Summary
Burada, içinde bispecific antikor GPC3-S-Fab üretmek için bir protokol mevcut Escherichia coli. Saf GPC3-S-Fab güçlü sitotoksisite karşı GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücreleri vardır.
Abstract
Bu iletişim kuralı İnşaat ve bispecific antikor (bsAb), GPC3-S-Fab fonksiyonel çalışmaları açıklanmaktadır. bsAbs iki farklı kolları aracılığıyla iki farklı epitopları tanıyabilir. bsAbs aktif olarak yeteneklerini doğrudan bağışıklık hücreleri tümör hücrelerini öldürmek için recruit için inceledik. Şu anda, bsAbs çoğunluğu rekombinant proteinler, Fc içeren bsAbs olarak veya daha küçük bsAb türevleri Fc bölge olmadan şeklinde üretilmektedir. Bu çalışmada, GPC3-S-Fab, bir antikor parçası (Fab) tabanlı bispecific antikor anti-GPC3 antikor GC33 bir anti-CD16 tek etki alanı antikor ile Fab bağlama tarafından tasarlanmıştır. GPC3-S-Fab Escherichia coli ifade edilen ve iki benzeşme chromatographies tarafından arıtılmış. Saf GPC3-S-Fab özellikle bağlamak ve GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücrelerini öldürmek doğal katil hücreler, işe alma tarafından GPC3-S-Fab potansiyel bir uygulama karaciğer kanseri tedavisi öneriyor.
Introduction
Monoklonal antikor şimdi geniş kanser tedavi1için kullanılır. Antikorlar esneklik nedeniyle çeşitli antikor tabanlı biçimler aktif olarak keşfedilmeyi. Monoklonal antikorlar ile karşılaştırıldığında, bsAbs iki farklı hedefler aynı anda ve verimli bir şekilde hedef ve tümör hücreleri2öldürmek için bağışıklık efektör hücreleri alımı tetiklemek tanımasını sağlayarak iki farklı antijen bağlayıcı modülleri var.
Geçerli rekombinant bsAb biçimleri genellikle iki sınıf için atanmış: Fc içeren bsAbs ve bsAbs bir Fc bölge olmadan. Çoğunlukla memeli hücrelerinde üretilir Fc içeren biçimleri ile karşılaştırıldığında, bsAbs olmadan bir Fc bölge daha küçük boyutları, avantajları daha kolay mikroorganizma ifade sistemlerinde üretilen ve tümör doku daha verimli bir şekilde nüfuz 3.
bsAbs bir Fc bölge olmadan genellikle tek-zinciri değişken parçaları (scFvs) veya Fabs3gibi bireysel bağlama moieties bağlayarak meydana gelir. Olmadan teskin etki, scFv parçaları genellikle dayalı bsAbs termal kararlılık, düşük çözünürlük veya toplama4,5için artan bir potansiyel tehlikeye. Buna ek olarak, Fab-esaslı bsAbs CH1 ve CL heterodimerization yerli Fab yan4,6' nedeniyle daha istikrarlı.
Değişken etki alanından ağır zinciri yalnızca antikorlar (VHHs, tek etki alanı antikor da bilinir) doğal ağır zincir antikorlar7aktif antijen bağlayıcı parçası vardır. VHHs yüksek afinite özellikleri, geleneksel IgGs8, düşük immünojenisite ve yüksek verim özgüllük bakteriyel ifade9' var. FV parçaları ile karşılaştırıldığında, VHHs daha yüksek termal kararlılık10var. Fab moieties ile karşılaştırıldığında, VHHs daha küçük boyutları nedeniyle CH1 ve CL eksikliği var. Böylece, S-Fab, Fab bir tek etki alanı antikor, VHH, ile bağlantı kurarak elde bsAb biçiminde tasarlanmış ve onun anti-tümör etkisi11,12için okudu.
Bu çalışmada, GPC3-S-Fab inşaatı hGC3313 ile bir anti-CD16a VHH14 Fab bağlama tarafından tanımlanmıştır. GPC3-S-Fab, verimli bir şekilde periplasmic ifade Escherichia coli (e.coli)içinde üretilmektedir. GPC3-S-Fab fonksiyonel çalışmaları GPC3-S-Fab karaciğer kanseri tedavisi için umut verici bir strateji olduğunu düşündürmektedir. Böylece, GPC3-S-Fab avantajları alternatif teknikleri ile ilgili başvuruları önceki çalışmalarda kolay üretim ve arıtma ve daha istikrarlı bsAbs içerir.
Memeli ifade ve prokaryotik ifade sistemler BsAbs çeşitli biçimlerde ifade etmek için kullanılmaktadır. Memeli ifade sistemleri, E. coliaksine-tabanlı protein ifade sistemlerine sahip pek çok faydaları, yüksek verim, düşük maliyetli ve emek tasarrufu, genetik manipülasyon ve yüksek dönüşüm verimliliği15kolaylığı dahil olmak üzere. E. colibsAbs ifade için iki temel strateji vardır: sitoplazma ve sitoplazma ve dış hücre zarlarında15arasında periplasm ifadede ifade. Sitoplazma azaltarak çevreye, periplasm bir daha oksitleyici doğru katlanır teşvik çevre ve proteinler16ortak ifade karşılaştırılır. Doğru katlanır çözünürlük, istikrar ve işlev bsAbs üretiminde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, bir sinyal sıra pelB periplasm için salgılanmasını E. coli17yönlendirmek için S Fab N-terminus eklendi. Emin olmak için doğru katlanır, çözünürlük, termal kararlılık ve konformasyon istikrar, karmaşıklığı ve bir antikor boyutunu azaltarak sık16istihdam. S-Fab biçimi bir Fab ve bakteriyel sistemlerinde basit yapısı ve küçük boyutu nedeniyle büyük olasılıkla çok iyi ifade edilen bir VHH oluşur.
GPC3 bu GPC3-S-Fab bispecific antikor biçimde seçildi. Glypican-3 (GPC3) ile glycosylphosphatidylinositol (GPI)18hücre yüzeyine demirli heparin sülfat (HS) proteoglikan ailesinin bir üyesidir. GPC3 karaciğer kanserleri19,20,21,22çoğunluğu için hangi hesabı % 70 hepatosellüler karsinom (HCC) olguların overexpressed. GPC3 nadiren normal dokulara ifade edilir çünkü GPC3 HCC için potansiyel bir hedef teklif edildi. Birden çok fare mAbs GPC3 karşı üretilen. Ancak, sadece GC33 sınırlı anti-tümör faaliyet 22sergiledi ve bu hastalarda klinik etkinlik sergilemek için başarısız oldu. Bu çalışmada, GPC3-S-Fab NK hücreleri GPC3 tümör hücreleri14öldürmek için recruit edebilmek için gösterildi.
NK hücreleri toplamak için anti-CD16 VHH kullanıldı. CD16a esas olarak doğal öldürücü (NK) hücreler, makrofajlar, monosit ve bazı alt türlerinden T hücrelerinin üzerinde ifade bir düşük benzeşme IgG reseptör var. NK hücreleri23tarafından antikor bağımlı hücre sitotoksisite (CCDA) ilgilenmektedir. İnsan NK hücreleri iki türe, CD56 kategorize - CD16 + ve CD56 + CD16-. CD56 + CD16− NK hücreleri, CD56 aksine-CD16 + NK hücreleri serbest bırakmak daha yüksek düzeyde perforin ve granzyme B ve böylece güçlü sitotoksisite24mevcut. CD16a, ifade Kupffer hücreleri (KCs), karaciğerde ikamet makrofajlar vardır. Kupffer hücreleri karaciğer kanseri25bastırılması içinde önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, CD16a hedefleme bsAbs T hücrelerinin karaciğer kanserine karşı ilgi çekici daha bir daha umut verici strateji olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan kanı toplama dahil olmak üzere tüm yordamları Sun Yat-Sen Üniversitesi Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. GPC3-S-Fab tasarım stratejisi
- GPC3-S-Fab anti-GPC3 (insanlaşmış GC3313) bir anti-CD16 VHH14 (Şekil 1) ile bir Fab bağlayarak tasarlayın.
- Sentez ve VH-CH1-CD16-VHH ve VL-CL pET26b ve pET21a vektörel çizimler daha önce bildirilen12olarak klonu.
2. dönüşüm ve kültür
- 100 Ekle VH-CH1-CD16 (Şekil 1A) ve 100 içeren ng pET26b, pET21a, yetkili BL21 100 µL VL-CL (Şekil 1A) içeren ng (DE3) hücreleri. Mix iyi ve 45-90 s, transfer, 42 ° C su banyosunda 30 dk. Incubate buz üzerinde kuluçkaya ve 3-5 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
- Lysogeny suyu (LB) orta 500 µL BL21 içeren bir tüpün içine ekleyin (DE3) hücreleri ve sonra 37 ° c, 45-60 dakika süreyle 150 d/d BL21 yayılmış 100 µL kuluçkaya LB-agar (DE3) hücre tabaklar içeren 50 µg/mL sefaloridin ve ampisilin 100 µg/mL ve 12-16 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- Lysogeny suyu (LB) orta hazırlamak: %1 wt/vol tryptone, % 0.5 wt/vol maya özü, % 1 wt/vol NaCl.
- Bir koloni hücrelerden sefaloridin 50 µg/mL ve ampisilinve kültür 37 ° c, 220 devir/dakika, 100 µg/mL gecede içeren Süper suyu (SB) orta 5 mL aşılamak. O zaman, kültür 1 mL 100 mL 50 µg/mL sefaloridin ve ampisilin ve kültür 37 ° c, 4 h için 220 devir/dakika 100 µg/mL içeren SB orta içine aşılamak. Ardından kültür 10 mL 1 L SB orta sefaloridin 50 µg/mL ve ampisilin ve kültür 37 ° c, 220 devir/dakika 100 µg/mL içeren içine aktarın.
- Süper suyu orta hazırlamak: % 3.2 wt/vol tryptone, % 2 wt/vol maya özü, % 0.5 wt/vol NaCl.
- OD600 0,6 - ulaştığında 0.8, 0.2 mM son bir konsantrasyon izopropil-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) ekleyin. Kültür 16 ° c, 36-48 h periplasmic ifade için 180 rpm.
3. GPC3-S-Fab Periplasmic arıtma
- Periplasmic kesir hazırlık
- 4000 x g, 30 dk için 4 ° C de centrifuging tarafından hücreleri toplamak, orta atın ve hücreleri tartın.
- 4 mL buz gibi sükroz çözeltisi (20 mM Tris-HCL, pH 7.5; %25 (wt/vol) sükroz ve 1 mM EDTA) gram hücre başına iyice hücrelerde resuspend ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
- 8.500 x g (Masa Üstü Santrifüj, sabit açılı rotor), buz üzerinde 20 dk. kaldırmak için süpernatant (sukroz Kesir) ve kurtarmak o 4 ° C santrifüj kapasitesi.
- Buz gibi 5 mm MgCl2 ve PMSF (gram hücre başına 4 mL), 1 mM bir karışımında granül resuspend. Lizozim hisse senedi (15 mg/mL) gram başına 40 µL ekleyin ve buz 30 dk için kuluçkaya.
- 8.500 x g (Masa Üstü Santrifüj, sabit açılı rotor), 4 ° C 20 dakika Transfer süpernatant (periplasmic Kesir) süreyle santrifüj kapasitesi ve buza kaydedin.
- Sükroz kesir ve periplasmic kesir birleştirin ve de 30.000 x g, 4 ° C'de 30 dk. kaldırmak için süpernatant ve kurtarmak o bir 50 mL konik tüp buz santrifüj kapasitesi.
- Ni-NTA benzeşme arıtma
- Homojen bir süspansiyon ulaşmak, Ni-NTA özel bir taze 15 mL konik tüp için 1 mL kaldırmak ve 10 sütun birimleri (CV) denge arabellek eklemek için iyice karıştırılarak Ni-NTA özel 1 mL resuspend (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 1 M NaCl) equilibrate için.
- 400 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın. Daha sonra Ni-NTA özel sükroz kesir ve periplasmic kesir içeren 50 mL tüp içine ekleyin. Rock 4 ° c 2 h için.
- 400 x g karisimin santrifüj kapasitesi, 4 ° C'de 5 dakika süreyle dikkatli bir şekilde süpernatant ilişkisiz kesir olarak başka bir taze buz gibi tüp için çıkarın. Ni-NTA özel bir yerçekimi sütuna aktarmak.
- 10 Ekle CV, arabellek yıkama (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 1 M NaCl; 20 mM, 30 mM veya 40 mM imidazole) sütun ve toplamak çamaşır kesir olarak elute.
Not: Bu çözümler imidazole konsantrasyonları artan sırayla eklenmelidir. - 3 ekleyin elüsyon CV (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 300 mM NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 mM veya imidazole 400 mM) sütun için tampon ve elüsyon kesir olarak 1, 2, 3 ve 4 elute toplamak.
Not: Bu çözümler imidazole konsantrasyonları artan sırayla eklenmelidir. - Diyaliz PBS (137 mM NaCl, KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4 2.7 mM) 2 L eluted fraksiyonları % 12 kontrol GPC3-S-Fab varlığı diyaliz boru (12,4 kDa) 4 ° C'de 2 h. için istimal SDS-sayfa ve sonra tarafından Coomassie mavi boyama.
- IgG-CH1 benzeşme arıtma
- IgG-CH1 benzeşme reçine 1 mL 50 mL konik tüp içine aktarmak ve boncuk PBS ile önce yıkayın. Daha sonra GPC3-S-Fab-den sonra adım 3.2.6 içeren diyaliz çözüm ekleyin. Rock 4 ° c 2 h için.
- 5 min için 400 x g, santrifüj, 4 ° C. Dikkatle ve reçine bir ağırlık sütun için transfer için başka bir taze buz gibi tüp süpernatant çıkarın.
- 10 Ekle CV çamaşır tampon (PBS) için sütun ve yıkama kesir olarak elüsyon toplamak.
- Koleksiyon tüpler Tris pH 9.0 (her eluted kesir mL başına 0.1 mL) 1 M ekleyerek hazırlayın. 3 CV elüsyon arabellek (glisin-HCL, pH 2.7 0.1 M) ile elute ve eluted kesir toplamak; 3 kez tekrarlayın.
- Diyaliz diyaliz boru (12,4 kDa) kullanarak 4 ° C'de 2 h. için PBS 2 L eluted kesirler iki kez tekrarlayın.
- Ultramicrospectrophotometer tarafından protein konsantrasyonu belirlemek (Molar tükenme katsayısı: 91105. 1 A280 = 0.69 mg/L).
4. SDS-sayfa ve Western blot Analizi
- 5 SDS yükleme arabellek x 10 µL örnek almak ve iyice karıştırın. 5 min için 100 ° C'de protein karışımı kaynatın.
- 5 x SDS yükleme arabellek hazırlamak: 250 mM Tris-HCL, pH 6.8, % 10 wt/vol SDS, %0,5 wt/vol bromophenol mavi, %50 vol/vol gliserol, % 5 vol/vol beta-mercaptoethanol.
- SDS-sayfa jel yükleme jel (% 5) ve ayrılık jeli (% 12) yukarıda açıklanan26,27,28hazırlayın.
- Haşlanmış protein karışımı ve protein marker 10 µL yük ve SDS-sayfayı çalıştırın.
- Coomassie parlak mavi çözüm ile 20 dk için sallayarak jel leke ve destaining gerçekleştirin.
- Western Blot, PVDF membran için aktardıktan sonra membran TBST (20 mM Tris-HCl, NaCl, %0,1 vol/vol ara 20 150 mM) ile blok + % 5 wt/vol sallayarak süre oda sıcaklığında 1 h için süt kaymağı alınmış.
- Membran birincil antikorlar ile kuluçkaya (Anti-O'nun veya anti-bayrak) seyreltilmiş 1:2,000 TBST + % 5 yağsız süt 1 h için.
- Oda sıcaklığında 5 min için TBST ile yıkama ve 3 kez tekrarlayın.
- İkincil antikoru (Anti-fare Fc antikor HRP bağlı) seyreltilmiş 1:2,000 TBST + % 5 yağsız süt 1 h için membran kuluçkaya.
- Oda sıcaklığında 5 min için TBST ile yıkama ve 3 kez tekrarlayın.
- HPR substrat film başına 1 mL ekleyin, geliştirmek ve fotoğraf çekmek.
5. jel filtrasyon Analizi
- Aşağıdaki sütun kullanın: sütun hacmi 24 mL; Denge arabellek PBS pH 7.4; Akış hızı 0.5 mL/dk odasında ılıman; Örnek hacmi 200 µL.
- Aşağıdaki protein güç ve konsantrasyon kullanın: 500 µL 1.2 mg/ml GPC3-S-Fab. 20.000 x g 30 dk için de santrifüj kapasitesi ve yüklemek için 200 µL al.
- Protein marker hacmi ve konsantrasyon, 100 µL sitokrom C (2 mg/mL, 12.4 kDa), 140 µL anhidraz (3 mg/mL, 29 kDa), albümin (10 mg/mL, 66 kDa) 140 µL ve alkol dehidrogenaz (5 mg/mL, 150 kDa) 200 µL bir tüpün içine alın. 20.000 x g 30 dk için de santrifüj kapasitesi ve yüklemek için 200 µL al.
- Her koşudan önce en az 2 ile yıkayın CV distile suyun akış hızı 0.5 mL/dak.
- Sütun en az 2 ile equilibrate CV denge arabelleği (PBS, pH 7,4) 0.5 mL/dk akış hızında.
- Otomatik olarak örnek örnek yüklemek için 0.5 mL/dk enjekte et.
- Denge arabelleği 0.5 mL/dk ile elute ve 280 ve 215 nm algılamak.
6. Akış Sitometresi Analizi
- HepG2 Kültür (GPC3 pozitif), Hep3B (GPC3 pozitif), Huh7 (GPC3 pozitif) ve 100 x 20 mm plastik yemekleri DMEM orta % 10 fetal Sığır serum (FBS), penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° C'de içeren hücrelerde MHCC - 97H (GPC3 complement) %5 CO2.
- Kültür CHO (GPC3 complement) hücreleri ve tam uzunlukta insan GPC3 cDNA (GPC3 pozitif) 100 x 20 mm plastik yemekler RPMI 1640 orta %10 FBS, penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° c, % 5 CO2içeren yataklık CHO/GPC3 hücreleri.
- Tam uzunlukta insan CD16 cDNA (CD16 pozitif) barındıran NK92/CD16 25 cm2 şişeye %10 FBS, penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° c, % 5 CO2ile RPMI 1640 orta içeren kültür.
- Hücreleri % 70-90 birleşmesi olduğunuzda, orta atın ve PBS 2 mL hücrelerle yıkayın. 1 mL % 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° c için 2-3 dk (veya hücre yüzeyinden ayırmak başlayana kadar) kuluçkaya. Tripsin etkisiz hale getirmek ve hücrelerin yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya almak için tam büyüme orta 1 mL ekleyin.
- Neubauer hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak ve hücre canlılığı Trypan Mavitarafından algılamak.
- 3 x 106 hücreler her hücre satırı için toplamak. PBS + % 0,2 BSA hücreleri yeniden askıya almak için 1 mL ekleyin. 200 x g, santrifüj, 4 ° C 5 dk. iki kez tekrarlamak için.
- PBS + % 0,2 BSA hücreleri yeniden askıya almak için 0.3 mL ekleyin ve her 5 mL polistren yuvarlak alt tüp 100 µL (yaklaşık 1 milyon) aktarın.
Not: Lütfen burada tüpler için adımları soğuk buz üstünde tutulmalıdır emin olun. Antikor hücre yüzey antijeni bağlanırken, karmaşık içselleştirmesi başlar. Soğuk tutarak, süreci önemli ölçüde yavaşladı. - Her tüp için birincil antikor (GPC3-S-Fab veya insan Igg1, son konsantrasyonu 5 µg/mL) 10 µL ekleyin ve 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.
- PBS 1 mL ekleyin + % 0,2 BSA yıkama ve 200 x g, santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika süreyle üç kez tekrarlayın.
- PBS + % 0,2 BSA, 100 µL yeniden askıya alma ve daha sonra ikincil antikoru (anti-insan IgG(H+L)-488, son konsantrasyonu 10 µg/mL) 0.5 µL ekleyin ve buz 1 h. Not için kuluçkaya: Bu adıma, lütfen hücreler gelen ışık tutmak..
- PBS 1 mL ekleyin + % 0,2 BSA yıkama ve 200 x g, santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika süreyle üç kez tekrarlayın.
- Hücreleri tarafından akış sitometresi standart protokolü29göre analiz. Hücrelerin uyarma için 488 nm lazer ile elde etmek.
7. sitotoksik deneyleri
- Tümör hücreleri hazırlayın.
- Kültür HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H ve CHO hatları 6.1 6.5 adımlarda açıklandığı gibi hücre.
- 0,5 × 105/mL hücrelere sulandırmak ve 100 µL hücreleri (iyi başına 5000 hücre) 96-şey plakalar üzerinde plakası. 6-8 h hücre eklemek izin vermek için kültür.
- İnsan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) hazırlayın.
- PBS eşit bir birimdeki bir 50 mL konik tüp taze hazırlanmış kanı sulandırmak. Örneğin, kan 10 mL 10 mL PBS ile oranında seyreltin.
- Lenfosit ayrılık orta 15 mL taze 50 mL konik tüp içine al. Lenfosit ayrılık ortama tüp tarafı boyunca seyreltilmiş kan yavaş yavaş aktarın.
Not: tüp dikey tutun. Lenfosit ayrılık orta yüzeyine bozulmaz. - 400 x g oda sıcaklığında 35 dk için de kapalı tut ile santrifüj kapasitesi.
- Yavaş yavaş üst plazma katmanı kaldırın ve PBMCs plazma-lenfosit ayrılık orta arayüz içeren beyaz kan katman al.
- PBS + % 2 Kişilik birimi olan PBMCs seyreltik FBS. 400 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Hücrelerle iki kez PBS + % 2 yıkama FBS. 5 dakika süreyle santrifüj 400 x g de 6,5 adımda anlatıldığı gibi hücre sayıları saymak.
- NK hücreleri hazırlayın.
- 5 x 107 hücre/mL PBS + %2 FBS ve yerde bir konsantrasyon, PBMCs süspansiyon hazırlamak 5 mL polistren yuvarlak alt tüp giriyordu.
- İnsan NK hücre zenginleştirme kokteyl 50 µL/mL hücre ekleyin. Mix iyi ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Manyetik parçacıklar NK hücre zenginleştirme kiti ve mix iyi onlar düzgün pipetting tarafından askıya alınır sağlamak için yukarı ve aşağı 5 katından fazla şiddetle resuspend. 100 µL/mL resuspended manyetik parçacıklar hücre süspansiyon aktarın. Mix iyi ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- PBS + %2 ekleyerek toplam hacmi 2.5 mL kadar hücre süspansiyon getirmek FBS. Tüp hücrelerde yavaşça yukarı ve aşağı 2 - 3 kez pipetting tarafından karıştırın. (Olmadan bir kap) tüp mıknatıs yerleştirin. Oda sıcaklığında 2.5 min için yerleşmek manyetik boncuklar izin.
- Mıknatıs kaldırın. Bir sürekli çekimde zenginleştirilmiş hücre süspansiyon yeni bir tüp içine dökme Tüp, tersine çevirin.
- 6.5. adımda açıklandığı gibi hücre sayıları saymak.
- Sitotoksik tepki kadar ayarla.
- NK hücreleri 5 × 105 hücreleri/karşılık gelen kültür ortamı kullanarak ml seyreltik. 100 µL NK hücre süspansiyon, bir 96-şey plaka üzerinde kaplama tümör hücreleri ekleyin.
- GPC3-S-Fab 10 µL 30 µg/mL, 3 kat seyreltme, 9 nokta (üç çoğaltır) son bir konsantrasyon, en yüksek dozla farklı konsantrasyonlarda ekleyin.
- 37 ° c, % 5 CO2 72 h için kuluçkaya.
- 72 h, kuluçka sonra orta kaldırmak ve DMEM orta CCK8 reaktif her kuyuya 96-şey plakaları için 10 µL içeren 100 µL ekleyin ve 37 ° C'de kuluçkaya
- 450 de plaka okumak nm'de 1, 2, 3 ve 4 h CCK8 reaktif ekledikten sonra.
- Verileri analiz. (OD450 GPC3-S-Fab + efektör + tümör - OD450 Orta) hayatta kalma oranı hesaplamak / (OD450 tümör - OD450 Orta) × %100 ve (OD450 GPC3-S-Fab + tümör - OD450 Orta) / (OD450 tümör - OD450 Orta) × %100. Efektör hücreler NK hücreleri vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GPC3-S-Fab arıtma
GPC3-S-Fab E. coli bir iki adım benzeşme saflaştırma tarafından ilk Ni-NTA-özel, IgG-CH1 benzeşme arıtma tarafından takip ile saflaştırıldı. İki adım benzeşme arıtma sonra GPC3-S-Fab homojenliği ile 1:1 (Şekil 2A) yakın iki zincir için saflaştırıldı. VH-CH1-CD16 VHH ve VL-CL polipeptitler varlığı onların farklı C-terminal etiketleri tarafından belirlenebilir Anti-O'nun VL-CL yaklaşık 25 kDa ve VH-CH1-VHH yaklaşık 38 kDa (Şekil 2B) için anti-bayrak için. İki adım benzeşme arıtma sonra ~1.2 mg protein 1 litre SB kültür elde edilebilir. Daha da saf GPC3-S-Fab karakterize etmek için jel filtrasyon gerçekleştirildi. Standart veri işaretleyicilerini (Şekil 2C) bağlı olarak, GPC3-S-Fab moleküler boyutu yaklaşık 63 kDa (Şekil 2C) olarak bir heterodimerdir şeklinde homojen bir monomer olarak tespit edilmiştir.
GPC3-S-Fab bağlama faaliyetleri
GPC3-S-Fab GPC3 pozitif hücreler ve CD16 pozitif hücreleri tanıyan olup olmadığını değerlendirmek için Akış Sitometresi Analizi GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücre hatları HepG2, Hep3B, Huh7, CHO/GPC3 ve GPC3 negatif karaciğer kanseri hücre satırı kullanılarak yapılmıştır, MHCC - 97H ve CHO hücreler. GPC3-S-Fab bütün GPC3 pozitif hücrelerde, Hep3B her ne kadar zayıf bağlama ile bağlamak (Şekil 3B) ve HepG2 için daha Huh7 hücre (Şekil 3 c) (Şekil 3A) ve CHO/GPC3 (Şekil 2F). Hayır veya GPC3 negatif MHCC - 97H ve CHO hücrelere en az bağlama (şekil 3D, 3E) gözlenen. GPC3-S-Fab da CD16 pozitif hücreler, NK92/CD16 hücreleri (Şekil 3 g) bağlamak. Bu sonuçlar GPC3-S-Fab özellikle GPC3 pozitif hücre satırları ve CD16 pozitif hücreler bağlayabilirsiniz düşündüren diğer anti-GPC3 antikorlar30, kullanarak önceki sonuçları ile uyumludur.
GPC3-S-Fab sitotoksisite değerlendirmek için tümör hücreleri GPC3-S-Fab farklı konsantrasyonları ile taze izole NK hücreleri ile inkübe. NK hücreleri, GPC3-S-Fab tümör hücreleri GPC3 ifade durumu (Şekil 4) ne olursa olsun karşı hiçbir sitotoksisite vardı. NK hücreleri, huzurunda GPC3-S-Fab HepG2, Hep3B ve Huh7 hücrelere karşı güçlü sitotoksisite bir doz bağımlı şekilde tetikleyen ama GPC3 negatif MHCC - 97 H hücreleri (Şekil 4), üzerinde hiçbir etkisi düşündüren GPC3-S-Fab sitotoksisite gösterdi GPC3 ifade tümör hücre yüzeyinde bağlıdır.
Şekil 1. GPC3-S-Fab yapıları
(A) bakteriyel Ifade yapıları, GPC3-S-Fab. Yapıları bir pelB sinyal sırası, insanlaşmış anti-GPC3 (GC33) VH-CH1-anti-CD16 VHH (ağır zincir) veya bir VL-CL (hafif zinciri) içerir. Protein algılama ve arıtma kolaylaştırmak için bir bayrak etiketi veya His8 etiketinde C-terminus için eklendi. (B) diyagramı, GPC3-S-Fab ortak ifade sonra.
Şekil 2. GPC3-S-Fab arıtma E. coli.
(A)sol kapı aynası, Ni-NTA benzeşme Kromatografi sonra; Doğru kapı aynası, anti-IgG-CH1 benzeşme Kromatografi sonra; M, molekül ağırlığı merdiven; Coomassie mavi boyama. (B) sol kapı aynası, Ni-NTA benzeşme Kromatografi sonra; Doğru kapı aynası, anti-IgG-CH1 benzeşme Kromatografi sonra; M, molekül ağırlığı merdiven; Western-Blot. (C) jel GPC3-S-Fab filtrasyon analizi. Üst panel, standart işaretleri; alt paneli, GPC3-S-Fab. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. GPC3-S-Fab GPC3 pozitif hücrelerinin ve CD16 pozitif hücreler tanır.
Akış Sitometresi Analizi HepG2(a)Hep3B (B), Huh7 (C), MHCC - 97 H (D), (E), CHO CHO/GPC3 (F) ve NK92/CD16 (G) hücreleri gerçekleştirilen iletişim kuralında tanımlandığı gibi. Kırmızı çizgi: tümör hücreleri yalnızca; Yeşil hat: izotip kontrol, tümör hücre + insan Igg1 + anti-insan IgG(H+L)-488; mavi çizgi: tümör hücre + GPC3-S-Fab + anti-insan IgG (H + L)-488. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. GPC3-S-Fab GPC3 pozitif kanser hücrelerinin hücre ölümü teşvik etmektedir.
Doz bağımlı sitotoksisite deneyleri gerçekleştirilen iletişim kuralında HepG2 için açıklandığı gibi(a)Hep3B (B), Huh7 (C) ve MHCC - 97 H (D). GPC3-S-Fab konsantrasyonları 30 µg/mL 0.0045 µg/mL edildi. Triplicates standart sapmayı temsil eden hata çubukları ile ortalaması verilerdir. Katı daire, sadece GPC3-S-Fab; dolu kare GPC3-S-Fab+ NK, NK hücreleri (iyi başına 50,000) ve hedef hücreleri (5.000 iyi başına). Karışımlar sitotoksisite ölçüm önce 72 saat inkübe. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, biz bsAbs, yeni bir biçim oluşturmak için bir strateji mevcut GPC3-S-hangi GPC3 pozitif tümör hücreleri hedefleme NK hücreleri askere Fab. S-Fab üzerinde doğal Fab dayalı bir anti-CD16 VHH11,12ekleyerek biçimi. BsAbs içeren Fc bölge ile karşılaştırıldığında, GPC3-S-Fab kolayca bakteri büyük ölçüde periplasm olarak üretilmektedir.
İletişim kuralında tanımlanan ifade ve arıtma stratejisi kullanarak, bir çözünür ve fonksiyonel GPC3-S-Fab büyük miktarlarda elde edilen. Periplasmic ifadesi kolaylaştırmak için bir sinyal sıra pelB N-periplasm için salgılanmasını E. coli17yönlendirmek için terminus için eklendi. Sitoplazma, aksine sitoplazmik ve dış membran arasında periplasmic boşluk daha oksitleyici ortamında protein katlanması ve derleme için protein önemli bir dizi ile donatılmış ve böylece düzeltme katlama destekler ve Çözünürlük rekombinant proteinler16. Ancak, protein katlanması ve E. coli periplasm ihracat için makine kapasitesi sınırlıdır. Sık sık yüksek ifade rekombinant proteinlerin periplasm16çözünmez ürün birikimi sonuçlanır. Kısa bir süre içinde protein ifade yüksek önlemek için düşük IPTG (0.2 mM) ve düşük sıcaklık (16 ° C) besleyici orta çözünmez protein birikimi önlemek için bu protokolü uygulandı. Bu çalışmada, ~1.2 mg protein 1 en az 2 kat önceki işleri12ile karşılaştırıldığında verimi artırma l orta, elde edildi.
Protein yıkımı önlemek için GPC3-S-Fab çeşitli adımları içeren tüm kesirler buz üstünde tutulmalıdır. Onun ile tag VL-CL, C-terminal Ni-NTA-özel arıtma için kullanıldı. Ancak, tek Ni-NTA-özel arıtma unpaired VL-CL protein gibi istenmeyen proteinler kaldırmak yeterli değildir. Homojen heterodimeric GPC3-S-Fab, ikinci adım arındırmak için anti-IgG-CH1 benzeşme arıtma, uygulanma. Saf protein yüksek saflıkta ve 1:1 yakın iki polipeptitler vardı (Şekil 2A-2B).
Jel filtrasyon Kromatografi kendi moleküler boyutları ve şekilleri dayalı Proteinlerin moleküler ağırlıkları belirleyebilirsiniz; Saflık derecesi analiz; ve saf protein bir monomer olup olmadığını belirlemek dimer, veya toplamları15oluşur. Jel filtrasyon Kromatografi tarafından GPC3-S-Fab GPC3-S-Fab (Şekil 2C) heterodimerization ile bir monomer şeklinde yaklaşık 63 kDa beklenen moleküler büyüklüğü ile tespit edilmiştir.
Akış Sitometresi bir antikor geleneksel western-blot ve ELISA, ile hangi sadece-antijen-antikor bağlama tepkiler göre hücre zarı üzerinde onun antijen bağlanamayacağını belirleyebilirsiniz. Akış Sitometresi Analizi ile GPC3-S-Fab GPC3-Fab yan işlevsel olduğunu mu ima hücre zarı üzerinde GPC3 tanıdı. Akış Sitometresi Analizi yapılırken, antikor eklendikten sonra tüm adımları 4 ° C veya buz üzerinde tutmak için önemlidir. Antikor hücre yüzey antijeni bağlandığında, antikor-antijen kompleksi içselleştirilmesi başlatacaktır. Soğuk tutarak, içselleştirilmesi süreci önemli ölçüde yavaşladı.
PBMCs ve NK hücreleri tarafından lenfosit ayrımı yöntemi kullanılarak Santrifüjü periferik kan grubundan verimli bir şekilde izole orta, takip stratejileri sıralama manyetik aktif hücre tarafından. GPC3-S-Fab NK hücreleri hedef hücrelere (tümör hücreleri) oranı 10:1 yapıldı ve NK hücreleri hedef hücrelere oranının 50: 1 5:1 olarak değişebilir GPC3 pozitif hücrelerinin karşı güçlü sitotoksisite gösterdi.
Özetle, GPC3-S-hangi bir mikroorganizma ifade sisteminde üretilebilir, Fab, bsAbs tümörler karşı işlevsel biçimleri oluşturmak için yeni bir cadde sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Bu eser mali R & D planı, Guangdong Eyaleti (PR Çin) (2016A050503028) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
References
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
