यहां हम Shewanella oneidensis एमआर-1 में बाहरी झिल्ली cytochromes परिसर के माध्यम से extracellular इलेक्ट्रॉन परिवहन की दर के लिए प्रोटॉन परिवहन के योगदान का अध्ययन करने के लिए पूरे सेल विद्युत प्रयोगों का एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली (बाहरी झिल्ली सी-प्रकार cytochrome परिसरों में एंबेडेड सीप्रकार cytochrome परिसरों की प्रत्यक्ष विद्युत पता लगाने; ओम सी-Cyts) हाल ही में एक उपंयास पूरे सेल विश्लेषणात्मक विधि के रूप में उभरा है श्वसन श्रृंखला से कोशिका बाहरी, extracellular इलेक्ट्रॉन परिवहन (ईत) के रूप में संदर्भित करने के लिए बैक्टीरियल इलेक्ट्रॉन परिवहन की विशेषता है । जबकि ईत प्रतिक्रिया के दौरान इलेक्ट्रॉनक प्रवाह के मार्ग और कैनेटीक्स की जांच की गई है, ईत से संबद्ध कटियन परिवहन के प्रभाव की जांच करने के लिए एक पूरी-सेल विद्युत पद्धति अभी तक स्थापित नहीं की गई है. वर्तमान अध्ययन में, एक जैव रासायनिक तकनीक का एक उदाहरण ओम सी-Cyts के माध्यम से ईत पर ड्यूटेरियम काइनेटिक आइसोटोप प्रभाव (कीे) की जांच करने के लिए एक मॉडल सूक्ष्म जीव, Shewanella oneidensis एमआर-1, का उपयोग करते हुए वर्णित है । ईत प्रक्रिया पर कीे प्राप्त की जा सकती है यदि ओम सी-Cyts के माध्यम से ईत के माइक्रोबियल वर्तमान उत्पादन में दर सीमित कदम के रूप में कार्य करता है । कि अंत करने के लिए, डी2के अलावा से पहले O, supernatant समाधान नए सिरे से इलेक्ट्रॉन दाता की पर्याप्त राशि युक्त मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया गया था ऊपर चयापचय प्रतिक्रियाओं की दर का समर्थन है, और एक समान से planktonic कोशिकाओं को दूर monolayer काम इलेक्ट्रोड पर फिल्म । वैकल्पिक तरीकों की पुष्टि करने के लिए दर को सीमित कदम में माइक्रोबियल वर्तमान उत्पादन के माध्यम से ईत के रूप में ओम ग-Cyts भी वर्णित हैं । प्रोटॉन परिवहन कैनेटीक्स की जांच के लिए एक पूरी सेल विद्युत परख की हमारी तकनीक अंय electroactive माइक्रोबियल उपभेदों के लिए लागू किया जा सकता है ।
विद्युत तकनीक सीधे एक बरकरार जीवाणु कोशिका में एक redox प्रोटीन की विशेषता के लिए हाल ही में धातु की खोज के बाद से उभरा है-माइक्रोबियल उपभेदों, जैसे एस oneidensis एमआर-1 या Geobacter sulfurreducens पीसीए को कम करने, जो बाहरी झिल्ली सी-प्रकार cytochrome परिसरों (ओम सी-Cyts) सेल बाहरी1,2,3,4,5से अवगत कराया । ओम सी-Cyts extracellularly स्थित ठोस सब्सट्रेट करने के लिए श्वसन श्रृंखला से मध्यस्थता इलेक्ट्रॉन परिवहन. इस परिवहन के रूप में संदर्भित किया जाता है extracellular इलेक्ट्रॉन परिवहन (ईत)1,6 और उभरते जैव प्रौद्योगिकी के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, इस तरह के माइक्रोबियल ईंधन कोशिकाओं के रूप में6। इसलिए, अंतर्निहित ईत कैनेटीक्स और तंत्र को समझने के लिए, और माइक्रोबियल फिजियोलॉजी के लिए अपनी कड़ी, ओम सी-Cyts पूरे सेल electrochemistry4का उपयोग कर जांच की गई है,7, माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त 8 , 9, स्पेक्ट्रोस्कोपी10,11, और