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Neuroscience

कम सेल क्रोमेटिन Immunoprecipitation अनुक्रमण विश्लेषण द्वारा तीव्र शुद्ध PDGFRα + कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारक Olig2 जीनोमिक बंधन साइटों की पहचान

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57547
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

Summary

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल जो कम सेल क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) प्रदर्शन द्वारा तीव्र रूप से शुद्ध मस्तिष्क oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं (OPCs) में oligodendrocyte प्रतिलेखन कारक 2 (Olig2) के जीनोम व्यापक बंधन का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है मौजूद , पुस्तकालय तैयारी, उच्च प्रवाह अनुक्रमण और bioinformatic डेटा विश्लेषण ।

Abstract

स्तनधारी कोशिकाओं में, जीन प्रतिलेखन जीनोमिक डीएनए के साथ transcriptional कारकों की बातचीत द्वारा एक कोशिका प्रकार विशिष्ट तरीके से विनियमित है । वंश-विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों के लिए सेल विनिर्देश और विकास के दौरान भेदभाव में आवश्यक भूमिका निभाने के लिए माना जाता है । उच्च प्रवाह डीएनए अनुक्रमण (चिप seq) के साथ युग्मित चिप व्यापक रूप से जीनोमिक डीएनए के लिए प्रतिलेखन कारकों (या उसके जुड़े जटिल) के जीनोम व्यापक बाध्यकारी साइटों का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या एक मानक चिप प्रतिक्रिया है, जो यह मुश्किल अलग प्राथमिक कोशिकाओं या दुर्लभ कोशिका आबादी की सीमित संख्या का अध्ययन करने के लिए बनाता है के लिए आवश्यक हैं । आदेश में oligodendrocyte वंश के विनियामक तंत्र को समझने के लिए विशिष्ट प्रतिलेखन कारक Olig2 तीव्र शुद्ध माउस OPCs में, एक विस्तृत चिप seq का उपयोग करने के लिए Olig2 (या Olig2 परिसर) के जीनोम व्यापक बाध्यकारी साइटों की पहचान विधि दिखाया गया है । सबसे पहले, प्रोटोकॉल बताते हैं कि कैसे प्लेटलेट को शुद्ध करने के लिए-व्युत्पंन वृद्धि कारक रिसेप्टर अल्फा (PDGFRα) सकारात्मक OPCs माउस दिमाग से. अगले, Olig2 एंटीबॉडी मध्यस्थता चिप और पुस्तकालय निर्माण किया जाता है । पिछले भाग bioinformatic सॉफ्टवेयर और Olig2 चिप seq विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं का वर्णन । संक्षेप में, इस कागज एक विधि को तीव्र रूप से शुद्ध मस्तिष्क OPCs में transcriptional कारक Olig2 के जीनोम व्यापक bindings विश्लेषण की रिपोर्ट ।

Introduction

यह प्रोटीन (या प्रोटीन जटिल) डीएनए bindings और epigenetic मार्क्स विभिंन जैविक प्रक्रियाओं में शामिल transcriptional विनियामक नेटवर्क का निर्माण करने के लिए अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है । विशेष रूप से, जीनोमिक डीएनए के लिए प्रतिलेखन कारकों की bindings जीन विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं, सेल भेदभाव, और ऊतक के विकास । transcriptional विनियमन और epigenetic तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) है । अगली पीढ़ी अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में तेजी से प्रगति के कारण, उच्च प्रवाह डीएनए अनुक्रमण (चिप seq) के साथ युग्मित चिप प्रोटीन डीएनए bindings और epigenetic के निशान के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है1। हालांकि, एक मानक चिप seq प्रोटोकॉल की प्रतिक्रिया के बारे में २०,०००,००० कोशिकाओं की आवश्यकता है, जो इस तकनीक के आवेदन मुश्किल जब कोशिका संख्या सीमित है, जैसे पृथक प्राथमिक कोशिकाओं और दुर्लभ कोशिका आबादी के रूप में बनाता है ।

Oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं (OPCs) और oligodendrocytes सहित Oligodendrocyte वंश कोशिकाओं व्यापक रूप से मस्तिष्क भर में वितरित कर रहे हैं और विकास और मस्तिष्क के समारोह के लिए आवश्यक हैं । अग्रदूत कोशिकाओं के एक प्रकार के रूप में, OPCs दोनों आत्म नवीकरण और भेदभाव करने में सक्षम हैं । OPCs न केवल oligodendrocytes के लिए progenitors के रूप में सेवा, लेकिन यह भी मस्तिष्क की कोशिकाओं के अंय प्रकार के साथ संचार द्वारा ंयूरॉन संकेतन के प्रचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है2। पिछले अध्ययनों का सुझाव दिया है कि oligodendrocyte विकास वंश द्वारा विनियमित है विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों जैसे Olig2 और Sox103,4। इन प्रतिलेखन कारकों को प्रवर्तक या कुछ महत्वपूर्ण जीन के बढ़ाने के क्षेत्रों को oligodendrocyte विनिर्देश और भेदभाव के दौरान अपनी अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए बाध्य पाया गया । हालांकि, यह कोशिकाओं की एक बहुत ही सीमित संख्या के साथ तीव्रता से शुद्ध प्राथमिक OPCs में प्रोटीन (या प्रोटीन परिसर) ब्याज की डीएनए बाइंडिंग की पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण है ।

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे व्यवस्थित करने के जीनोम में शुद्ध माउस OPCs में Olig2 द्वारा जीनोमिक डीएनए immunoprecipitated जांच करने के लिए व्यापक पैमाने चिप-seq तकनीक का उपयोग कर । माउस दिमाग से OPCs तीव्रता से immunopanning द्वारा शुद्ध और एक चिप प्रयोग में प्रसार के बिना इस्तेमाल किया गया इन विट्रो में। OPCs की एक सीमित संख्या immunopanning द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और मानक चिप-seq प्रयोगों के लिए अपर्याप्त है । इस के साथ साथ, एक कम सेल चिप-प्रतिलेखन कारकों के लिए चिप प्रतिक्रिया प्रति २०००० कोशिकाओं के रूप में कम के साथ seq प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । संक्षेप में, पार से जुड़े कोशिकाओं लीजड ड और क्रोमेटिन कतरनी करने के लिए एक sonication डिवाइस द्वारा sonicated थे । कतरनी क्रोमेटिन Olig2 एंटीबॉडी के साथ के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन एक लेपित मोती Olig2 एंटीबॉडी बाध्य जीनोमिक डीएनए हाला करने के लिए मशीन था । प्रोटीन से रेफरेंस के बाद एक लेपित मोतियों और रिवर्स पार जोड़ने, जीनोमिक डीएनए Olig2 एंटीबॉडी द्वारा उपजी phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा शुद्ध किया गया था । परिणामस्वरूप उत्पाद quantified और टी के अधीन था, पूंछ, प्राइमर एनीलिंग टेंपलेट स्विचन और विस्तार, एडेप्टर और प्रवर्धन, पुस्तकालय का आकार चयन और चिप seq पुस्तकालय निर्माण के लिए शुद्धि कदम के अलावा ।

अनुक्रमण के बाद, कच्चे दोनों Olig2 प्रतिलेखन फैक्टर एंटीबॉडी और नियंत्रण के नमूने के साथ तैयार नमूना से पढ़ता की गुणवत्ता का विश्लेषण किया गया था. कम गुणवत्ता वाले आधार जोड़े और एडाप्टर को पढ़ने के टुकड़े युक्त छंटनी की गई । अगले, ट्रिम किए गए पढ़ता माउस संदर्भ जीनोम के लिए गठबंधन किया गया । जीनोमिक क्षेत्रों है कि काफी चिप के लिए समृद्ध थे पढ़ता है, नियंत्रण नमूने की तुलना में, चोटियों के रूप में पता लगाया गया । महत्वपूर्ण चोटियों, संभावित प्रतिलेखन कारक बंधन साइटों का प्रतिनिधित्व, फ़िल्टर और एक जीनोम ब्राउज़र में visualized थे ।

विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि मोटे तौर पर सीमित संख्या के किसी भी सेल प्रकार के साथ अंय प्रतिलेखन कारकों की चिप seq के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

सभी पशु उपयोग और प्रायोगिक प्रोटोकॉल के अनुसार की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के साथ प्रदर्शन किया गया और संस्थागत सुरक्षा समिति और पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय में ह्यूस्टन.

