlar, mantolama, başlatıcı uygun kaynağı olarak kullanılan tRNA ve IRES trans-faktörler (ITAFs) hareket. Deneyci kendi RNA seçim sağlar ve ayrıca kendi seçtiğiniz belirli Kofaktörler ile toeprinting reaksiyonu ile destekleyebilirsiniz. Örneğin, çeviri başlatma kompleksleri karşı 80S 48S Floresans yoğunluklarını toeprints7' nin dağıtım göre farklı. Başlatma karmaşık gözlenen kullanılan guanin nükleotid türüne bağlı olacaktır. Burada tartışılan XIAP IRES durumunda GMP PNP artı ATP stabilize 48S öncesi başlatma kompleksleri, ile karakterize bir toeprint dağıtım + 17≥ + 18 > +19. GMP-PNP bir nonhydrolyzable GTP analog katılmadan, böylece çeviri başlatma 48S adım13engelleme ribozomal altbirimde engeller olduğunu. Buna ek olarak, GTP, ATP, veya ATP artı GTP 80S başlatma kompleksleri, toeprint dağıtım +17 < + 18 > +198tarafından karakterize stabilize.
Kullanıcının toeprint için istedikleri RNA türünü dikkate almak gerekir. Amaç bir IRES öğesi gibi bir kap bağımsız mekanizması çalışmaya ise RNA vitro herhangi bir ticari olarak mevcut kit ile transkripsiyonu olabilir. Ancak, 5' kap yapısına sahip olması koşuluyla herhangi bir memeli RNA bu toeprinting yöntemine tabi. Çok Millî olan mRNA uygun bir seti kullanarak oluşturulan gerekir. Yüksek kaliteli RNA hazırlanması yordamda önemli bir adımdır gibi her durumda, üreticinin iletişim kuralları yakından, takip edilmelidir. Başka bir kritik nokta fenol çekme adım 3.7 içinde ya da nötr pH üzerinde yapılmalıdır ki olduğunu; asit fenol bu aşamada kullanılırsa, yeni sentezlenmiş cDNA kaybolacak. Bu adımda 3.5 kullanılan magnezyum asetat konsantrasyonu ters transkripsiyon verimliliğini etkileyebilir ve her mRNA için optimize edilmiş olması gerekebilir dikkati çekiyor.
Birkaç anahtar toeprint özgüllük sağlamak için gerekli denetimleridir. İlk olarak, hiçbir sağlam toeprint RRL veya nükleotid yokluğunda dikkat edilmelidir. Bu gözlenen ters transkripsiyon Duraklat istikrarlı bir RNA ikincil yapı veya ters transkripsiyon tepki ile bazı kusur değil, bir ribozom RNA kompleksi nedeniyle sağlar. İkincisi,-meli var olmak hayır toeprint mutasyona uğramış başlama kodonu görülmektedir. Bu ribozom RNA'ın başlama kodonu ile birlikte özellikle oluşturmuştur ve bu kullanıcının doğru olduğunu 3' kenar ribozomların kompleks içinde başlama kodonu ile tanımlanan sağlar. Bu, özellikle bir alternatif başlangıç kodon14ribozom işe IRES öğeler için önemlidir. Benzer şekilde, XIAP IRES8için olduğu gibi toeprint bir Poli-A kuyruk yokluğunda bozulmuş. Ancak, bazı IRES unsurlar CrPV IRES10gibi bir Poli-A kuyruk yokluğunda toeprints oluştururlar. Son olarak, uygun toeprint ek olarak, diğer ters transkripsiyon duraklar gözlenen. Bunlar sadece RNA istikrarlı ikincil yapılar nedeniyle duraklar temsil edebilir, ya da onlar neyin ribozom RNA15tarihinde diğer konumlara başlama kodonu slaytlar "ribozom atlamak" lakaplı bir olgu nedeniyle olabilir. Bu olasılık arasında ayırt etmek için toeprinting tepki etkili başlama kodonu, ribozom immobilizes ve alternatif toeprints atlama ribozom nedeniyle azaltmak gerektiğini sikloheksimit8, huzurunda gerçekleştirilebilir. Özellikle, farklı mRNA'ların sayısını ve yoğunluğunu transkripsiyon duraklar ters anlam farklı ikincil yapılar olacak (i.e., arka plan şeritler) da değişecektir.
Bir olası bu teknik ribozom mRNA içinde vitroişe alım ölçer, ama karmaşık bir çeviri başlatma oluşumu mutlaka çeviri içinde vivomeydana gelmez kısıtlamasıdır. Bu nedenle, toeprinting çeviri ölçmek için in vivo teknikleri ile birleştiğinde özellikle güçlü (örn.,16profil oluşturma polysome) ve elde edilen protein düzeyleri (e.g., Batı analiz).
Daha yeni bir teknik olan "ribozom profil oluşturma" ("ribozom footprinting" olarak da adlandırılır) neyin yüksek üretilen iş RNA sıralama ribozomlara toplam hücresel mRNA üzerinde varlığını ölçmek için kullanılır. Ribozom işe transcriptome-geniş çapta ölçmek için güçlü bir tekniktir. Ribozom profil oluşturma için reaktifler, ribozom mRNA'ların üzerinde stabilize etmek sikloheksimit gibi kullanımı doğasında vardır. Ribozom orantısız sayıda sigara özellikle hangi kanonik olmayan çeviri başlatma17olarak algılanacak 5' Çevrilmeyen bölgesi (UTR), durmuş gibi bu potansiyel bir dezavantajı temsil eder. Toeprinting, sikloheksimit böyle yanlış pozitif olasılığı inkâr yordamı, ayrılmaz bir parçası değil. Birçok denetim deneyler ve yineleme yapmak için facile olduğu gibi Ayrıca, herhangi bir tek mRNA daha ayrıntılı olarak toeprinting tarafından ele (örneğin, birkaç nokta mutasyonlar etkisi ya da bir Poli-A kuyruk, ribozom istihdamı yokluğu test). Çok zaman alan ve denetim deney deney profil oluşturma bir ribozom bağlamında eşdeğer bir dizi gerçekleştirmek için maliyet engelleyici olurdu. Toeprinting böylece yüksek üretilen iş teknikleri dayandırılmış tamamlayıcı bir yaklaşımdır ve mekanizmaları çeviri Yönetmeliği8,9,10aydınlatmak için amaçlayan çalışmalar için hala yaygın olarak kullanılan, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çatışma-in-ifşa etmek niyetimiz yok.
Acknowledgments
Bu eser bir Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada-keşif Grant'ın (RGPIN-2017-05463), Kanada Vakfı tarafından yenilik-John R. Evans liderleri Fonu (35017), kampüs Alberta yeniliklerin programı ve Alberta Bakanlığı için finanse edildi Ekonomik kalkınma ve ticaret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
