Summary
Этот протокол описывает, как подготовить олигомеров значения из синтетических пептидов в пробирке и оценить относительные количества значения олигомера, точка промокательной анализа.
Abstract
Β-амилоида (значения) – гидрофобная пептид с внутренней тенденцией самостоятельно собрать на агрегаты. Среди различных агрегатов значения олигомера широко признается в качестве ведущих нейротоксина в прогресс болезни Альцгеймера (AD) и считается важным событием в патогенезе AD. Таким образом, значения олигомера ингибиторов может предотвратить нейродегенеративные и имеют потенциал, чтобы быть разработаны как Болезнь модифицирующие лечения AD. Однако различные формирования протоколов олигомера значения может привести к олигомеров с различными характеристиками. Кроме того не есть много методов, чтобы эффективно экран значения1-42 олигомера ингибиторов. Антитело A11 может реагировать с подмножеством токсичных значения1-42 олигомера с β-лист анти параллельной структуры. В этом протоколе мы опишем, как подготовить пример олигомер богатые A11-положительные значения1-42 из синтетических значения1-42 пептида в пробирке и оценить относительные количества A11-положительные значения1-42 олигомера в образцах, точка промокательной анализ с помощью A11 и значения1-42-конкретные 6E10 антител. Используя этот протокол, ингибиторы A11-положительные значения1-42 олигомера также может быть изолированы от полуколичественного экспериментальные результаты.
Introduction
Болезнь Альцгеймера (AD) является одним из наиболее важных нейродегенеративных заболеваний, затрагивающих пожилых людей во всем мире1. Широко признается, что аномальные агрегации β-амилоида (значения) может быть ведущим фактором патологических AD. Aβ агрегаты являются основными компонентами старческое бляшек, один из биологических маркеров в мозгах пациентов AD. Кроме того статистические значения, в частности олигомеров, производят мощный нейротоксичности, который может быть причиной гибели нейронов как AD прогрессирует. Таким образом, ингибирование значения олигомера формирования может предотвратить нейродегенеративные, и значения олигомера ингибиторы могут быть разработаны как Болезнь модифицирующие лечения AD. Многие исследования использовали синтетический пептид значения образуют олигомеров в пробирке, изучения морфологии и структур искусственных значения олигомеров и расследовать ингибиторов Aβ олигомера с помощью в vitro модели2,3 , 4. Однако, различные в vitro формирование протоколов олигомера значения может привести к олигомера с различных морфологических характеристик, которые могут привести к несравненный результаты среди различных исследовательских групп. Таким образом срочно необходима стандартная формирования протокола для значения олигомера.
До сих пор не так много методов поступили непосредственно обнаружить значения олигомеров. Просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА), -Денатурирующий гель-электрофорез, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) и точка промокательной анализ может использоваться для изучения объема и/или морфология Aβ олигомера в vitro5, 6. Например, морфологии и структуре значения олигомера может наблюдаться в ТЕА. Относительные количества и молекулярного размера значения агрегатов может быть измерено-Денатурирующий гель-электрофорез. ELISA может использоваться для определения значения олигомера в сыворотке, плазме и выдержки из ткани мозга. И наконец точка промокательной анализ, метод, используемый для выявления, анализа и идентификации белков, могут использоваться для оценки относительной концентрации Aβ олигомера в различных образцах с помощью олигомер значения зависимости и антител. Кроме того точка промокательной пробирного предлагает значительную экономию времени, как электрофорез геля и blotting процедуры гели не требуются. Таким образом этот assay обычно используется для экрана потенциальные значения олигомера ингибиторов. Общая цель настоящего Протокола заключается в описания метода сравнительно простых, надежных и воспроизводимых подготовить пример олигомер богатые значения1-42 , проанализировать количество значения1-42 олигомера точка промокательной анализа и экран значения олигомер Ингибиторы с помощью полуколичественного экспериментальные результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. решение подготовка
Примечание: См. Таблицу материалов для реагент источников.
- Приготовляют раствор 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА), добавив 5 g BSA до 100 мл двойной дистиллированной воды. Смешайте их полностью vortexing их. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
- Подготовьте раствор антител анти олигомера A11 (1:1, 000), добавив 10 мкл антител Стоковый раствор 10 мл 5% раствора БСА. Смешайте их полностью vortexing их. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
- Подготовьте раствор 6E10 антитела анти Aβ (1:1, 000), добавив 10 мкл антител Стоковый раствор 10 мл 5% раствора БСА. Смешайте их полностью vortexing. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
- Подготовьте раствор OC антитела анти фибриллярный олигомера (1:1, 000), добавив 10 мкл антител Стоковый раствор 10 мл 5% раствора БСА. Смешайте их полностью vortexing. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
- Подготовьте трис буфер (TBS) акций физраствора, добавив 24 g Tris база и 88 г NaCl в 1000 мл двойной дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4. Хранят раствор при температуре 4 ° C на срок до 3 месяцев.
- Подготовьте трис амортизированное saline и Tween-20 (TBST) решение, добавив 1 мл Tween-20 до 100 мл TBS акций решения и 900 мл двойной дистиллированной воды.
- Приготовляют раствор вторичные антитела путем добавления 10 мкл хрен пероксидазы (ПХ) коза анти кролик IgG (H + L) по 10 мл раствора TBST. Смешайте их полностью vortexing их. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
- Растворите 3,68 г куркумина в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) сформировать 10-мм куркумин Стоковый раствор.
- Растворяют 5 мг синтетических значения1-42 в 2 мл 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-пропанол (HFIP) для формирования решения мономера значения 2,5 мг/мл. Поместите его при комнатной температуре (25 ° C) для 20 минут сделать 100 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C до 6 месяцев.
Примечание: Эта процедура должна запускаться так же быстро, как можно скорее. Наконечники должны быть отрезаны обеспечить точное дозирование. - Подготовка electrochemiluminescence (ЭСЛ) жидкости путем смешивания ECL жидкости A и B с тома соотношении 1:1. Это решение следует готовить непосредственно перед использованием.
2. Пробоподготовка
Примечание: Выполните подготовку образца за 2 дня до точки промокательной анализа.
- 900 мкл двойной дистиллированной воды для трубки значения1-42 мономера решения; концентрация значения1-42 будет 0,25 мг/мл. Поместите смесь при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Испарится решение с высокой чистоты азот, до тех пор, пока ее объем составляет около 850 мкл. Концентрация раствора1-42 значения будет о 0,29 мг/мл.
Примечание: Решение должно быть поколеблен время от времени чтобы убедиться, что HFIP полностью испарилась. Обычно после 30 мин испарения, объем остатков раствора составляет около 850 мкл. - Разбавьте куркумин Стоковый раствор для рабочего раствора куркумин (0,2 и 2 мкм) с двойной дистиллированной воды. Mix решение значения1-42и куркумин рабочего раствора с тома соотношении 1:1. Окончательный концентрации куркумин будет 0.1 и 1 мкм.
Примечание: Потенциальных ингибиторов олигомера могут быть смешаны с значения1-42 решения в любом соотношении, при необходимости. - Встряхнуть решение непрерывно в магнитной мешалки (см. Таблицу материалы).
- Исправьте ящик пластиковый делитель для магнитной мешалкой. Место 2 магнитные перемешать баров на 2 углы окна и поместите образец трубки в центре окна.
- Встряхните при комнатной температуре (25 ° C) в течение 48 часов.
Примечание: Скорость магнитные мешалки составляет около 60 об/мин.
- Центрифуга для трубы 15 мин при температуре 4 ° C и 18 000 x g. собирать супернатант.
3. точка промокательной анализ
Примечание: Все инкубаций выполняются на горизонтальной шейкер.
- Нитроцеллюлозная мембрана нарежьте полосками шириной 1 см.
Примечание: Ширина нитроцеллюлозную мембрану можно отрегулировать согласно экспериментальной потребности. - Поместите образцы 2 мкл равномерно на 2 полосы (полоса 1 и 2) с каждой точки интервала на 0,5 см.
- Место полосы при комнатной температуре за 5 мин до капли на полосе сухой.
- Инкубируйте полоски с 5% BSA раствор для 30 мин при комнатной температуре.
- Промойте полоски с TBST решение для 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирационная решение TBST. За 1 ч при комнатной температуре инкубировать газа 1 с антитело против олигомера A11 решения и газа 2 с решением 6E10 антитела анти значения.
- Промойте полоски с раствором TBST три раза, каждый раз в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирационная решение TBST. Инкубируйте полоски с раствором вторичное антитело для 40 мин при комнатной температуре.
- Промойте полоски с раствором TBST три раза, каждый раз в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Равномерно нанесите ECL жидкости, смешанные к поверхности полос. Разоблачить полоски в автоматическое хемилюминесценция Система (см. Таблицу материалы).
Примечание: Как правило, 300 мкл ECL жидкости достаточно для одного мембраны. Мембраны должны храниться влажной во время экспозиции. Время экспозиции автоматически вычисляется системой обработки изображений. - Сделайте анализ серого с помощью ImageJ (Национальный институт здоровья) или другой обработки изображений программное обеспечение для получения полу количественных результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Расследовать ли значения1-42 мономера могут образовывать значения1-42 олигомера после подготовки, анализ ТЕА был использован. Без видимых агрегатов наблюдались в образце мономера растворяют HFIP значения1-42 (рис. 1А). Кроме того главным образом шаровидных агрегатов с диаметром около 10-80 Нм были замечены в образце значения1-42 после 48 часов тряски, предполагая, что значения1-42 формы олигомеров после подготовки (рис. 1Б).
Рисунок 1 . ТЕА анализ значения1-42 мономера и значения1-42 олигомер богатые образцы. HFIP-распущена значения1-42 мономера примеры (10 мкм) и значения1-42 олигомер-богатые люди (10 мкм) подготовлен в соответствии с настоящим Протоколом были рассмотрены ТЕА. В баре шкалы = 200 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Кроме того точка промокательной анализа была использована для оценки относительного количества значения1-42 олигомера в образцах. Антитело A11 может реагировать с подмножеством токсичных Aβ олигомера с β-лист анти параллельной структуры. Антитело OC реагирует с фибриллярного агрегатов с параллельными структурами в регистре β-лист. С помощью этих антител, мы показали, что A11-положительные значения1-42 в значения1-42 олигомер богатые образцы, которые были подготовлены согласно протоколу (главным образом появилась олигомеров, но не OC-положительные значения1-42 фибриллярного агрегатов, Рисунок 2). С помощью 6E10 антитела анти значения, мы наблюдали, что количество значения1-42 пептиды был похож на HFIP-распущена значения1-42 мономера примеры и значения1-42 олигомер-богатые люди (рис. 2).
Рисунок 2 . Точка blotting анализ значения1-42 мономера и значения1-42 олигомер богатые образцы. (A) HFIP-распущена значения1-42 мономера образца (10 мкм) и1-42 олигомер богатые образца значения (10 мкм), подготовленный в соответствии с настоящим Протоколом были рассмотрены dot промокательной анализ с использованием антител анти олигомера A11, анти фибриллярный 6E10 антитела антитела OC и анти Aβ олигомера. (B - D) полуколичественного анализа серого была исполнена ImageJ. Данные, выраженные в процентах от элемента управления, были среднее ± SEM 3 независимых экспериментов; *** p < 0,001 против группы мономера значения1-42 (ANOVA и t-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Для дальнейшего расследования, если этот протокол может использоваться для экрана ингибиторы значения1-42 олигомеров, куркумин, был использован ингибитор известный Олигомер значения. Мы обнаружили, что Сопредседатель инкубации с куркумин (0.1 - 1 мкм) значительно уменьшается относительное количество A11-положительные значения1-42 олигомера, о чем свидетельствует снижение пятнать A11 в куркумин совместно инкубирован значения1-42 олигомера образце чем в нормальный инкубирован значения1-42 олигомер богатые образца (рис. 3). В том же состоянии, куркумин (0.1 - 1 мкм) не изменяют количество значения1-42 пептидов, как окрашивание 6E10 было даже во всех образцах (рис. 3).
Рисунок 3 . Точка blotting анализ куркумин, совместно инкубирован значения1-42 олигомер богатые образцы. (A) HFIP-распущена значения1-42 мономеров (10 мкм) были подготовлены в соответствии с настоящим Протоколом и инкубировали с или без куркумин (0, 0,1, 1 мкм) под встряхивания в течение 48 ч. Образцы были рассмотрены точка промокательной анализ с использованием A11 и 6E10. (B) серого полуколичественного анализа была исполнена ImageJ. Данные, выраженные в процентах от элемента управления, были среднее ± SEM 3 независимых экспериментов; *** p < 0,001 против только группа значения1-42 (ANOVA и Тьюки тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Чтобы проверить олигомера формирования, мы также использовали-Денатурирующий гель. Мы обнаружили, что олигомера (> 4 KD) присутствовал в образце значения олигомер богатые1-42 , в то время как большинство мономера (4 KD) был найден в образце мономера значения1-42 (Рисунок S1).
Мы исследовали значения агрегатов в надосадке и Пелле образца значения1-42 . После 48 ч инкубации значения1-42 олигомера, но не значения1-42 фибриллярного агрегаты были найдены в надосадке образца определяется A11, OC и 6E10 антител (Рисунок S2). В том же состоянии в Пелле образца (Рисунок S2) были найдены значения1-42 фибриллярного агрегатов, но не значения1-42 олигомеров.
Мы также изучили морфологии образца1-42 значения куркумин лечение с помощью ТЕА. Куркумин лечение образец содержит несколько сферических пятен, предполагая, что куркумин может уменьшить количество значения1-42 олигомера (Рисунок S3).
Рисунок S1 . Non Денатурирующий гель электрофорез анализ Aβ1-42 мономера и Aβ1-42 олигомер богатые образцы. HFIP-растворяют Aβ1-42 мономера примеры (10 мкм) и Aβ1-42 олигомер богатые (5 мкм, низкая; 10 мкм, высокий) подготовлен в соответствии с настоящим Протоколом были рассмотрены-Денатурирующий гель-электрофорез с помощью 6E10 антитела анти значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке С2 . Супернатант Aβ1-42 решения содержит главным образом олигомера, но не фибриллярного агрегатов. Раствор Aβ1-42 (50 мкл), после встряхивания в течение 48 ч, центрифугируют в 18000 g x 10 мин. Супернатант была собрана и Пелле была повторно растворяют в 850 мкл двойной дистиллированной воды. Супернатант и Пелле далее были рассмотрены пробирного блот точка, с использованием OC, A11 и 6E10 антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке S3 . Анализ ТЕА куркумин совместно инкубировали Aβ1-42 олигомер богатые образцы. HFIP-растворяют Aβ1-42 мономеров (10 мкм) были подготовлены согласно протоколу и инкубировали с 1 мкм куркумин под встряхивания в течение 48 ч. Образцы были рассмотрены ТЕА. Шкалы бар = 100 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы сообщали метод подготовить образцы, содержащие значения1-42 олигомера и для анализа количества A11-положительные значения1-42 олигомера с точкой промокательной анализа. Хотя наши методы для подготовки значения1-42 олигомер богатые образцы являются довольно простых, надежных и воспроизводимых, есть еще некоторые моменты, чтобы быть замеченным. Во-первых HFIP используется для растворения синтетический пептид1-42 значения. Совокупные пептидной1-42 значения можно разбирать на мономера в HFIP растворе. Однако HFIP легко испаряться, и вязкость HFIP является очень низким. Таким образом пептид1-42 значения должен быть распущен в HFIP и решение HFIP должно быть aliquoted так же быстро, как можно уменьшить потенциальные потери HFIP во время операции. Кроме того наконечники должны быть отрезаны обеспечить точное дозирование в этой процедуре. Во-вторых газ азот высокой чистоты используется для испарения HFIP из решения. Во время этой процедуры значения1-42 решения должны быть поколеблен время от времени обеспечить, что HFIP может быть полностью испарилась. В конце этой процедуры запах HPIF не должен быть обнаружены в решении. Как правило 30 минут испарения снижает концентрацию HFIP менее чем 0,1%. На этой концентрации HFIP сообщается не изменить переход конформации значения1-427. В-третьих, при подготовке образцы, содержащие значения1-42 олигомера, минимальный объем жидкости должно быть больше, чем 50 мкл. в противном случае, образцы правоподобны для того рассеять в маленькие капельки, прикрепление к стене трубы. Кроме того значения1-42 мономера не может сформировать олигомера без тщательного перемешивания.
Протокол подготовить пример значения1-42 олигомер богатые, как описано здесь немного отличается от некоторых протоколов, используемых в других группах. Например в некоторых исследованиях, HFIP был испаряется перед добавлением двойных дистиллированной воды в раствор8,9. Однако в таком состоянии, пептид1-42 значения могут образовывать небольшие листы, которые трудны для того растворить в раствор. Таким образом мы решили сначала добавить двойной дистиллированной воды и затем испаряются HFIP газом азота. Самое главное олигомерных формы агрегатов, подготовленный этот протокол подтверждаются ТЕА. Кроме того, значения1-42 олигомера формируется этот протокол может побудить нейротоксичности в SH-SY5Y клеток и первичных Нейроны гиппокампа и снижения когнитивных функций после инъекции в область гиппокампа мышей, предполагая, что значения1-42 олигомера подготовлен является весьма токсичны5,10. Эти результаты согласуются с предыдущих исследований11.
Этот протокол для оценки A11-положительные значения1-42 олигомера blotting анализ точка все еще имеет некоторые недостатки. Во-первых с помощью ручной отбор проб, это не легко держать капли одинаковыми по размеру. Во-вторых, точка промокательной анализ полуколичественного но если требуются не количественный метод для измерения количества A11-положительные значения1-42 олигомера, предполагая, что другие методы, такие как ELISA, точной оценки количества значения1-42 олигомера является необходимым. В-третьих некоторые препараты могут реагировать на антитела, ведущих к ложных положительных результатов.
В общем мы обеспечили надежный протокол подготовить образцы, содержащие1-42 олигомера A11-положительные значения и для анализа количества A11-положительные значения1-42 олигомера с помощью промокательной пробирного точка. Используя этот протокол, потенциальные значения1-42 олигомера ингибиторы с потенциалом для лечения АД может проверяться эффективно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана субсидий из национального естественных наук фонд Китая (U1503223, 81673407, 21475131), применяется исследовательский проект на некоммерческой технологии провинции Чжэцзян (2016C 37110), Нинбо международной науки и технологии Проект сотрудничества (2014D 10019), Нинбо муниципальных Инновации команда жизни науки и здравоохранения (2015C 110026), Нинбо Sci & Tech проекта для общего благосостояния (2017C 50042), Li Dak сумма ИП Чин Yio Кеннет ли морской Фонд развития биофармацевтической, и Magna Вонг C. K. Фонд университета Нинбо.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All - automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
References
- Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
- De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
- Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
- Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
- Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256 (2015).
- Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
- Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
- Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
- Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
- Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).
- Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).
