En protokol til in vitro- induktion i endothelial-mesenchymale overgang (EndMT), som er nyttige for efterforskningen cellulær signalering veje involveret i EndMT, er beskrevet. I denne eksperimentelle model, er EndMT foranlediget af behandling med TGF-β i endothelial celler, MS-1.
Fænotypisk plasticitet i endothelial celler ligger til grund for systemudvikling af hjerte-kar-, hjerte-kar-sygdomme og forskellige betingelser forbundet med orgel fibrose. I disse betingelser erhverve differentieret endotelceller mesenchymale-lignende fænotyper. Denne proces kaldes endotel-mesenchymale overgang (EndMT) og er kendetegnet ved downregulation i endothelial markører, opregulering af mesenchymale markører og morfologiske ændringer. EndMT er foranlediget af flere signaling veje, herunder omdanne vækst faktor (TGF)-β, Wnt og hak, og reguleret af molekylære mekanismer ligner dem af epitel-mesenchymale overgang (EMT) vigtig for gastrulation, væv fibrose, og kræft metastaser. Forstå mekanismerne i EndMT er vigtigt at udvikle diagnostiske og terapeutiske strategier rettet mod EndMT. Robust induktion af EndMT i vitro er nyttige til at karakterisere fælles gene expression signaturer, identificere druggable molekylære mekanismer og skærmen for modulatorer af EndMT. Her, beskriver vi en in vitro- metode til induktion af EndMT. MS-1 mus i bugspytkirtlen mikrovaskulære endotelceller underkastes EndMT efter langvarig udsættelse for TGF-β og vise opregulering af mesenchymale markører og morfologiske ændringer samt induktion af flere inflammatoriske kemokiner og cytokiner. Metoder til analyse af mikroRNA (miRNA) graduering er også inkluderet. Disse metoder giver en platform til at undersøge mekanismerne bag EndMT og bidrag af miRNAs til EndMT.
Endotel-mesenchymale overgang (EndMT) er den proces, hvorved en differentieret endotel celle gennemgår en række forskellige molekylære ændringer, hvilket resulterer i en fibroblast-lignende mesenchymale celler1. EndMT blev oprindeligt beskrevet som en endotel celle transformation under udviklingen af hjertet2,3. I tidlig udvikling af hjertet består hjerte rør af en indre endokardiet og en ydre myokardiet. Disse to lag er adskilt af et lag af ekstracellulære matrix kaldes den kardiale jelly. De embryonale endokardial celler, som erhverver endotel celle markører, transit til mesenchymale celler, invadere de underliggende hjerte gelé og fremme dannelsen af den kardiale puder, giver grundlaget for atrieventrikelklapperne og septum og semilunar ventiler. Desuden er EndMT blevet foreslået for at være kilder til pericytes og vaskulære glatte muskelceller i andre embryonale vaskulære systemer, herunder koronar fartøjer, abdominal aorta og lungepulsåren4,5,6. Derudover er EndMT impliceret i fysiologiske angiogene spiring7.
Akkumulere beviser har foreslået, at EndMT også er involveret i flere hjerte-kar-sygdomme og andre sygdomme1,8. EndMT-associerede betingelser omfatter vaskulære forkalkning, åreforkalkning, pulmonal arteriel hypertension, bundløs misdannelser, orgel fibrose, vene graft remodeling, allograft dysfunktion i nyre transplantation og kræft8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. en nylig rapport beskrev, at flere molekylære EndMT markører kan være et redskab til diagnose og prognose forudsigelse af renal graft dysfunktion i nyre transplantation17. Graduering af EndMT-relaterede cellulær signalering veje har vist sig at forbedre adskillige sygdomstilstande, herunder hjerte fibrose og vene graft remodeling i dyre modeller8,15. Derfor er forstå mekanismerne underliggende EndMT vigtigt at udvikle diagnostiske og terapeutiske strategier rettet mod EndMT.
EndMT er karakteriseret ved tab af celle-celle vejkryds, forøgelse af vandrende potentiale, downregulation i endothelial-specifikke gener som VE-cadherin, og opregulering af mesenchymale gener herunder α-glat muskel aktin (α-SMA). Desuden er EndMT og epitel-mesenchymale overgang (EMT), en lignende proces, der konverterer epitelceller mesenchymale celler, forbundet med ændret produktion af forskellige ekstracellulære matrix komponenter, som kan bidrage til udviklingen af væv fibrose8,19.
For nylig, flere in vitro- undersøgelser af EndMT har belyst detaljer molekylære mekanismer i EndMT15,20. EndMT er foranlediget af forskellige signaling veje herunder omdanne vækst faktor (TGF)-β, Wnt, og hak1. Blandt dem spiller TGF-β afgørende roller i induktion af både EMT og EndMT. Lang tids udsættelse for TGF-β resultater i EndMT i forskellige endotelceller, i EndMT, mens korte eksponering ser ud til at være utilstrækkelig21. Vi har her beskrevet en enkel protokol for EndMT induktion, i hvilke MILE SVEN 1 (MS-1) mus i bugspytkirtlen mikrovaskulære endotelceller gennemgå EndMT i vitro efter langvarig udsættelse for TGF-β20. I denne model, kan flere downstream analyser udføres for at undersøge hallmark egenskaber i EndMT, herunder morfologiske ændringer, downregulation i endothelial markører, opregulering af mesenchymale markører og inflammatoriske gener, cytoskeletal rearrangementer, og kollagen gel sammentrækning.
MicroRNA (miRNAs) er ~ 22 nt små lovgivningsmæssige RNA’er, der direkte posttranskriptionelle undertrykkelse af forskellige mRNA mål22,23. Gennem seed sekvens-medieret mål anerkendelse, miRNAs undertrykke hundredvis af target gener og modulere forskellige cellulære funktioner såsom Celledifferentiering, spredning og motilitet. Dette er også tilfældet for regulering af EMT og EndMT, og flere miRNAs er blevet rapporteret som regulatorer af EMT og EndMT24,25. Den EndMT model præsenteret i denne gennemgang kan let kombineres med miRNA graduering procedurer til test af miRNAs rolle i EndMT. Denne undersøgelse opsummerer vores eksperimentelle procedurer for at undersøge TGF-β-induceret EndMT i MS-1 celler og omfatter også sammenligning af EndMT induktion af TGF-β forhold i andre endotelceller.
Det er blevet rapporteret, at aktiveret Ras og TGF-β behandling for 24 h induceret EndMT i MS-1 celler, mens TGF-β alene undladt at fremkalde EndMT i denne korte periode21. Konsekvent, konstaterede vi, at TGF-β væsentligt induceret EndMT efter længere behandling (48-72 h) i MS-1 celler20. EndMT er gentagne gange blevet observeret efter langvarig behandling med TGF-β (2-6 dage) i forskellige endotelceller såsom menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC), mennes…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Zea Borok og Kohei Miyazono for forslag under forberedelse af manuskript. H.I.S. og M.H. understøttes af Uehara Memorial Foundation Research Fellowship, og H.I.S. er understøttet af Osamu Hayaishi Mindelegat for Study Abroad. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Takeda Science Foundation (A.S.).
MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |