Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo que visa analisar todo o genoma ligação do factor de transcrição do oligodendrocyte 2 (Olig2) em agudamente purificada oligodendrocyte precursor as células do cérebro (OPCs) através da realização de imunoprecipitação da cromatina de baixo-celular (ChIP) , preparação de biblioteca, elevado-throughput sequenciamento e análise de dados de bioinformatic.
Abstract
Em células de mamíferos, a transcrição do gene é regulada de maneira específica de tipo de célula pelas interações dos fatores transcricionais com DNA genômico. Fatores de transcrição de linhagem-específicos são considerados desempenham um papel essencial na especificação de célula e diferenciação durante o desenvolvimento. ChIP, juntamente com o sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) é amplamente utilizado para analisar os locais obrigatórios de todo o genoma de fatores de transcrição (ou seu complexo associado) de DNA genômico. No entanto, um grande número de células é necessário para uma reação de ChIP padrão, que torna difícil estudar o número limitado de células primárias isoladas ou populações de células raras. Para entender o mecanismo regulatório de transcrição de linhagem específica oligodendrocyte fator Olig2 no rato agudamente purificado OPCs, um método detalhado usando ChIP-seq para identificar os sítios de ligação de todo o genoma de Olig2 (ou Olig2 complexo) é mostrado. Primeiro, o protocolo explica como purificar a alfa do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα) OPCs positivos de cérebro de rato. Em seguida, Olig2 anticorpo mediada ChIP e construção de biblioteca são executadas. A última parte descreve o software de bioinformatic e procedimentos utilizados para análise de Olig2 ChIP-seq. Em resumo, este trabalho relata um método para analisar as ligações de todo o genoma do fator transcricional Olig2 no cérebro agudamente purificado OPCs.
Introduction
É importante estudar a proteína (ou complexo proteico) ligações de DNA e as marcas epigenéticas para construir redes de regulação transcricionais envolvida em vários processos biológicos. Particularmente, as associações de fatores de transcrição com o DNA genômico podem desempenhar um papel importante no Regulamento do gene, a diferenciação celular e o desenvolvimento de tecido. Uma poderosa ferramenta para estudar a regulação transcricional e mecanismos epigenéticos é imunoprecipitação da cromatina (ChIP). Devido aos avanços rápidos na próxima geração de tecnologia de sequenciamento, ChIP, juntamente com o sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) é usado para as análises de associações de proteína-ADN e marcas epigenéticas1. No entanto, um protocolo padrão de ChIP-seq requer aproximadamente 20 milhões de células por reação, o que dificulta a aplicação desta técnica, quando o número de células é limitado, tais como células primárias isoladas e populações de células raras.
Células de linhagem oligodendrocyte incluindo células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) e oligodendrócitos são amplamente distribuídas por todo o cérebro e são essenciais para o desenvolvimento e a função do cérebro. Como um tipo de células precursoras, OPCs são capazes de auto-renovação e diferenciação. OPCs não só servem como progenitoras de oligodendrócitos, mas também desempenham um papel importante na propagação de sinalização neuronal, comunicando-se com outros tipos de células de cérebro2. Estudos anteriores sugeriram que o desenvolvimento do oligodendrocyte é regulamentado por fatores de transcrição de linhagem-específicos tais como Olig2 e Sox103,4. Estes fatores de transcrição foram encontrados para ligar as regiões promotor ou potenciador de alguns genes cruciais para influenciar sua expressão durante oligodendrocyte especificação e diferenciação. No entanto, é difícil identificar DNA-ligando da proteína (ou complexo proteico) de interesse em OPCs primárias aguda purificadas com um número muito limitado de células.
Este protocolo descreve como investigar sistematicamente a immunoprecipitated DNA genômico pela Olig2 no rato purificada OPCs no genoma-larga escala usando a técnica de ChIP-seq. OPCs de cérebro de rato aguda foram purificados por immunopanning e usados em um experimento de ChIP sem proliferação in vitro. Um número limitado de OPCs pode ser obtido por immunopanning e é insuficiente para experimentos de ChIP-seq padrão. Neste documento, um protocolo de ChIP-seq baixo-célula com tão baixo quanto 20 mil células por reação de ChIP para fatores de transcrição é descrito. Em breve, reticuladas células foram lysed e lisadas por um dispositivo sonication de cisalhamento a cromatina. A cromatina cortada foi incubada com anticorpo Olig2, bem como proteína grânulos revestidos A para precipitar Olig2 anticorpo ligado DNA genômico. Após a eluição de grânulos de proteína A-revestido e cross-linking reversa, DNA genômico precipitado pelo anticorpo Olig2 foi purificado por extração fenol-clorofórmio. O produto resultante foi quantificado e submetido a T-tailing, primeira demão recozimento modelo de comutação e de extensão, a adição de adaptadores e amplificação, seleção de tamanho de biblioteca e purificação passos para construção de biblioteca de ChIP-seq.
Após o sequenciamento, foi analisada a qualidade do cru diz tanto a amostra preparada com anticorpos de factor de transcrição Olig2 e a amostra de controle. Pares de base de baixa qualidade e adaptador contendo leram fragmentos foram aparados. Próximo, aparadas leituras estavam alinhadas para o genoma de referência de rato. As regiões genômicas que foram significativamente enriquecidas para leituras de ChIP, em comparação com as amostras de controlo, foram detectadas como picos. Picos significativos, representando potenciais locais de ligação de fator de transcrição, foram filtrados e visualizados em um navegador de genoma.
Notavelmente, o método descrito neste protocolo pode ser amplamente utilizado para ChIP-seq de outros factores de transcrição com qualquer tipo de célula do número limitado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Redes de regulamento do gene de mamíferos são muito complexas. ChIP-seq é um método poderoso para investigar interações proteína-ADN de todo o genoma. Este protocolo inclui como executar Olig2 ChIP-seq usando um número baixo de OPCs purificados de cérebro de rato (tão baixo quanto 20 mil células por reação). O primeiro passo fundamental para este protocolo é a purificação de OPCs de cérebro de rato por immunopanning com anticorpo PDGFRα. Para a selecção positiva de OPCs com placas PDGFRα revestido, O…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, XD, RCDD e YY foram apoiados por concessões dos institutos nacionais de saúde R01 NS088353; NIH conceder 1R21AR071583-01; a Fundação de Hermann Staman Ogilvie fundo-Memorial; a iniciativa do cérebro UTHealth e CTSA UL1 TR000371; e uma bolsa da Universidade do Texas sistema neurociência e Neurotecnologia Research Institute (Grant #362469).
Materials
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
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