Ett protokoll för in vitro- induktion av endothelial-mesenkymala transition (EndMT), som är användbar för att undersöka cellulära signalvägar involverade i EndMT, beskrivs. I denna experimentella modell induceras EndMT genom behandling med TGF-β i MS-1 endotelceller.
Fenotypisk plasticitet av endotelceller ligger bakom hjärt-systemutveckling, hjärt-och kärlsjukdomar och olika villkor som är förknippade med orgel fibros. I dessa villkor förvärva differentierade endothelial celler mesenkymala-liknande fenotyper. Denna process kallas endotel-mesenkymala övergången (EndMT) och kännetecknas av nedreglering av endothelial markörer, uppreglering av mesenkymala markörer och morfologiska förändringar. EndMT framkallas av flera signalvägar, inklusive omvandla tillväxtfaktor (TGF)-β, Wnt, och Notch, och regleras av molekylära mekanismer liknar epitelial-mesenkymala övergången (EMT) viktigt för gastrulation, vävnad fibros, och cancer metastaser. Förstå mekanismerna bakom EndMT är viktigt att utveckla diagnostiska och terapeutiska metoder inriktade EndMT. Robust induktion av EndMT in vitro- är användbart att karakterisera vanliga gen uttryck signaturer, identifiera druggable molekylära mekanismer och skärm för modulatorer av EndMT. Här beskriver vi en in vitro- Metod för induktion av EndMT. MS-1 mus bukspottskörteln mikrovaskulära endotelceller genomgår EndMT efter långvarig exponering för TGF-β och Visa uppreglering av mesenkymala markörer och morfologiska förändringar såväl induktion av flera inflammatoriska chemokiner och cytokiner. Metoder för analys av mikroRNA (miRNA) moduleringen ingår också. Dessa metoder ger en plattform för att undersöka mekanismerna bakom EndMT och bidrag MicroRNA till EndMT.
Endothelial-mesenkymala övergången (EndMT) är den process genom vilken en differentierad endothelial cellen genomgår en mängd molekylära förändringar, vilket resulterar i en fibroblast-liknande mesenkymala cell1. EndMT beskrevs ursprungligen som en endotelceller omvandling under utvecklingen av hjärtat2,3. I tidig utveckling av hjärtat består hjärtat röret av en inre endocardium och en yttre myokardiet. Dessa två lager skiljs åt av ett lager av extracellulär matrix som kallas hjärt gelé. De endokardiella embryoceller, som förvärvar endotelceller markörer, transitering till mesenkymala celler, invadera underliggande hjärt gelé och främja bildandet av hjärt kuddarna, som tillhandahåller grunden för atrioventrikulärt ventiler och septum och semilunar ventiler. Dessutom har EndMT föreslagits vara källor av pericyter och vaskulära glatta muskelceller i andra embryonala vaskulära system inklusive koronar fartyg, bukaorta och lungartären4,5,6. EndMT är dessutom inblandad i fysiologiska angiogena groning7.
Ackumulerande bevis har föreslagit att EndMT också är involverad i flera hjärt-och kärlsjukdomar och andra sjukdomar1,8. EndMT-associerade villkor omfattar vaskulär förkalkning, åderförkalkning, pulmonell arteriell hypertension, cavernous missbildningar, orgel fibros, ven transplantat remodeling, transplantatavstötning dysfunktion i njurtransplantation och cancer8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. en färsk rapport beskrivs att flera molekylära EndMT markörer kan vara ett verktyg för diagnos och prognos Prediktion av nedsatt transplantatdysfunktion i njur transplantation17. Modulering av EndMT-relaterade cellulära signalvägar har visat sig lindra flera sjukdomstillstånd inklusive hjärtfibros och ven transplantat remodeling i djur modeller8,15. Därför är förstå mekanismerna underliggande EndMT viktigt att utveckla diagnostiska och terapeutiska strategier inriktade EndMT.
EndMT kännetecknas av förlust av cell-cell korsningar, flyttande potentiella ökningen, nedreglering av endothelial-specifika gener som VE-cadherin och uppreglering av mesenkymala gener inklusive α-smooth muscle aktin (α-SMA). Dessutom är EndMT och epitelial-mesenkymala övergång (EMT), en liknande process som konverterar epitelceller till mesenkymala celler, associerade med förändrad produktion av olika extracellulär matrix komponenter, som kan bidra till utvecklingen av vävnad fibros8,19.
Flera in vitro- studier av EndMT har nyligen klarlagts Detaljer av molekylära mekanismer av EndMT15,20. EndMT framkallas av olika signalvägar inklusive omvandla tillväxtfaktor (TGF)-β, Wnt, och Notch1. Bland dem spelar TGF-β avgörande roller i induktion av både EMT och EndMT. I EndMT, långvarig exponering för TGF-β resultat i EndMT i olika endotelceller, medan kort exponering tycks vara otillräckliga21. Vi beskrivit här ett enkelt protokoll för EndMT induktion, där MILE SVEN 1 (MS-1) mus bukspottskörteln mikrovaskulära endotelceller genomgår EndMT in vitro- efter långvarig exponering för TGF-β20. I denna modell, kan flera efterföljande analyser utföras för att undersöka hallmark funktioner i EndMT, inklusive morfologiska förändringar, nedreglering av endothelial markörer, uppreglering av mesenkymala markörer och inflammatoriska gener, cytoskeletal omflyttningar och kollagen gel kontraktion.
MikroRNA (Mirna) är ~ 22 nt små reglerande RNAs att direkt från förtryck av olika mRNA mål22,23. Genom utsäde sekvens-medierad prismalås, MicroRNA undertrycka hundratals målgener och modulera olika cellulära funktioner såsom celldifferentiering, spridning och motilitet. Detta är också fallet för förordning av EMT och EndMT, och flera MicroRNA har rapporterats som tillsynsmyndigheter EMT och EndMT24,25. Den EndMT modellen presenteras i denna översyn kan enkelt kombineras med miRNA modulering förfaranden att testa MicroRNA roller i EndMT. Denna översyn summerar våra experimentella rutiner för att undersöka TGF-β-inducerad EndMT i MS-1 celler och även innehåller jämförelse av villkorar av EndMT induktion av TGF-β i andra endotelceller.
Det har rapporterats att aktiverade Ras och TGF-β behandling för 24 h inducerad EndMT i MS-1 celler, medan TGF-β ensam misslyckades att framkalla EndMT i denna korta period21. Konsekvent, observerade vi att TGF-β väsentligen inducerad EndMT efter längre behandling (48-72 h) i MS-1 celler20. EndMT har observerats flera gånger efter långvarig behandling med TGF-β (2 – 6 dagar) i olika endothelial celler såsom mänskliga umbilical ven endotelceller (HUVEC), mänskl…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Zea Borok och Kohei Miyazono för förslag i beredning av manuskriptet. H.I.S. och M.H. stöds av den Uehara Memorial Foundation Research Fellowship och H.I.S. stöds av Osamu Hayaishi Memorial stipendium för studier utomlands. Detta arbete stöds av ett bidrag från Takeda Science Foundation (A.S.).
MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |