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Elettrochimico rilevamento di deuterio isotopo effetto cinetico su extracellulare di trasporto dell'elettrone nella Shewanella oneidensis MR-1

DOI:

10.3791/57584

⸱

April 16th, 2018

 ,  , 
1Department of Applied Chemistry, University of Tokyo, 2Global Research Center for Environment and Energy based on Nanomaterials Science, National Institute for Materials Science

In This Article

Summary

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Qui presentiamo un protocollo della intero-cellula elettrochimici esperimenti per studiare il contributo del trasporto di protoni per il tasso di trasporto dell'elettrone extracellulare attraverso il membrana esterna citocromi complessi di Shewanella oneidensis MR-1.

Abstract

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Diretta rilevazione elettrochimica di c-tipo complessi citocromo incorporati nella membrana esterna batterica (membrana esterna c-tipo complessi citocromo; OM c- Cyts) ha recentemente è emerso come un nuovo metodo analitico della intero-cellula per caratterizzare il trasporto dell'elettrone batterico dalla catena respiratoria all'esterno delle cellule, definito come il trasporto dell'elettrone extracellulare (EET). Mentre la via e la cinetica del flusso dell'elettrone durante la reazione di EET sono stati indagati, un metodo elettrochimico di cellule intere di esaminare l'impatto del trasporto dei cationi associato EET non è ancora stato stabilito. Nello studio presente, un esempio di una tecnica biochimica per esaminare l'effetto di isotopo cinetico di deuterio (KIE) su EET attraverso OM c- Cyts utilizzando un microbo modello, Shewanella oneidensis MR-1, è descritto. KIE sul processo EET può essere ottenuto se la EET attraverso OM c- Cyts agisce come la tappa limitante nella produzione corrente microbica. A tal fine, prima dell'aggiunta di D2O, il supernatante è stato sostituito con fresco che contenevano una quantità sufficiente del donatore dell'elettrone per sostenere il tasso di reazioni metaboliche a Monte e per rimuovere le cellule planctoniche da un'uniforme monostrato biofilm sull'elettrodo di lavoro. Metodi alternativi per confermare il tasso-di limitazione passo nella produzione corrente microbica come EET attraverso OM c- Cyts inoltre sono descritti. La nostra tecnica di analisi elettrochimica della intero-cellula per studiare la cinetica del trasporto di protoni può essere applicato ad altri ceppi microbici elettroattivi.

Introduction

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Tecniche elettrochimiche direttamente caratterizzare una proteina redox in una cellula batterica intatta sono recentemente emersi dalla scoperta del metallo-riducentesi di ceppi microbici, quali S. oneidensis MR-1 o Geobacter sulfurreducens PCA, che hanno complessi di citocromo c-tipo di membrana esterna (OM c-Cyts) esposti al cellulare esterna1,2,3,4,5. L' OM c- Cyts mediano il trasporto di elettroni dalla catena respiratoria a substrati solidi trova extracellularly. Questo trasp....

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Protocol

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1. formazione di un Biofilm monostrato di S. oneidensis MR-1 su un elettrodo ITO (Figura 1)

Nota: Per evitare la contaminazione del reattore elettrochimico con altri microbi, tutti i media, implementa e componenti del reattore elettrochimico dovrebbero essere sterilizzati in anticipo. Quando usando le cellule di S. oneidensis MR-1 e costruire i reattori elettrochimici, tutte le procedure devono essere effettuate su un banco pulito.

  1. Coltura di cellule di S. oneidensis MR-1
    Nota: Un biofilm monostrato di S. oneidensis MR-1 è stato formato su un ITO elettrodo seguen....

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Results

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Dopo 25 h di potenziale applicazione a + 0,4 V (contro di lei), si formò un biofilm monostrato sull'elettrodo di lavoro di vetro di ITO, che precedentemente è stato confermato da una microscopia elettronica di esame o un microscopio confocale4. Il corso di tempo rappresentativo della produzione corrente dal S. oneidensis MR-1 durante la formazione di un biofilm monostrato è illustrato nella Figura 2. Anche se la corrente varia.......

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Discussion

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Nostra analisi elettrochimica della intero-cellula ha diversi vantaggi tecnici rispetto con elettrochimica della proteina. Mentre la purificazione della proteina richiede lunghe procedure multifase, il nostro metodo di cellule intere prende un giorno di formazione di biofilm auto-organizzata dopo coltura cellulare. Per ottenere una stabile interazione tra OM c- Cyts e l'elettrodo, abbiamo bisogno solo la sterilizzazione e la pulizia della superficie dell'elettrodo; non richiede modifiche di elettrodo per organiz.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione per appositamente ricerca promossa dalla società Giappone per numero di promozione della scienza (JSPS) KAKENHI Grant 24000010, 17H 04969 e JP17J02602, il noi Office del Naval Research globali (N62909-17-1-2038). Y.T. è un ricercatore di JSP e supportato da JSP attraverso il programma per scuole laureato leader (MERIT).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cilindro di vetroN/AN/ARealizzato su misura, utilizzato come
coperchio e base in PTFEelettrochimico N/AN/ARealizzato su misura, utilizzato come copertura e fondazione del reattore elettrochimico
Gomma butilicaN/AN/ARealizzato su misura, inserito tra ogni componente del reattore elettrochimico
SeptaGL Science3007-16101Utilizzato come porta di iniezione del reattore elettrochimico
Elettrodo di ossido drogato con stagno di indio (ITO)GEOMATECNo.0001Utilizzato come elettrodo di lavoro, elettrodo saturo 5Ω/sq
Ag/AgCl KClHOKUTO DENKOHX-R5Utilizzato come elettrodo di riferimento, Φ Filo di platino da 0,30 mm
Il Nilaco CooporationPT-351325Utilizzato come controelettrodo
Luria-Bertani (LB) Brodo, MillerBecton, Dichkinson and Company244620Mezzo per la precoltivazione di S. oneidensis MR-1
Bacto agarBecton, Dichkinson and Company214010
Antrachinone-1-solfonato (&alfa;-AQS)TCIA1428
Flavina mononucleotide (FMN)Wako184-00831
NaHCO3Wako191-01305Utilizzato per il mezzo definito (DM)
CaCl2 · 2H2OWako031-00435Utilizzato per DM
NH4ClWako011-03015Utilizzato per DM
MgCl2 · 6H2OWako135-00165Utilizzato per DM
NaClWako191-01665Utilizzato per DM
2-[4-(2-idrossietil)-1-piperazinil] acido etansolfonico (HEPES)DOJINDO346-08235Utilizzato per DM
Soluzione di lattato di sodioWako195-02305
Estratto di lievito BactoBecton, Dichkinson and Company212750
Ossido di deuterio (D, 99,9%)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-PKAdditivo per esperimenti sull'effetto isotopico cinetico
IncubatoreTOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUtilizzato per agitatore di pre-coltivazione
TAITECNR-3Utilizzato per la pre-coltivazione
Macchina per autoclaveTOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500Utilizzato per la sterilizzazione del reattore elettrochimico e del fluido
Banco pulitoSANYOMCV-91BNFUtilizzato per prevenire la contaminazione del reattore elettrochimico e del mezzo con altri microbi Separatore
centrifugaEppendorf5430RVelocità di rotazione fino a 6000&volte; g è necessario
Generatore di azoto gassosoPuequ CO. LTD.PNTN-2La bombola di azoto può essere utilizzata anche al posto del generatore di gas
Spettrometro UV-VISSHIMADZUUV-1800Utilizzato per l'ottimizzazione della densità cellulare
PotenziostatoBioLogicVMP3Utilizzato per la formazione di biofilm e gli esperimenti sull'effetto isotopico cinetico
Circolatore d'acqua termicoAS ONETR-1AUtilizzato per il mantenimento della temperatura del reattore elettrochimico
Gabbia di FaradayHOKUTO DENKOHS-201SUtilizzata per esperimenti elettrochimici
del reattore a

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
  2. Bretschger, O., et al.

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Deuterium Kinetic Isotope EffectExtracellular Electron TransportOuter Membrane c Type CytochromesShewanella oneidensis MR 1Whole Cell Electrochemical AssayProton Transport KineticsElectrochemical CultivationAlpha AQS MediatorFlavin Molecule AdditionMicrobial Current Production

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