1. माउस मस्तिष्क से PDGFRα सकारात्मक Oligodendrocyte वंश कोशिकाओं का शुद्धिकरण (संशोधित पहले से वर्णित immunopanning प्रोटोकॉल5,6,7)

  1. PDGFRα सकारात्मक सेल चयन और endothelial कोशिकाओं और microglia की कमी के लिए 2 प्लेटों के लिए एक immunopanning प्लेट की तैयारी ।
    नोट: कृपया ध्यान दें कि पेट्री व्यंजन नहीं बल्कि सेल संस्कृति व्यंजन immunopanning प्रयोग के लिए काम करते हैं; यदि शुद्ध कोशिकाओं संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, immunopanning कदम बाहर की सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए
    1. कोट एक 10 सेमी पेट्री प्लेट 30 µ एल बकरी एंटी-रैट आईजीजी के साथ 10 मिलीलीटर पीएच ९.५, ५० मिमी Tris-एचसीएल में रात 4 डिग्री सेल्सियस पर । आंदोलन प्लेट की सतहों को समान रूप से और पूरी तरह से कोटिंग समाधान द्वारा कवर करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए ।
    2. ०.२% PDGFRα युक्त एंटीबॉडी के फास्फेट-बफर खारा (Dulbecco) के 12 मिलीलीटर के साथ चूहे विरोधी DPBS BSA के कमजोर ४० µ एल द्वारा PDGFRα एंटीबॉडी समाधान तैयार करें ।
    3. 10 मिलीलीटर 1x DPBS प्रत्येक के साथ आईजीजी लेपित प्लेट के 3 धो के बाद, PDGFRα एंटीबॉडी समाधान के साथ आईजीजी लेपित प्लेट के लिए कमरे के तापमान पर 4 एच ।
    4. चूहा विरोधी PDGFRα एंटीबॉडी लेपित प्लेट 10 मिलीलीटर 1x DPBS प्रत्येक के साथ 3 बार धो लो । धीरे प्लेट की ओर दीवार के साथ DPBS समाधान जोड़ने और लेपित सतहों परेशान नहीं करते ।
    5. कोट 2 नया 15 सेमी पेट्री प्लेट्स endothelial कोशिकाओं की कमी के लिए और microglia के साथ 20 मिलीलीटर की DPBS युक्त २.३ µ g/एमएल के Banderiaea simplicifolia लेक्टिन 1 (बीएसएल-1) के लिए 2 एच.
    6. 20 मिलीलीटर 1x DPBS के साथ बीएसएल-1 लेपित प्लेटें 3 बार धोएं । धीरे प्लेटों की ओर दीवार के साथ DPBS समाधान जोड़ने और लेपित सतहों परेशान नहीं करते ।
  2. PDGFRα धनात्मक oligodendrocyte वंश कोशिकाओं का शुद्धिकरण पहले से प्रकाशित विधियों में से संशोधित किया गया है6 , 7 , 8.
    1. काटना 2 जन्मोत्तर दिन 7 (P7) माउस दिमाग से cortical ऊतकों को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार5,6।
    2. अलग कर देना ऊतकों को एक एकल सेल निलंबन तंत्रिका ऊतक पृथक्करण किट (पी) के साथ विस्तृत निर्माता के निर्देशों के अनुसार उत्पन्न करने के लिए ।
    3. संक्षेप में, एक स्केलपेल के साथ टुकड़ों में विच्छेदित cortical ऊतकों में कटौती और ३७ डिग्री सेल्सियस पर पाचन एंजाइमी के लिए उंहें विषय । पाचन के बाद, एक सिंगल सेल सस्पेंशन में आग से पॉलिश्ड ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ अलग कर देना को मैन्युअल रूप से पीस लें ।
    4. ३०० एक्स जी में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एकल सेल निलंबन केंद्रापसारक और immunopanning बफर के 15 मिलीलीटर का उपयोग कर सेल गोली निलंबित (immunopanning बफर ०.०२% BSA और 5 µ g/एमएल इंसुलिन के साथ DPBS है) ।
    5. 2 माउस दिमाग से एकल सेल निलंबन क्रमिक रूप से 2 पर बीएसएल-1 प्लेट के कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए लेपित प्लेटें हर 5 मिनट microglia और endothelial कोशिकाओं की एक बेहतर कमी सुनिश्चित करने के लिए ।
    6. धीरे थाली भंवर सेल निलंबन में गैर अनुयाई कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उंहें चूहे पर गर्मी-PDGFRα एंटीबॉडी-लेपित प्लेट कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए ।
    7. चूहा-PDGFRα एंटीबॉडी-लेपित प्लेट पर कोशिका निलंबन की गर्मी के बाद, धीरे से सेल निलंबन इकट्ठा करने के लिए थाली घूमता है, और DPBS के साथ 8 बार प्लेट कुल्ला करने के लिए गैर अनुयाई कोशिकाओं से छुटकारा पाने के लिए । धीरे थाली के पक्ष की दीवार के साथ धोने समाधान जोड़ने और थाली कई बार आंदोलन के लिए गैर अनुयाई कोशिकाओं से छुटकारा पाने के ।
    8. चूहे से अलग कोशिकाओं-PDGFRα एंटीबॉडी लेपित प्लेट ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेल टुकड़ी समाधान उपचार के एक 4 मिलीलीटर का उपयोग कर । अनुयाई कोशिकाओं को उखाड़ फेंक करने के लिए प्लेट हिला ।
    9. कमरे के तापमान पर ३०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा शुद्ध OPCs लीजिए, 2 मिलीलीटर OPC सेल संस्कृति माध्यम के साथ सेल गोली निलंबित और trypan नीला और एक hemocytometer (५०० एमएल सेल संस्कृति माध्यम है DMEM/F12 मध्यम से युक्त 5 मिलीलीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना पेनिसिलिन-streptomycin समाधान (पी/एस), 5 मिलीलीटर N2, 10 मिलीलीटर B27, 5 µ ग्राम/एमएल इंसुलिन, ०.१% BSA, 20 एनजी/एमएल bFGF और 10 एनजी/एमएल PDGFRα) ।
  3. immunopanning के बाद OPCs की पवित्रता का सत्यापन ।
    1. immunopanning के बाद OPCs के संवर्धन का मूल्यांकन करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक guanidium thiocyanate आधारित निष्कर्षण के साथ आरएनए निष्कर्षण के लिए शुद्ध OPCs में से कुछ का उपयोग करें ।
    2. qRT-पीसीआर फ्लोरोसेंट हरी डाई मास्टर मिश्रण का उपयोग करके शुद्ध OPCs में PDGFRα अभिव्यक्ति की समृद्धता के लिए जांच करने के रूप में पहले से प्रकाशित सामग्री के अनुसार असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं के साथ तुलना में4।
    3. इसके अतिरिक्त, बीज पाली में कुछ शुद्ध OPCs-D-Lysine लेपित 24 immunostaining के लिए अच्छी तरह से प्लेटें विरोधी के साथ NG2 chondroitin सल्फेट proteoglycan (NG2) एंटीबॉडी के रूप में पहले से प्रकाशित सामग्री9।

2. कम सेल चिप तैयारी और उच्च प्रवाह अनुक्रमण के लिए चिप पुस्तकालय निर्माण

  1. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध sonication प्रणाली और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कम सेल नंबर चिप किट के साथ कम सेल चिप तैयारी Olig2 निर्माता के निर्देशों से विस्तृत मानक प्रक्रियाओं का पालन करके (सामग्री की तालिका देखें) ।
    1. चूहा विरोधी से अलग करने के बाद PDGFRα एंटीबॉडी-लेपित प्लेट और सेल trypan नीले और एक hemocytometer डाल के साथ गिनती २०,००० 1 मिलीलीटर OPCs सेल संस्कृति माध्यम में प्रत्येक चिप प्रतिक्रिया के लिए शुद्ध OPC ।
    2. कक्ष के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेल सस्पेंशन को ठीक करने के लिए ३६.५% formaldehyde के 27 µ l को जोड़ें ।
      चेतावनी: कृपया ध्यान दें कि formaldehyde सुरक्षा कारणों के लिए रासायनिक धुएं हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    3. बंद करो डीएनए-प्रोटीन पार ५० µ एल २.५ एम glycine कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए के साथ जोड़ने ।
      नोट: सभी कदम बर्फ पर या इस बिंदु से 4 ° c ठंडे कमरे में किया जाना चाहिए ।
    4. पार से जुड़े सेल छर्रों बर्फ के 1 मिलीलीटर-ठंडा हैंक्स ' के साथ संतुलित नमक समाधान (HBSS) को छेड़ने अवरोधक कॉकटेल के साथ और एक पूर्व ठंडा केंद्रापसारक द्वारा गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर ३०० x g पर प्राप्त कोशिकाओं को धो लें ।
    5. लाइसे 25 µ एल में सेल गोली बर्फ पर 5 मिनट के लिए पूरा Lysis बफर ।
      नोट: Lysis बफ़र में कक्षों को निलंबित करने के लिए ट्यूब आंदोलन ।
    6. ७५ µ एल बर्फ के साथ सेल lysate अनुपूरक-ठंड HBSS से युक्त छेड़ने अवरोधक कॉकटेल और कतरनी से सेल lysate के क्रोमेटिन 30 एस के 5 चक्र के साथ पूर्व-कूल्ड sonication सिस्टम और 30 एस पर कार्यक्रम से । हमेशा 6 ट्यूबों एक साथ sonicate और सुनिश्चित करें कि संतुलन ट्यूबों १०० µ l पानी होते हैं ।
    7. बाल काटना के बाद, 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए १४,००० x g पर केंद्रापसारक और केंद्रापसारक के बाद एक नया ट्यूब में supernatant इकट्ठा ।
    8. पतला बर्फ के बराबर मात्रा के साथ कतरनी क्रोमेटिन के १०० µ l-ठंड पूरा चिप बफर को रोकना ।
    9. इनपुट नियंत्रण नमूना के रूप में पतला कतरनी क्रोमेटिन के 20 µ एल सहेजें ।
      नोट: इनपुट नियंत्रण नमूना भी Olig2 एंटीबॉडी immunoprecipitated डीएनए की पहचान करने के लिए Olig2 immunoprecipitated नमूना तुलना के रूप में आवश्यक है.
    10. खरगोश विरोधी olig2 एंटीबॉडी के 1 µ l जोड़ें पतला कतरनी क्रोमेटिन के १८० µ एल और 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए ४० rpm पर एक घूर्णन व्हील पर प्रतिक्रिया ट्यूब मशीन ।
      नोट: इस चरण को ठंडे कमरे में निष्पादित करें ।
    11. प्रत्येक चिप प्रतिक्रिया के लिए, धो 11 µ एल चुंबकीय प्रोटीन A-लेपित मोती ५५ µ l मोती धोने बफर के साथ और 2 धोने के बाद मनका धोने बफर के 11 µ एल में मनका गोली डाल दिया ।
      नोट: इस चरण को ठंडे कमरे में निष्पादित करें ।
    12. प्रत्येक चिप प्रतिक्रिया के लिए, जोड़ें 10 µ पूर्व के एल-धोया प्रोटीन एक-लेपित मोती चिप प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए । एक ठंडे कमरे में इस कदम प्रदर्शन करते हैं ।
    13. एक घूर्णन पहिया पर एक और 2 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर चिप प्रतिक्रिया ट्यूब मशीन ।
    14. 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर चिप रिएक्शन ट्यूब रखो ।
      नोट: इस चरण को ठंडे कमरे में निष्पादित करें ।
    15. supernatant निकालें और मनका गोली को उखाड़ फेंकना नहीं है ।
    16. धो 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पहिया पर 4 मिनट के लिए क्रमशः चार धोने buffers के प्रत्येक के लिए १०० µ l के साथ मनका गोली ।
    17. धोने के बाद, मनका गोली को २०० µ एल रेफरेंस बफर के जोड़ें और ६५ डिग्री सेल्सियस पर चिप प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए 4 एच पार लिंक प्रोटीन-डीएनए रिवर्स करने के लिए ।
    18. इसके अतिरिक्त, 20 µ एल इनपुट नियंत्रण नमूना के लिए रेफरेंस बफर के १८० µ एल जोड़ें और 4 एच के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी पार लिंक प्रोटीन-डीएनए के रूप में अच्छी तरह से रिवर्स करने के लिए ।
    19. जोड़ें २०० µ l 25:24:1 (v/v) phenol का मिश्रण, क्लोरोफॉर्म, और isoamyl शराब प्रत्येक चिप प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए ।
    20. भंवर जोरदार 1 मिनट के लिए और १३,००० x g पर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक । एक नई ट्यूब के लिए ऊपरी चरण स्थानांतरण ।
    21. जोड़ें ४० µ एल 3 एम सोडियम एसीटेट समाधान, १,००० µ एल के १००% इथेनॉल और ग्लाइकोजन precipitant covalently के 2 µ एल के एक नीले रंग से जुड़े प्रत्येक चिप रिएक्शन ट्यूब पर रात भर-20 ° c.
    22. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १३,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    23. supernatant त्यागें, ५०० µ एल ठंडा ७०% इथेनॉल के साथ धो और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १३,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    24. supernatant त्यागें, 10 मिनट के लिए गोली हवा सूखी रखने के लिए और ५० µ l पानी के साथ गोली भंग ।
  2. उच्च प्रवाह अनुक्रमण के लिए चिप पुस्तकालय निर्माण
    1. साफ और ' निर्माताओं के निर्देश के अनुसार एक सफाई किट के साथ चिप डीएनए ध्यान केंद्रित ।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पिको-ग्रीन द्वारा चिप नमूने को बढ़ाता है ।
    3. टी के लिए एक चिप seq किट का प्रयोग करें-पूंछ, प्रतिकृति और पूंछ, टेंपलेट स्विचन और विस्तार, एडाप्टर और प्रवर्धन, पुस्तकालय आकार चयन और शुद्धि के निर्माता के निर्देशों के अनुसार के अलावा ।
      1. dsDNA के विकार के बाद, चिंराट alkaline फॉस्फेट द्वारा ssDNA के 3 ' अंत dephosphorylate और टर्मिनल ssDNA deoxynucleotidyl द्वारा ट्रांस्फ़्रेज़ के लिए एक पाली (टी) पूंछ जोड़ें ।
      2. डीएनए की पाली (डीए) ssDNA को डीएनए प्रतिकृति और टेम्पलेट स्विचन टेंपलेट के लिए प्राइमर ।
      3. के बाद स्विचन टेंपलेट, आगे और अनुक्रमण के लिए रिवर्स प्राइमरों के साथ पीसीआर द्वारा चिप seq पुस्तकालय बढ़ाना ।
      4. डबल आकार चयन के लिए 2 विकल्प द्वारा paramagnetic मोतियों से ५०० बीपी से लेकर टुकड़ों के साथ पीसीआर प्रवर्धित चिप seq पुस्तकालय का चयन करें ।
      5. एक microfluidic चिप केशिका ट्रो डिवाइस का उपयोग कर चयनित चिप seq पुस्तकालय की गुणवत्ता की जांच करें ।

3. डेटा विश्लेषण

  1. निर्देशिका संरचना तैयार करें ।
    1. चिप-seq डेटा विश्लेषण करने के लिए एक निर्देशिका बनाएं । नई बनाई गई निर्देशिका के अंदर, निंनलिखित नामों के साथ छह उपनिदेशकों बनाएं: रॉ. फाइलें, fastqc. आउटपुट, bowtie. आउटपुट, होमर. आउटपुट, macs2. आउटपुट, आकृति. विश्लेषण, और रिपोर्ट ।
  2. डेटा तैयार करने और कच्चे अनुक्रम डेटा की गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण करते हैं ।
    1. "raw. files" निर्देशिका में ले जाएँ और चिप-seq डेटा फ़ाइलें डाउनलोड करें ।
    2. फ़ाइल नाम की जांच करें । अनुक्रमण युग्मित-अंत किया गया था, तो समान आधार नाम के साथ 4 फ़ाइलें (दो के लिए उपचार और दो इनपुट के लिए) हो जाएगा: PDGFRα _olig2. read1. fastq, PDGFRα _olig2. read2. fastq, PDGFRα _input. read1. fastq, और PDGFRα _input. read2. fastq. फ़ाइल नाम भिन्न हैं, तो उन्हें "एमवी" आदेश का उपयोग कर का नाम बदलें ।
    3. "fastqc. आउटपुट" निर्देशिका में ले जाएं ।
    4. एक fastq फ़ाइल गुणवत्ता नियंत्रण सॉफ्टवेयर10का उपयोग कर रॉ पढ़ता से गुणवत्ता नियंत्रण मेट्रिक्स प्राप्त करें । प्रत्येक fastq फ़ाइल के लिए अलग से गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया चलाने के लिए आरेख S1A में आदेश का उपयोग करें । सॉफ्टवेयर एक html फाइल में कई गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स प्रदर्शित करेगा ।
    5. html गुणवत्ता नियंत्रण फ़ाइल खोलें और पढ़ता की संख्या, प्रति अनुक्रम गुणवत्ता स्कोर, अनुक्रम GC सामग्री, अनुक्रम डुप्लिकेशन स्तर, एडाप्टर सामग्री और kmer सामग्री, पठन लंबाई, सत्यापित करें ।
  3. ट्रिम ट्रेलिंग कम गुणवत्ता पढ़ता है और एडेप्टर सामग्री ।
    1. "प्रति आधार अनुक्रम गुणवत्ता" और "एडेप्टर सामग्री" भूखंडों पर गौर करें । दोनों सिर और प्रत्येक पढ़ने की पूंछ के लिए ट्रिमिंग लंबाई निर्धारित करें । trimming के लिए एक पर्याप्त लंबाई है, जहां आधार की गुणवत्ता 30 से नीचे गिर जाता है और वहां adapter सामग्री का सबूत है ।
    2. "raw. files" निर्देशिका में ले जाएं ।
    3. डाउनलोड और ट्रिमिंग के लिए एक सॉफ्टवेयर स्थापित करें11पढ़ता है । अलग से उपचार और इनपुट दोनों को ट्रिम करने के लिए आरेख S1B में आदेश का उपयोग करें । पैरामीटर ' फसल ' अंत से कुर्सियां ट्रिमिंग के बाद शेष पढ़ें लंबाई इंगित करता है और ' HEADCROP ' के लिए पढ़ें के शुरू से समाप्त किया जा करने के लिए कुर्सियां की संख्या निर्दिष्ट करता है ।
    4. ट्रिमिंग आदेश पैरामीटर ' MINLEN ' में फ़िल्टरिंग के बाद स्वीकार किया जा करने के लिए न्यूनतम पढ़ने के लिए लंबाई भी शामिल है । यदि reads कम से ५० bp हैं, तो पढ़ें लंबाई थ्रेशोल्ड के रूप में ३५ bp का उपयोग करें ।
    5. "fastqc. आउटपुट" निर्देशिका में ले जाएं ।
    6. fastq फ़ाइल गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण करने के बाद पढ़ता ट्रिम कर रहा है । सत्यापित करें कि गुणवत्ता नियंत्रण समस्या हल हो गई है । गुणवत्ता नियंत्रण मीट्रिक्स प्राप्त करने के लिए आरेख S1C में आदेश का उपयोग करें ।
  4. एकल-अंत या युग्मित-अंत चिप-seq में संरेखित करें माउस संदर्भ जीनोम को पढ़ता है ।
    1. मैपिंग के लिए "bowtie. आउटपुट" निर्देशिका में ले जाएं ।
    2. GENCODE mm10 माउस संदर्भ जीनोम डाउनलोड करें । "mm10. एफए" के रूप में mm10 माउस संदर्भ जीनोम का नाम बदलें ।
    3. पठन मैपर12 डाउनलोड करें और इसे सिस्टम में स्थापित करें ।
    4. आरेख S2Aमें आदेश का उपयोग करके डाउनलोड किए गए संदर्भ जीनोम की अनुक्रमणिका फ़ाइल बनाएं । छह फ़ाइलें स्वचालित रूप से बनाई गई हैं: mm 10.1. bt2, mm 10.2. bt2, mm 10.3. bt2, mm 10.4. bt2, mm10. rev .1. bt2, and mm10. rev .2. bt2.
    5. संरेखण को निष्पादित और पैरामीटर समायोजित करने के लिए आरेख S2B में आदेश का उपयोग करें "-p" आपकी सिस्टम सेटिंग्स के अनुसार संसाधन कोर की संख्या में है । युग्मित-अंत मोड चल रहा है, तो पैरामीटर "-1" और "-2" ट्रिम की गई fastq फ़ाइलों के नाम इंगित करते हैं ।
      नोट: मैपिंग उपचार और इनपुट नमूने के लिए अलग से किया जाता है और प्रत्येक नमूने के लिए आउटपुट मीट्रिक लॉग फ़ाइलें बनाई जाती हैं ।
    6. सैम प्रारूप13 में फ़ाइलें हेर-फेर के लिए एक सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें और यह प्रणाली में स्थापित करें । संरेखित SAM फ़ाइल को आरेख S2Cमें आदेश का उपयोग कर एक BAM फ़ाइल में कनवर्ट करें ।
  5. दोनों युग्मित-अंत उपचार और नियंत्रण नमूने के लिए पीक कॉलिंग से पहले मैप की गई पुस्तकें की गुणवत्ता नियंत्रण मीट्रिक प्राप्त करें ।
    1. एक सबसे महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण मेट्रिक्स पता करने के लिए sequencing गहराई है । फ़ाइलें "log. bowtie. PDGFRα_Olig2. txt" और "log. bowtie. PDGFRα_input. txt" bowtie. आउटपुट निर्देशिका में खोलें, और सत्यापित करें कि प्रत्येक नमूने में अनन्य रूप से मैप की गई पठन जोड़ों की संख्या १०,०००,००० से अधिक है ।
    2. "होमर. आउटपुट" निर्देशिका में ले जाएं ।
    3. आकृति खोज और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विश्लेषण14 के लिए एक सॉफ़्टवेयर डाउनलोड करें और इसे सिस्टम में स्थापित करें ।
    4. "tagDir" नामक एक निर्देशिका बनाएं ।
    5. टैग clonality सत्यापित करने के लिए, आरेख S3Aमें दर्शाए गए आदेश का उपयोग करें । tagAutocorrelation. txt, tagCountDistribution. txt, tagInfo. txt, और tagLengthDistribution. txt: "makeTagDirectory" आदेश चार गुणवत्ता नियंत्रण आउटपुट फ़ाइलें जनरेट करेगा ।
    6. "tagDir" निर्देशिका में ले जाएं ।
    7. "रिपोर्ट" निर्देशिका में "tagCountDistribution. txt" फ़ाइल की प्रतिलिपि बनाएं ।
    8. "रिपोर्ट" निर्देशिका में ले जाएं ।
    9. स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करके tagCountDistribution. txt फ़ाइल खोलें और प्रति जीनोमिक टैग की संख्या का एक बार प्लॉट बनाएं । हिस्टोग्राम फ़ाइल को "tag. clonality. xlsx" नाम से संग्रहीत करता है ।
    10. सिस्टम में R प्रोग्रामिंग भाषा15 स्थापित करें ।
    11. टर्मिनल में, ' r ' टाइप करें और r प्रोग्रामिंग वातावरण तक पहुँचने के लिए enter दबाएँ ।
    12. चिप-seq डेटा16 प्रसंस्करण के लिए एक आर पैकेज डाउनलोड करें और इसे चित्रा S3Bमें चित्रित आदेश का उपयोग कर स्थापित करें ।
    13. किनारा क्रॉस-सहसंबंध प्लॉट करने के लिए चित्रा S3C में R स्क्रिप्ट का उपयोग करें ।
  6. पीक मैपर का उपयोग करते हुए चोटियों का पता लगाना ।
    1. "macs2. आउटपुट" निर्देशिका में ले जाएं । डाउनलोड करें और अपने सिस्टम में एक पीक मैपर17 स्थापित करें ।
    2. उपचार और नियंत्रण BAM चरण 3.4.6 में उत्पंन फ़ाइलों के साथ "callpeak" फ़ंक्शन का उपयोग करें ।
      नोट: अन्य पैरामीटर शामिल हैं "-f" इनपुट फ़ाइल स्वरूप के लिए, "-g" जीनोम आकार के लिए, "-नाम" सभी आउटपुट फ़ाइलों का आधार नाम का संकेत करने के लिए, और "-B" bedgraph स्वरूप में अंश pileup को संग्रहीत करने के लिए । पूरा पीक कॉलिंग आदेश आरेख S4Aमें शामिल होता है । युग्मित-अंत नमूनों के लिए BEDPE का उपयोग करें ।
    3. पुष्टि करें कि पीक मैपर छह फ़ाइलें जनरेट किया गया: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks. xls, PDGFRα _olig2_vs_pdgfr α _input_peaks. narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits. bed, PDGFRα _olig2_vs_pdgfr α _input_model. r, PDGFRα _olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda. बीडीजी, व PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup. बीडीजी.
    4. ओपन फ़ाइल PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks. xls बुलाया चोटियों, स्थान, लंबाई, शिखर संमेलन की स्थिति, pileup, और शिखर संवर्धन मैट्रिक्स को देखने के लिए:-log10 (pvalue), गुना संवर्धन, और-log10 (क्ष-मूल्य) ।
  7. फ़िल्टर और चोटियों बुलाया व्याख्या ।
    1. पिछले चरण में खोली गई फ़ाइल का उपयोग करते हुए, फ़ोल्ड संवर्धन के अनुसार परिणामी चोटियों को फ़िल्टर करें, p-मान और/या q-मान । पर्याप्त फ़िल्टरिंग थ्रेशोल्ड्स तय करने के लिए, प्रत्येक मीट्रिक का घनत्व निर्धारित करने के लिए हिस्टोग्राम प्लॉट करें. महत्वपूर्ण चोटियों को प्राप्त करने के लिए चयनित थ्रेशोल्ड के नीचे मानों को फ़िल्टर करें.
    2. डाउनलोड mm10 ब्लैकलिस्ट (क्षेत्रों कृत्रिम रूप से उच्च संकेत है के लिए जाना जाता है) और उन विरूपण साक्ष्य क्षेत्रों में से किसी के अंदर कर रहे हैं जो चिप seq चोटियों बाहर फिल्टर ।
    3. निंनलिखित कॉलम युक्त फ़िल्टर चोटियों के साथ एक बिस्तर फ़ाइल बनाएं: गुणसूत्र, शुरू, अंत, peakID, नकली, और किनारा । एक डॉट के साथ नकली कॉलम भरें "." क्योंकि यह प्रयोग नहीं किया जाता है । कतरा स्तंभ में, सभी मान "+" करने के लिए सेट करें । "फ़िल्टर्ड. peakData2. bed" के रूप में बिस्तर फ़ाइल सहेजें ।
    4. "रिपोर्ट" निर्देशिका में "फ़िल्टर्ड. peakData2. bed" फ़ाइल की प्रतिलिपि बनाएं ।
    5. "रिपोर्ट" निर्देशिका में ले जाएं ।
    6. एक विशिष्ट जीन क्षेत्र के लिए फ़िल्टर चोटियों व्याख्या करने के लिए, पिछले चरण में बनाया बिस्तर फ़ाइल के साथ समारोह "annotatePeaks" का उपयोग करें । उपयोग किया गया आदेश आरेख S5Aमें दिखाया गया है ।
    7. एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर "फ़िल्टर्ड. annotatedPeaks. txt" फ़ाइल खोलें ।
    8. एक व्याख्या की TSS से 5 केबी से अधिक दूरी पर एक intergenic क्षेत्र में झूठ बोल परिणामस्वरूप चोटियों फिल्टर. फ़िल्टरिंग के लिए दूरी के रूप में फ़ाइल में "TSS से दूरी" स्तंभ का उपयोग करें । "5kbup. geneBody. peakData. txt" नामक excel फ़ाइल में फ़िल्टर की गई चोटियों को संग्रहीत करना.
    9. परिणामी फ़िल्टर की गई चोटियों को स्तंभों के साथ एक bedGraph फ़ाइल में संग्रहीत करें: गुणसूत्र, प्रारंभ, अंत, और-log10 (q-मान) । फ़ाइल को "5kbup. geneBody. peakData. bedGraph" नाम दिया है ।
  8. ब्राउज़र विज़ुअलाइज़ेशन के लिए bigwig फ़ाइलें जनरेट करें ।
    1. डाउनलोड करें और जीनोम अंकगणित18के लिए एक सॉफ्टवेयर स्थापित करें ।
    2. bedgraph को bigwig में बदलने और सिस्टम में इंस्टॉल करने के लिए एक टूल डाउनलोड करें । ' mm10. chrom. size ' फ़ाइल डाउनलोड करें ।
    3. bigwig फ़ाइल जनरेट करने के लिए आरेख S6A में आदेश का उपयोग करें ।
    4. डाउनलोड करें और सिस्टम में एक जीनोम ब्राउज़र19 स्थापित करें ।
    5. जीनोम ब्राउज़र खोलें और फ़ाइल लोड "5kbup. geneBody. peakData. bigwig" के लिए फ़िल्टर्ड महत्वपूर्ण चोटियों और ज्ञात जीन के संबंध में उनके स्थान कल्पना ।
  9. आकृति खोज ।
    1. "रूपांकन. विश्लेषण" निर्देशिका में ले जाएं ।
    2. एक de नोवो आकृति स्कैनिंग और आकृति संवर्धन कार्यक्रम डाउनलोड करें और इसे अपने सिस्टम20में स्थापित करें ।
    3. एक व्यापक आकृति डेटाबेस है कि Olig2 के रूपांकनों शामिल डाउनलोड करें ।
    4. ५०० बीपी क्षेत्रों महत्वपूर्ण शिखर शिखर पर केंद्रित के जीनोमिक अनुक्रम प्राप्त करें । अनुक्रम को पीक. अनुक्रम. txt के रूप में संग्रहीत करता है । ५०० बीपी पीक क्षेत्रों में से प्रत्येक के भीतर Olig2 रूपांकनों के लिए खोज करने के लिए चित्रा S7 में आदेश का उपयोग करें ।
    5. एक पर्याप्त ई-मूल्य का उपयोग परिणामी रूपांकनों फ़िल्टर (डिफ़ॉल्ट = ०.०५) ।

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Representative Results

कम सेल चिप-seq प्रदर्शन किया गया था और bioinformatic विश्लेषण तीव्र रूप से शुद्ध मस्तिष्क जीनोमिक में OPCs डीएनए के साथ transcriptional कारक Olig2 की संभावित बातचीत की जांच करने के लिए किया गया था । आरेख 1 प्रयोगात्मक और डेटा विश्लेषण कार्यविधियों दोनों के एक सामांय कार्यप्रवाह को दिखाता है । इस प्रोटोकॉल में, जन्मोत्तर चूहों दिमाग एक एकल सेल निलंबन में असंबद्ध थे । टिशू पृथक्करण के बाद PDGFRα एंटीबॉडी का उपयोग कर OPCs को शुद्ध करने के लिए immunopanning का प्रदर्शन किया गया । चित्रा 2 PDGFRα के महत्वपूर्ण संवर्धन से पता चलता है, ंयूरॉन मार्कर Tuj1 की छोटी अभिव्यक्ति (ंयूरॉन-विशिष्ट वर्ग III बीटा tubulin), astrocyte मार्कर GFAP (glial fibrillary अंलीय प्रोटीन), microglia मार्कर से युक्त कैल्शियम बाइंडिंग अनुकूलक अणु 1 (Iba1), myelinating परिपक्व oligodendrocytes मार्कर myelin बुनियादी प्रोटीन (Mbp) और myelin-oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (मोग) से शुद्ध OPCs के रूप में आरटी द्वारा मूल्यांकन-qPCR । साथ ही, immunostaining परिणाम इंगित करता है कि अधिकांश कक्ष आरेख 2में दिखाए गए के रूप में धनात्मक NG2 हैं । बाद में, २०००० प्रति प्रतिक्रिया शुद्ध OPCs formaldehyde द्वारा तय किए गए थे और क्रोमेटिन एक sonication प्रणाली का उपयोग करके बाल काटना था । Olig2 कम सेल चिप प्रदर्शन किया गया था और पुस्तकालय का निर्माण किया गया था । चिप पुस्तकालय की तैयारी के बाद, उत्पन्न उत्पाद की गुणवत्ता एक microfluidic चिप केशिका ट्रो डिवाइस द्वारा मान्य किया गया था. चित्रा 3 एक Olig2 कम सेल चिप पुस्तकालय का एक उदाहरण electropherogram से पता चलता है । २५० से ५०० बीपी को लेकर Oligo2 लाइब्रेरी प्रोडक्ट की एक क्लियर कैपेसिटी लाइब्रेरी पीसीआर प्रोडक्ट के साइज सेलेक्शन के बाद दिखाई जानी चाहिए । दोनों नमूना Olig2 प्रतिलेखन फैक्टर एंटीबॉडी और नियंत्रण नमूना के साथ तैयार की चिप seq पुस्तकालयों युग्मित-अंत ५० चक्र अनुक्रमण पढ़ता उत्पादन करने के लिए उच्च प्रवाह अनुक्रमण के अधीन थे. अब लंबाई पढ़ें मानचित्रण दरों में सुधार होगा और बहु मानचित्रण की संभावना को कम करने, अनुक्रमण लागत की कीमत पर । ५० बीपी चिप-seq युग्मित अंत अनुक्रमण पुस्तकालयों के साथ, अच्छे परिणाम आमतौर पर प्राप्त कर रहे हैं ।

रॉ के प्रारंभिक गुणवत्ता नियंत्रण मूल्यांकन के बाद पढ़ता है और एडेप्टर की छंटनी और कम गुणवत्ता वाले आधार जोड़े ट्रेलिंग, गुणवत्ता नियंत्रण भूखंडों चित्रा 4में चित्रित कर रहे हैं । ट्रिम किए गए पढ़ता एक आधार गुणवत्ता 30 से अधिक होना चाहिए, कोई एडेप्टर अनुक्रम, और एक कम दोहराव दर (आरेख 4B-D) है । अच्छी गुणवत्ता छंटनी की पुस्तकें समग्र संरेखण दर में वृद्धि होगी । GC सामग्री के रूप में अन्य मापदंडों भी महत्वपूर्ण हैं और ट्रिमिंग के लिए विचार किया जाना चाहिए.

sequencing नमूने संरेखित हैं, तो यह sequencing गहराई सत्यापित करने के लिए आवश्यक है । यह ज्ञात है कि चोटियों कहा जाता है की संख्या एक उच्च अनुक्रमण गहराई के साथ वृद्धि के बाद से कमजोर साइटों सांख्यिकीय अधिक महत्वपूर्ण हो जाएगा21। एक संतृप्ति विश्लेषण समय और बजट की कीमत पर, इस्तेमाल प्रत्येक विशिष्ट प्रतिलेखन कारक के लिए एक पर्याप्त अनुक्रमण गहराई निर्धारित करने के लिए आवश्यक है । प्रतिलेखन कारक बाइंडिंग के लिए एक आम सहमति अनुक्रमण गहराई स्तनधारी नमूनों के बारे में सांकेतिक शब्दों में बदलना कंसोर्टियम द्वारा सुझाव दिया गया है: १०,०००,००० की एक न्यूनतम दो से कम के प्रत्येक के लिए विशिष्ट रूप से मैप किया गया पढ़ता है22 विशेष रूप से मैप की गई पढ़ता और समग्र संरेखण दर की संख्या की गणना पढ़ें मैपर द्वारा की गई थी । अच्छी मैपिंग मीट्रिक का एक उदाहरण चित्र 5में दिखाया गया है । संरेखित पढ़ता को भिंन जीनोमिक स्थानों पर मैप किया जाना चाहिए, जो पर्याप्त लायब्रेरी जटिलता इंगित करता है, जिसे टैग clonality भी कहा जाता है । एन्कोडेड कंसोर्टियम से पता चलता है कि संरेखित reads के १०,०००,००० के कम से ८०% अलग जीनोमिक क्षेत्रों के लिए मैप किया जाना चाहिए22। आरेख 5B एक पर्याप्त टैग clonality दिखाता है जिसमें ९०% से अधिक पुस्तकें केवल एक जीनोमिक स्थान पर मैप की जाती हैं । कम जटिलता वाले पुस्तकालयों आम तौर पर जब पर्याप्त नहीं डीएनए प्राप्त की है, और पीसीआर प्रवर्धित टुकड़ों को बार-बार अनुक्रम हो रहे हैं । एक कम जटिलता पुस्तकालय एक उच्च झूठी पीक खोज दर निकलेगा ।

जब का उपयोग कर युग्मित अंत चिप-seq डेटा, जुदाई की एक निश्चित दूरी के साथ प्रतिलेखन कारक के आसपास बांध टुकड़े । युग्मित-end अनुक्रमण का एक अधिक सटीक अनुमान के लिए अनुमति देगा माध्य टुकड़ा लंबाई जीनोमिक क्षेत्रों का एक बेहतर अनुमान उपज जहां अधिक बाइंडिंग हुई । किनारा सहसंबंध साजिश प्रमुख टुकड़ा लंबाई के लिए इसी संवर्धन के एक चोटी को दर्शाया गया है । के रूप में चित्रा 5Cमें देखा, परिकलित अंश लंबाई १३० bp है जबकि पढ़ें लंबाई ५० bp है । एक चिप-seq dataset जहां अंश लंबाई पढ़ने की लंबाई से अधिक है उच्च गुणवत्ता16का संकेत है ।

चोटी कॉलिंग के उत्पादन जीनोमिक प्रतिलेखन कारक (या उसके परिसर) से बंधे होने की संभावना क्षेत्रों की एक सूची है । जीनोमिक क्षेत्रों या चोटियों की सूची एक "बिस्तर" फ़ाइल है जो एक जीनोम ब्राउज़र में देखा जा सकता है में शामिल है । प्रत्येक चोटी के लिए, इस फ़ाइल में एक पीक ID, पीक समिट का जीनोमिक स्थान, और एफडीआर के रूप में-log10 (q-value) होता है । काफी समृद्ध चोटियों उच्च गुना संवर्धन और महत्व मैट्रिक्स के साथ उन कर रहे हैं । आउटपुट पीक फ़ाइल का एक उदाहरण चित्रा 6Aमें दिखाया गया है । महत्वपूर्ण चोटियों का चयन कस्टम थ्रेसहोल्ड का उपयोग करने के बाद, encodes के भीतर चोटियों फ़िल्टरिंग23ब्लैकलिस्ट, और एक जीन प्रवर्तक क्षेत्र के भीतर चोटियों की पहचान (5 केबी ऊपर और पूरे जीन शरीर), एक "bigwig" फ़ाइल एक जीनोम में चोटियों को देखने के लिए उपयोगी है ब्राउज़र. सबसे समृद्ध चोटी क्षेत्रों प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी की एक उच्च संभाव्यता है । यह ज्ञात प्रतिलेखन कारक नियामक क्षेत्रों में चोटी की उपस्थिति की पुष्टि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्षेत्रों में चोटी अनुपस्थिति जहां प्रतिलेखन कारक बंधन की संभावना नहीं है महत्वपूर्ण है । चित्रा घमण्ड -ई के साथ और पीक संवर्धन के साथ-साथ अपने स्थान के साथ-साथ जीन क्षेत्रों के उदाहरण से पता चलता है प्रमोटर क्षेत्रों सांकेतिक शब्दों में बदलना करने के लिए संमान के साथ ।

चिप seq प्रयोग करने के लिए silico पूरक तरीकों में आकृति संवर्धन विश्लेषण और डी नोवो आकृति खोज रहे हैं. OPCs में Olig2 बंधन के बाद से पहले अध्ययन नहीं किया गया है, मोटर ंयूरॉन जनक कोशिकाओं और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में Olig2 चिप seq व्युत्पंन चोटियों de नोवो आकृति पहचान4,24के लिए इस्तेमाल किया गया । Olig2 de नोवो की पहचान की रूपांकनों व्यापक सांकेतिक शब्दों में बदलना आकृति डेटाबेस25 और आकृति संवर्धन विश्लेषण किया गया था । डी नोवो की पहचान की उच्च संवर्धन OLIG2 रूपांकनों और ज्ञात प्रतिलेखन कारक (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5, और ASCL1) रूपांकनों seq शुद्ध कोशिकाओं की चिप PDGFRα चोटियों में पाए गए । 30 de नोवो के एक संवर्धन एक E-value < ०.०५ के साथ रूपांकनों की खोज की थी । चित्रा 7 Olig2 के शीर्ष दो de नोवो की पहचान रूपांकनों से पता चलता है. इन दो डी नोवो की पहचान Olig2 रूपांकनों > में पाया गया चिप के 60%-seq चोटियों PDGFRα शुद्ध कोशिकाओं से प्राप्त की, ज्ञात रूपांकनों के अलावा ।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो का ओवरव्यू. PDGFRα सकारात्मक OPCs जन्मोत्तर माउस दिमाग से अलग थे और Olig2 चिप प्रयोग के अधीन थे । उपजी डीएनए टुकड़े चिप पुस्तकालय की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया । पुस्तकालय की गुणवत्ता के आकलन के बाद, नमूनों sequencing के लिए इस्तेमाल किया गया. डेटा सेट का विश्लेषण किया गया था, और चोटियों की पहचान की गई, OPC शुद्ध कोशिकाओं में संभावित Olig2 बाइंडिंग साइटों का संकेत. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: qPCR और immunostaining द्वारा immunopanned OPCs की शुद्धता का मूल्यांकन । (क) PDGFRα एंटीबॉडी immunopanned कोशिकाओं को वरीयता दी गई और immunostaining OPC वंश मार्कर NG2 एंटीबॉडी का उपयोग करके किया गया. नीला: DAPI, हरा: NG2 । स्केल बार = 10 µm. (B) शुद्ध OPCs (PDGFRα +) में और असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं (मिश्रण) में ंयूरॉन मार्कर Tuj1 के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर का मूल्यांकन किया गया । असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं में Tuj1 अभिव्यक्ति 1 के लिए सेट किया गया था । (ग) शुद्ध OPCs (PDGFRα +) में astrocyte मार्कर GFAP के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर और असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं (mix) में मूल्यांकन किया गया था । असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं में GFAP अभिव्यक्ति 1 के लिए सेट किया गया था । (D) शुद्ध OPCs (PDGFRα +) में OPC मार्कर PDGFRα की सापेक्षिक अभिव्यक्ति स्तर और असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं (mix) में मूल्यांकित किया गया था । असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं में PDGFRα अभिव्यक्ति 1 के लिए सेट किया गया था । (E) शुद्ध OPCs (PDGFRα +) में myelinating mature oligodendrocytes मार्कर मोग का सापेक्षिक व्यंजक स्तर और असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं (mix) में मूल्यांकित किया गया था । असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं में मोग अभिव्यक्ति 1 के लिए सेट किया गया था । (च) शुद्ध OPCs (PDGFRα +) में myelinating mature oligodendrocytes मार्कर Mbp का सापेक्षिक व्यंजक स्तर और असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं (mix) में मूल्यांकित किया गया था । असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं में Mbp अभिव्यक्ति 1 के लिए सेट किया गया था । (G) शुद्ध OPCs (PDGFRα +) में और असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं (mix) में microglia मार्कर Iba1 के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर का मूल्यांकन किया गया था । असंबद्ध मस्तिष्क कोशिकाओं में Iba1 अभिव्यक्ति 1 के लिए सेट किया गया था । B-G में डेटा तपसिल प्रयोगों और त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व करता है मानक त्रुटि इंगित करते हैं । T-परीक्षण विश्लेषण * P < 0.05 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Olig2 कम सेल चिप से एक पुस्तकालय का एक उदाहरण electropherogram. डबल आकार चयन के बाद, Olig2 चिप पुस्तकालय की गुणवत्ता एक microfluidic चिप केशिका ट्रो डिवाइस द्वारा विश्लेषण किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि गुणवत्ता नियंत्रण एक ५० बीपी के लिए परिणाम पढ़ें लंबाई कम सेल चिप-seq नमूना । (A) सारांश तालिका में पठन की कुल संख्या, खराब गुणवत्ता की संख्या पढ़ता है, अनुक्रम लंबाई, और समग्र GC सामग्री । (B) में विभिंन स्थितियों में आधार गुणवत्ता स्कोर के वितरण का संकेत देते हुए प्लॉट पढ़ता है । (C) पढ़ता में विभिंन स्थितियों में संभावित एडेप्टर सामग्री दिखाने वाला प्लॉट । (D) पंक्ति प्लॉट डुप्लिकेट अनुक्रम का प्रतिशत दर्शाता है । पढ़ता के बहुमत केवल एक बार पुस्तकालय के भीतर होते हैं जो दृश्यों से उत्पन्न, इसलिए एक कम दोहराव दर या उच्च पुस्तकालय जटिलता का संकेत. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: पीक कॉलिंग से पहले प्राप्त गुणवत्ता नियंत्रण मीट्रिक्स: bowtie2 संरेखण मीट्रिक, किनारा क्रॉस-सहसंबंध और टैग clonality. (A) पठन मैपर से प्राप्त संरेखण मीट्रिक्स । सबसे महत्वपूर्ण मीट्रिक्स विशिष्ट रूप से मैप किए गए पढ़े गए जोड़ों की संख्या होती है, जो "संरेखित concordantly ठीक 1 बार" के रूप में दर्शाई जाती है और संपूर्ण संरेखण दर. (B) हिस्टोग्राम टैग clonality दिखा रहा है । सलाखों के जीनोमिक पदों का प्रतिशत जहां टैग पाया गया संकेत मिलता है । (C) अच्छी गुणवत्ता डेटा का संकेत करने वाले परस्पर सहसंबंध प्लॉट का एक उदाहरण । लाल लाइनों ५० बीपीएस और प्रमुख टुकड़ा लंबाई में १३० बीपीएस पर पढ़ने की लंबाई चित्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: चिप-seq पीक क्षेत्रों और महत्वपूर्ण चिप के जीनोम ब्राउज़र विचारों-seq चोटियों अलग जीनोमिक स्थानों पर । ( A) पीक कॉलर के साथ पहचाने गए शिखर क्षेत्रों का उदाहरण । (ख) महत्वपूर्ण चिप-seq चोटियों Cspg4, एक ज्ञात OPC मार्कर जीन के जीन शरीर में पाया । (ख) कोई चिप-seq चोटियों या तो प्रवर्तक क्षेत्रों में या Mbp जीन के जीन निकायों के भीतर, परिपक्व oligodendrocytes के लिए एक मार्कर, (ग) Tubb3, एक न्यूरॉन सेल मार्कर, या (डी) GFAP, astrocytes के एक सेल मार्कर पाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: अत्यधिक समृद्ध de नोवो Olig2 की पहचान रूपांकनों PDGFRα-Olig2 चिप-seq चोटियों में पाया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्र: s चिप-seq डेटा सेट की तैयारी । (A) निर्देशिका आर्किटेक्चर परिभाषा । (B) अपुष्ट पठन गुणवत्ता नियंत्रण मीट्रिक की गणना करना । (C) की ट्रिमिंग पढ़ता है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

चित्र S2: संदर्भ जीनोम के लिए पढ़ता का संरेखण । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

चित्र S3: संरेखित की गुणवत्ता नियंत्रण पढ़ता, किनारा परस्पर सहसंबंध पता करने के लिए और टैग clonality निर्धारित करें । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

चित्र S4: पीक कॉलिंग. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

चित्रा S5: महत्वपूर्ण चोटियों की एनोटेशन. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

चित्र S6: जीनोम ब्राउज़र में पीक दृश्य के लिए bigwig को bedGraph फ़ाइल स्वरूप का रूपांतरण । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

चित्रा S7: डी नोवो आकृति खोज और आकृति संवर्धन. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

चित्र S8: bioinformatics चिप-seq डेटा के विश्लेषण का वर्णन प्रवाह-चार्ट. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

स्तनधारी जीन विनियमन नेटवर्क बहुत जटिल हैं । चिप-seq एक शक्तिशाली जीनोम-वाइड प्रोटीन-डीएनए बातचीत की जांच विधि है । इस प्रोटोकॉल शामिल कैसे माउस दिमाग से शुद्ध OPCs की एक कम संख्या का उपयोग करके Olig2 चिप-seq प्रदर्शन करने के लिए (के रूप में कम के रूप में प्रतिक्रिया प्रति २०००० कोशिकाओं) । इस प्रोटोकॉल के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम PDGFRα एंटीबॉडी के साथ immunopanning द्वारा माउस दिमाग से OPCs की शुद्धि है । PDGFRα लेपित प्लेटों के साथ OPCs के सकारात्मक चयन के लिए, OPCs अक्सर कमजोर PDGFRα लेपित प्लेटों को बांध । कई धुल जाने के बाद भी अब भी कुछ नॉन-अनुयाई कोशिकाएं बची हैं । यह एक खुर्दबीन के नीचे प्रत्येक डी-पंजाबियों धोने के बाद गैर अनुयाई कोशिकाओं की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । अगर अधिक डी-पंजाब वॉश गैर-अनुयाई कोशिकाओं की संख्या को कम करने में मदद नहीं करता है, यह चयनित कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए समय है, क्योंकि अतिरिक्त बहाकर संलग्न OPCs को उखाड़ फेंकना और शुद्ध कोशिकाओं की उपज को कम कर सकता है । हालांकि, अपर्याप्त बहाकर अंय मस्तिष्क कोशिकाओं के प्रकार के संदूषण में परिणाम हो सकता है । इसलिए, अलगाव के बाद हर समय, यह OPCs मार्कर NG2 qPCR के साथ immunostaining द्वारा अलग OPCs की पवित्रता का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है ज्ञात कोशिका के प्रकार विशिष्ट जीन जैसे न्यूरॉन्स के लिए Tuj1 , GFAP के लिए astrocytes , PDGFRα के लिए OPCs, Iba1 के लिए microglia, और मोग और MBP के लिए myelinating परिपक्व oligodendrocytes. के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, immunostaining परिणाम इंगित करता है कि शुद्ध कोशिकाओं के बहुमत NG2 धुंधला के लिए सकारात्मक हैं । इसके अलावा, कुछ क्लासिक सेल-प्रकार के ंयूरॉंस के लिए विशिष्ट मार्करों, astrocytes, microglia और myelinating परिपक्व oligodendrocytes प्रदर्शन undetectable या अत्यंत कम अभिव्यक्ति का स्तर शुद्ध OPCs में जब की तुलना में पतित मस्तिष्क सेल मिश्रण । PDGFRα शुद्ध OPCs में उच्च अभिव्यक्ति स्तर प्रदर्शित जब पतित मस्तिष्क कोशिका मिश्रण की तुलना में । immunopanning विधि का प्रयोग, microglia बहुत शुद्ध OPCs में कम कर रहे है पतित मस्तिष्क कोशिका मिश्रण की तुलना में, लेकिन संदूषण की एक छोटी राशि मौजूद है । यह प्रेक्षण दूसरों द्वारा पिछले प्रकाशनों के अनुरूप है7,8,26। इसके अतिरिक्त, जब पहले प्रकाशित रिपोर्टों के साथ की तुलना में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट एकल सेल निलंबन में मानकीकृत, कुशल और मस्तिष्क के ऊतकों के सुविधाजनक पृथक्करण के लिए इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है ।

शुद्ध OPCs के पार से जोड़ने के बाद, पार से जुड़े कोशिकाओं बर्फ ठंडा HBSS समाधान के साथ धोया जाना चाहिए और शेष चिप कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाना चाहिए, अंयथा एंटीबॉडी जीनोमिक डीएनए ठीक से वेग नहीं कर सकता ।

इस प्रोटोकॉल में अगला मुख्य चरण लायब्रेरी तैयारी है । चिप सामग्री के पीसीआर प्रवर्धन पुस्तकालय निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था । पुस्तकालय तैयारी के लिए पीसीआर साइकिल की संख्या डीएनए शुरू करने की राशि पर निर्भर करता है । एक अच्छा पुस्तकालय तैयारी इनपुट डीएनए राशि के सटीक ठहराव की आवश्यकता है । बहुत सारे या बहुत कुछ पीसीआर चक्र पुस्तकालय एकाग्रता और साथ ही जटिलता को प्रभावित कर सकते हैं, पीसीआर कलाकृतियों के लिए अग्रणी ।

यह immunoprecipitation के लिए कोशिकाओं की एक सीमित संख्या का उपयोग करते समय चिप-seq पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए चुनौतीपूर्ण है27. पहले इस्तेमाल किया मानक चिप प्रोटोकॉल 10 चिप के लिए immunoprecipitated डीएनए के एनजी-seq पुस्तकालय की तैयारी1,28की आवश्यकता है । हालांकि, प्रोटोकॉल यहां वर्णित सामांय २०,००० OPCs से Olig2 एंटीबॉडी द्वारा immunoprecipitated डीएनए के एनजी 2 उत्पंन करता है । डीएनए एक एकल कदम अनुकूलक इसके अलावा विधि द्वारा चिप seq पुस्तकालय तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो बढ़ाया immunoprecipitated डीएनए के picograms को प्रवर्धित संवेदनशीलता की अनुमति सक्षम बनाता है । वाणिज्यिक किट के संयोजन से, इस प्रोटोकॉल एक व्यावहारिक समाधान कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के आधार पर transcriptional कारकों के लिए चिप seq प्रदर्शन करने के लिए प्रदान करता है ।

महत्वपूर्ण बात, कम सेल चिप seq प्रोटोकॉल वर्णित चिप के लिए लागू है, प्राथमिक कोशिकाओं या दुर्लभ कोशिका आबादी में अंय प्रतिलेखन कारकों की seq के रूप में अच्छी तरह से । इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी को पहले IP प्रयोग द्वारा विशिष्ट रूप से मान्य करने की आवश्यकता होती है. एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बाध्यकारी गरीब परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे । इसके अतिरिक्त, यह कम से बाहर ले जाने के लिए बेहतर है सेल चिप-seq प्रयोग के साथ कोशिकाओं में एक उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के ब्याज की प्रतिलेखन कारक है ।

डेटा विश्लेषण के लिए, यह तय है जो मूल्यों को छानने के रूप में कट-नापसंद पीक कॉलिंग के बाद का उपयोग करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । विश्लेषण के उद्देश्यों के आधार पर, कड़े या अधिक आराम मापदंडों का इस्तेमाल किया जा सकता है । आम तौर पर, गुना-संवर्धन और या तो पी-मूल्य या एफडीआर का एक संयोजन किया जाता है । यदि अध्ययन के तहत प्रतिलेखन कारक के कुछ बाध्यकारी साइटों पहले से जाना जाता था, यह फ़िल्टरिंग थ्रेसहोल्ड का निर्धारण करने में मदद कर सकते हैं । प्रतिलेखन फैक्टर बंधन साइट डेटाबेस सार्वजनिक रूप से उपलब्ध चिप-seq प्रयोगों से अलग सेल लाइनों और शर्तों में व्युत्पंन29,30संकलित किया गया है । एक एक जीन के लिए खोज सकते है और जांच अगर प्रतिलेखन कारक बंधन साइटों पहले से पाया गया है । हालांकि, यह पता होना महत्वपूर्ण है कि प्रतिलेखन कारक बंधन साइटों कोशिका प्रकार और शर्तों के आधार पर अलग हैं ।

silico में पूरक चिप के लिए seq प्रयोग आकृति संवर्धन विश्लेषण और डी नोवो आकृति MEME-चिप20 या इसी तरह के कार्यक्रमों का उपयोग कर खोज रहे हैं । आकृति खोज एक व्यापक ज्ञात और डी नोवो व्युत्पंन आकृति डेटाबेस जैसे सांकेतिक शब्दों में बदलना रूपांकनों25 या Hocomoco डेटाबेस31की आवश्यकता है । Hocomoco सार्वजनिक रूप से उपलब्ध मानव और माउस चिप-seq प्रयोगों से पता चला रूपांकनों का एक डाटाबेस है । अगर परख प्रोटीन के लिए रूपांकनों अज्ञात हैं, de नोवो आकृति खोज नई रूपांकनों के रूप में चोटियों का एक महत्वपूर्ण अंश में दोहराव अनुक्रम पैटर्न प्रकट कर सकता है । प्रतिलेखन कारकों की क्षमता मिश्रित कार्रवाई का अनावरण किया जा सकता है जब अंय प्रतिलेखन कारकों के रूपांकनों भी परिणामस्वरूप चोटियों में समृद्ध हो पाए जाते हैं ।

समृद्ध पीक क्षेत्रों को नियंत्रण के रूप में उत्परिवर्ती या नॉकआउट कोशिकाओं के क्रोमेटिन का उपयोग करके मान्य किया जा सकता है । चिप-seq प्रतिलेखन कारक व्यक्त नहीं कोशिकाओं का उपयोग कर प्रदर्शन झूठी सकारात्मक चोटियों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है, भी चिह्नित "प्रेत चोटियों"३२के रूप में । झूठी सकारात्मक बाहर फ़िल्टर किया जाना चाहिए ।

यह भी transcriptomic डेटा के साथ परिणामी चिप-seq चोटियों की तुलना करने के लिए दिलचस्प है । PDGFRα-Olig2 चिप-seq चोटियों को पिछले प्रकाशन18से OPCs में जीन की अभिव्यक्ति के साथ तुलना की गई । इस रणनीति के बाद से OPCs में व्यक्त जीन सीमित किया जा सकता है Olig2 प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी के अलावा अंय तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, Olig2 प्रतिलेखन कारक एक जीन विनियामक क्षेत्र को बांध सकता है, लेकिन जीन कम जीन अभिव्यक्ति संभव निरोधात्मक तंत्र या सह की कमी के कारण स्तर हो सकता है, जीन प्रतिलेखन के लिए आवश्यक कारकों ।

चिप seq एक प्रतिलेखन कारकों और अंय प्रोटीन के जीनोम चौड़ा डीएनए बाध्यकारी साइटों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया विधि है । हालांकि, सह के विश्लेषण के माध्यम से प्रतिलेखन कारकों की घटना, शोधकर्ताओं ने पाया कि प्रतिलेखन कारकों अन्य प्रोटीन के साथ संबद्ध करने के लिए करते हैं सह-विनियामक मॉड्यूल३३. इसका मतलब यह है transcriptional कारकों और जीनोमिक डीएनए चिप द्वारा पता चला के बीच कुछ bindings-seq अप्रत्यक्ष और अंय प्रोटीन द्वारा पाटने हैं । इसलिए, अधिक सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए शोधकर्ताओं को एक से अधिक प्रतिलेखन कारक एक साथ अध्ययन पर विचार करना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

JQW, XD, RCDD, और वव स्वास्थ्य R01 NS088353 के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित थे; NIH अनुदान 1R21AR071583-01; Staman Ogilvie फंड-मेमोरियल हरमन फाउंडेशन; UTHealth मस्तिष्क पहल र CTSA UL1 TR000371; और टेक्सास प्रणाली तंत्रिका विज्ञान और Neurotechnology अनुसंधान संस्थान (अनुदान #362469) के विश्वविद्यालय से एक अनुदान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/ Equipment
Banderiaea simplicifolia lectin 1 Vector Laboratories # L-1100
Rat anti-PDGFRa antibody BD Bioscience # 558774
Neural tissue dissociation Kit (P) MACS Miltenyi Biotec # 130-092-628
Accutase STEMCELL technologies # 07920
TRIzol Thermo Fisher # 15596026
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody Millipore # AB5320
Bioruptor Pico sonication device Diagenode # B01060001
True MicroChIP kit Diagenode # C01010130
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Fisher # 15593031
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit MACHEREY-NAGEL # 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher # P11496
DNA SMART ChIP-Seq kit Clontech Laboratories # 634865
Agencourt AMPure XP Beckman Voulter # A63880
GlycoBlue Thermo Fisher # AM9516
pico-green Thermo Fisher # P11496
D-PBS Thermo Fisher # 14190-144
SYBR Green master mix Bio-Rad Laboratories # 1725124
DMEM/F12 Fisher Scientific # 11-320-033
Penicillin-Streptomycin (P/S) Fisher Scientific # 15140122
N-2 Supplement Fisher Scientific # 17502048
B-27 Supplement Fisher Scientific # 17504044
insulin Sigma # I6634 Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl.
Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) Sigma # A4161 Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4
Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) EMD Millipore # GF003
HUMAN PDGF-AA VWR # 102061-188
poly-D-lysine VWR # IC15017510 Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using.
Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm VWR # 25373-100
Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm VWR # 25373-187
HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red Fisher Scientific # 14185-052
Trypan Blue Stemcell Technologies # 07050
protease inhibitor cocktail Sigma # 11697498001
Software
FastQC [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads
Trimmomatic 0.33 [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic Trimming and filtering raw reads
GENCODE mm10 ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz Mouse reference genome
Bowtie2 2.2.4 [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml Aligning reads to a reference genome
SAMTools 1.5 [13] http://samtools.sourceforge.net/ Converting SAM file into BAM format
HOMER 4.9.1 [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols
R 3.2.2 [15] https://www.R-project.org/ Programming scripts and running functions
SPP 1.13 [16] https://github.com/hms-dbmi/spp Creating a strand cross-correlation plot
MACS2 2.2.4 [17] https://github.com/taoliu/MACS Finding regions of ChIP enrichment over control
BEDTools 2.25 [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Genome arithmetics
bedGraphToBigWig http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ Converting bedGraph file into bigwig
IGV browser 2.3.58 [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks
Microsoft Excel Spreasheet program
ENCODE's blacklist https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists Filtering peaks
mm10.chrom.sizes http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. Converting bedGraph file into bigwig
ENCODE's motif database [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ Comprehensive motif database required for motif enrichment
MEME-ChIP [20] http://meme-suite.org/index.html Motif enrichment analysis and motif discovery
Primer names used for qPCR Primer sequences used for qPCR
Mbp-F: CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R: AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F: ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R: GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F: GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R: TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-F ATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-R CATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-F TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-R GATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-F AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-R GTCCCTCCACGGTACTCCT

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References

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Dong, X., Cuevas-Diaz Duran, R., You, Y., Wu, J. Q. Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRα+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis. J. Vis. Exp. (134), e57547, doi:10.3791/57547 (2018).

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