आणविक जीवविज्ञान2,4. इसके विपरीत, ईत के प्रभाव की जांच करने के तरीके-जुड़े कटियन परिवहन, जैसे, प्रोटान, ईत कैनेटीक्स पर रहने वाले कोशिकाओं में शायद ही स्थापित किया गया है, बैक्टीरियल झिल्ली में एक महत्वपूर्ण भूमिका होने के पार प्रोटॉन परिवहन के बावजूद सिग्नलिंग, homeostasis, और ऊर्जा उत्पादन12,13,14. वर्तमान अध्ययन में, हम एक तकनीक का वर्णन करने के लिए ईत कैनेटीक्स पर प्रोटॉन परिवहन के प्रभाव की जांच करने के लिए एस oneidensis श्री-1 सेल का उपयोग कर पूरे सेल विद्युत माप है, जो दर में सीमित कदम की पहचान की आवश्यकता है माइक्रोबियल वर्तमान उत्पादन15।
संबंधित ईत पर प्रोटॉन परिवहन के योगदान का मूल्यांकन करने के लिए एक सीधा रास्ता ड्यूटेरियम काइनेटिक आइसोटोप प्रभाव (कीे) है । ड्यूटेरियम आयनों के साथ प्रोटान के प्रतिस्थापन पर इलेक्ट्रॉन अंतरण कैनेटीक्स में परिवर्तन के रूप में चौकसी कीे जाती है, जो इलेक्ट्रॉनक अंतरण कैनेटीक्स पर प्रोटॉन परिवहन के प्रभाव का प्रतिनिधित्व करती है जो16/ के सिद्धांत कीे ही अच्छी तरह से स्थापित किया गया है शुद्ध एंजाइमों के साथ विद्युत माप का उपयोग17. हालांकि, के बाद से एस oneidensis एमआर में वर्तमान उत्पादन-एकाधिक, विविध, और अस्थिर प्रक्रियाओं से 1 परिणाम18, एक बस दर सीमित प्रक्रिया के रूप में ईत की पहचान नहीं कर सकते । प्रोटॉन परिवहन ईत के साथ युग्मित प्रक्रियाओं पर गौर कीे, हम पुष्टि करते है कि माइक्रोबियल मौजूदा उत्पादन के माध्यम से इलेक्ट्रॉन परिवहन द्वारा सीमित है ओम सी-इलेक्ट्रोड के लिए Cyts । इस प्रयोजन के लिए, हम ताजा मध्यम के साथ supernatant समाधान की जगह एक इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में इष्टतम पीएच और तापमान की स्थिति कीे माप से पहले एक उच्च एकाग्रता से युक्त; इस प्रतिस्थापन दो भूमिकाओं में कार्य किया: (1) यह ईत की तुलना में ऊपर चयापचय प्रक्रियाओं की दर में वृद्धि हुई है, और (2) काम कर इलेक्ट्रोड पर monolayer के oneidensis एमआर-1 से जारी supernatant में तैराकी कोशिकाओं का लोप करें ( इंडियम टिन-मैगनीज ऑक्साइड (इतो) इलेक्ट्रोड). प्रस्तुत विस्तृत प्रोटोकॉल नए चिकित्सकों को बनाए रखने और पुष्टि करते है कि ईत प्रक्रिया दर निर्धारण कदम है मदद करना है ।
हमारे पूरे सेल विद्युत परख प्रोटीन electrochemistry के साथ तुलना में कई तकनीकी लाभ है । जबकि प्रोटीन शुद्धि बहु कदम समय लेने वाली प्रक्रियाओं की आवश्यकता है, हमारे पूरे सेल विधि सेल संस्कृति के बाद स्वयं के एक दि?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम आर्थिक रूप से जापान सोसायटी ऑफ साइंस (JSPS) KAKENHI अनुदान संख्या २४००००१०, 17H04969, और JP17J02602, अमेरिका के नौसेना अनुसंधान ग्लोबल (N62909-17-1-2038) के कार्यालय से विशेष रूप से पदोन्नत अनुसंधान के लिए एक अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था । Y.T. एक JSPS अनुसंधान साथी है और अग्रणी स्नातक स्कूलों (योग्यता) के लिए कार्यक्रम के माध्यम से JSPS द्वारा समर्थित है ।
Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |