L'utilizzo degli ultrasuoni guidati l'impianto cellulare diretto del tessuto per l'istituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare iniezione ultrasuono-guida del neuroblastoma (NB) e cellule (ES) il sarcoma di Ewing (stabilito linee cellulari e cellule tumorali derivate dal paziente) biologicamente rilevanti siti per creare modelli preclinici affidabili per il cancro ricerca.
Abstract
Test preclinici di terapie anticancro si basa su modelli di xenotrapianto pertinenti che imitano le tendenze innate del cancro. Modelli standard fianco sottocutaneo vantaggi procedurali facilità e la capacità di progressione del tumore monitor e risposta senza imaging invasivo. Tali modelli sono spesso incoerenti nei test clinici traslazionale e con limitate caratteristiche biologicamente rilevanti con bassa propensione a produrre metastasi, come c’è una mancanza di un microambiente nativo. In confronto, modelli di xenotrapianto ortotopici presso siti nativi del tumore sono stati indicati per imitare il microambiente tumorale e replicare le caratteristiche di malattia importante come diffusione metastatica distante. Questi modelli richiedono spesso noiose procedure chirurgiche con periodi prolungati di tempo e recupero anestetici. Per risolvere questo problema, i ricercatori del cancro hanno recentemente utilizzato tecniche di iniezione ultrasuono-guida per stabilire modelli di xenotrapianto del cancro per gli esperimenti preclinici, che permette per istituzione rapida e affidabile di tessuto-regia di modelli murini. Visualizzazione di ultrasuono fornisce anche un metodo non invasivo per la valutazione longitudinale del tumore attecchimento e crescita. Qui, descriviamo il metodo per iniezione ultrasuono-guida delle cellule tumorali, che utilizzano la ghiandola surrenale per NB e capsula renale sub per ES. Questo approccio mini-invasivo supera l’impianto noioso chirurgia a cielo aperto delle cellule tumorali nel tessuto-specifici percorsi di crescita e di metastasi e sporadicamente periodi di recupero morboso. Descriviamo l’utilizzo di linee cellulari stabilizzate e di linee cellulari derivate paziente per iniezione ortotopico. Pre-fatte kit commerciali sono disponibili per la dissociazione del tumore e luciferasi tagging delle cellule. Iniezione di sospensione cellulare utilizzando Consiglio di immagine fornisce una piattaforma come minimo dilagante e riproducibile per la creazione di modelli preclinici. Questo metodo viene utilizzato per creare modelli preclinici affidabili per altri tumori, come la vescica, fegato e pancreas, esemplificando il suo potenziale non sfruttato per numerosi modelli di cancro.
Introduction
Modelli animali dello xenotrapianto sono strumenti essenziali per studi preclinici di terapie anticancro. Gli xenotrapianti murini standard si basano sull’impianto sottocutaneo fianco delle cellule, fornire un sito efficiente e facilmente accessibile per controllare la crescita del tumore. Lo svantaggio dei modelli sottocutanei è la loro mancanza di caratteristiche biologiche del tumore-specifici, che possono limitare la loro potenziale riprodurrsi per metastasi1. Tali limitazioni sono superate mediante l’utilizzo degli xenotrapianti di orthotopic in quale tumore le cellule sono innestate in siti di tessuto nativo, fornendo un microambiente pertinente con potenziale metastatico2. Modelli di xenotrapianto ortotopici mantengono originale caratteristiche biologiche e forniscono modelli affidabili per droga preclinici discovery3,4. Le cellule tumorali utilizzate per l’impianto diretto di tessuto sono linee cellulari stabilizzate o cellule paziente-derivate da tumori di pazienti. Gli xenotrapianti stabiliti da linee cellulari del cancro possono esibire alta divergenza genetica del tumore primario rispetto al paziente gli xenotrapianti derivata5. Detto questo, l’istituzione degli xenotrapianti orthotopic paziente-derivato è diventato lo standard preferito per testare nuove terapie nella scoperta della droga di cancro.
Nel neuroblastoma (NB) di cancro pediatrico, modelli di xenotrapianto ortotopici ricapitolano biologia del tumore primario e sviluppano metastasi ai tipici siti di NB diffondere6,7. NB si sviluppa nella ghiandola adrenale o lungo la catena simpatica paravertebral. I metodi più comuni di orthotopic impianto richiedono procedure chirurgiche trans-addominale aperte. Tali metodi sono spesso noiosi, hanno un’elevata morbilità animale e periodi di recupero complesso. Ecografia ad alta risoluzione è stato recentemente utilizzato per l’impianto diretto di tessuto delle cellule del tumore nello sviluppo di diversi modelli murini per cancro ricerca8,9. La tecnica è affidabile, riproducibile, efficiente e sicuro per la creazione di tumore metastatico pertinenti xenotrapianti10,11.
L’istituzione degli xenotrapianti di cancro pediatrico di ultrasuono-guida destinazione organo ago e localizzazione impianto di linee cellulari e cellule tumorali paziente-derivato è dimostrata11. La tecnica è stata utilizzata per NB mirati alla ghiandola surrenale murina. Sarcoma di Ewing (ES) è principalmente un cancro osseo, comunemente-veduto nelle ossa lunghe come il femore e le ossa pelviche12. Rapporti di caso hanno dimostrato che per determinare se la crescita di un cancro principalmente osseous è realizzabile in tessuto renale, una posizione capsulare renale sub è stato scelto per l’impianto di orthotopic13. L’impianto delle cellule capsulare renale sub delle cellule del tumore è stata utilizzata come un promettente modello per studiare le metastasi spontanee per ES14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ultrasuono-guida l’impianto delle cellule NB ed ES è un metodo efficace e sicuro per stabilire gli xenotrapianti murini affidabili per studi preclinici nella biologia del cancro. Fondamentale per il successo di ultrasuono-guida del tessuto-mirati l’impianto è la presenza e la disponibilità di personale qualificato con esperienza nella localizzazione anatomica dell’organo di interesse e nella iniezione stereotactic delle cellule del tumore.
La dissociazione del tessuto del tumore si è rivel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro ha ricevuto sostegno da Robert Wood Johnson Foundation/Amos medica sviluppo programma, Taubman ricerca docenti e la sezione di chirurgia pediatrica, The University of Michigan. Gli autori desiderano ringraziare Kimber Converso-Baran e Dr. Marcus Jarboe per l’assistenza con procedure di iniezione ultrasuono e la piattaforma di imaging. Ringraziamo Paul Trombley per la sua assistenza con grafica di figura. Ringraziamo anche il reparto di radiologia presso l’Università del Michigan per l’uso del centro per l’Imaging molecolare e il nucleo di Imaging del tumore, che sono in parte supportata da NIH di centro completo del cancro, concedere P30 CA046592. L’Università del Michigan fisiologia Phenotyping Core che è in parte sostenuto da finanziamenti provenienti dal NIH (OD016502) e il centro cardiovascolare Frankel. L’autenticazione di linea cellulare è stato fatto a IDEXX Rica Bioresearch strutture, Columbia, MO. Ringraziamo Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody e il programma di oncologia tumore solido Mott. Nostri pazienti e le famiglie con gratitudine sono riconosciute per la loro ispirazione, il coraggio e il supporto continuo della nostra ricerca.
Materials
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
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