Summary
このプロトコルでは、体外で合成ペプチド a β オリゴマーを準備しドット解析をしみが付くことによって a β オリゴマーの相対量を評価する方法について説明します。
Abstract
Β アミロイド (a β) は集計に自己組み立てるに本質的な傾向と疎水性ペプチドです。各種骨材の中で a β オリゴマーはアルツハイマー病 (AD) の進行中の主要な神経毒として広く受け入れられている、AD の発症に重要なイベントであると見なされます。したがって、a β オリゴマー阻害剤が神経変性を防ぐため、疾患修飾として開発される可能性を秘めている AD の治療。しかし、a β オリゴマーの異なる形成プロトコルは、異なる特性を持つオリゴマーに可能性があります。さらに、効果的に画面 a β1-42オリゴマー阻害する多くの方法がないです。A11 抗体は逆平行 β シート構造を持つ有毒な a β1-42のオリゴマーのサブセットと反応できます。このプロトコルでは、合成 a β1-42ペプチド体外から A11 正 a β1-42オリゴマーの豊富なサンプルを準備し、ドットのしみが付くことによってサンプルの A11 正 a β1-42のオリゴマーの相対量を評価する方法について述べるA11 と a β1-42を用いた解析-特定 6E10 抗体。このプロトコルを使用して、A11 正 a β1-42のオリゴマーの阻害剤は、半定量的な実験結果から上映されることができます。
Introduction
アルツハイマー病 (AD) は、高齢者の世界的な1に影響を与える最も重要な神経変性疾患の一つです。Β アミロイド (a β) の異常凝集が広告の主要な病理要因かもしれないことが広く受け入れられます。A β の凝集体は、老人斑、AD 患者の脳の生物学的マーカーの 1 つの主要なコンポーネントです。さらに、特に、オリゴマーを含めて、a β の集計は、AD の進行性神経細胞死の原因かもしれない強力な毒性を作成します。したがって、a β オリゴマー形成の抑制、神経変性を妨げる可能性し、a β オリゴマー阻害剤は、疾患修飾として開発される可能性 AD の治療。多くの研究は、オリゴマー体外を形成、人工の a β オリゴマーの構造と形態を探検し、調査を使用して生体外モデル2,3 a β オリゴマーの阻害剤を合成 a β ペプチドを使用しています。,4します。 しかし、a β オリゴマー形成プロトコル別の in vitroの異なる研究グループ間で比類のない結果が生じる別の形態学的特性を持つオリゴマーに 。したがって、a β オリゴマーの形成の標準的なプロトコルが急務します。
今までは、a β オリゴマーが直接検出することがない多くの方法を報告されています。透過電子顕微鏡 (TEM)、非変性ゲル電気泳動法、酵素免疫測定法 (ELISA) と分析にしみが付く点は、量および/または a β オリゴマー体外5,の形態を検討する使用ことができます。6。 形態と a β オリゴマー構造を TEM で観察するたとえば、します。相対的な量、a β の集計の分子サイズは、非変性ゲル電気泳動法によって測定できます。Elisa 法は、血清、血漿、脳組織からの抽出物で a β オリゴマーを決定する使用できます。最後に、ドット解析技術で検出すると、しみが付くことを分析して、タンパク質の同定に使えるオリゴマーおよび a β に固有の抗体の助けを借りて、異なるサンプル a β オリゴマーの相対濃度を評価します。また、試金を吸い取りドット ゲル電気泳動およびゲルのあぶらとりのプロシージャは必要ないため大幅な時間節約を提供しています。したがって、この試金は通常、画面 a β オリゴマー阻害剤を使用します。このプロトコルの全体的な目標は、ブロッティング解析、ドット、画面 a β オリゴマー a β1-42のオリゴマーの量を分析するため、a β1-42オリゴマーの豊富なサンプルを準備する比較的単純な信頼性と再現性のあるメソッドを記述するのには半定量的実験結果を用いた阻害剤。
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Protocol
1. ソリューションの準備
注: は、試薬ソースの材料表を参照してください。
- 5% ウシ血清アルブミン (BSA) ソリューションを準備するには、二重蒸留水 100 mL に BSA の 5 g を追加します。ボルテックスによってそれらを完全にミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
- 5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L の追加によって反オリゴマー抗体 A11 溶液 (1:1, 000) を準備します。ボルテックスによってそれらを完全にミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
- 抗 a β 抗体 6E10 溶液 (1:1, 000) を準備するには、5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L を追加します。ボルテックスでは、完全にそれらをミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
- アンチ維オリゴマー抗体 OC 溶液 (1:1, 000) を準備するには、5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L を追加します。ボルテックスでは、完全にそれらをミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
- 二重蒸留水 1,000 mL に 24 g のトリス基地と NaCl の 88 g を追加することによって、含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 原液を準備します。7.4 に pH を調整します。3 ヵ月 4 ° C でソリューションを保存します。
- 準備トリス緩衝生理食塩水とトゥイーン 20 (TBST) ソリューション Tween 20 1 mL を 100 mL の TBS に追加することによって在庫ソリューションと 900 mL ダブル蒸留水。
- わさびの 10 μ L 追加ペルオキシダーゼ (HRP) ヤギ抗うさぎ IgG (H + L) TBST 溶液 10 mL に二次抗体溶液を準備します。ボルテックスによってそれらを完全にミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
- ジメチルスルホキシド (DMSO) 10 mM クルクミン在庫ソリューションを形成するための 1 つの mL でクルクミンの 3.68 g を溶解します。
- 2 mL の 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP) 2.5 Mg/ml と a β の単量体ソリューションを形成するのに合成 a β1-42の 5 mg を溶解します。室温 (25 ° C) で 20 分、100 μ 因数の配置し、-20 ° C で 6 ヶ月保存します。
注: この手順をできるだけ速く実行する必要があります。ピペット チップは、正確なピペッティングを確実に切断する必要があります。 - 1:1 の容積比で ECL 流体 A と B を混ぜて電気化学発光 (ECL) 液を準備します。このソリューションは、使用直前準備する必要があります。
2. サンプル準備
注: は、ブロッティング解析ドットの前に 2 日間サンプル準備を実行します。
- A β1-42モノマー溶液のチューブに二重蒸留水の 900 μ L を追加します。a β1-42の濃度は 0.25 mg/mL になります。20 分間室温で混合物を配置します。
- その量は約 850 μ L まで高純度の窒素ガスでソリューションを蒸発させます。A β1-42溶液の濃度は、0.29 mg/mL になります。
注: ソリューションを随時で動揺して、HFIP が完全に蒸発することを確認する必要があります。通常、蒸発の 30 分後に残液量は約 850 μ L です。 - 二重蒸留水でクルクミン作業ソリューション (0.2 2 μ M) にクルクミン原液を希釈します。A β1-42のソリューションとクルクミン作業ソリューション 1:1 の容積比で混ぜます。クルクミンの最終濃度は、0.1 と 1 μ M になります。
注: 必要な場合任意の割合で a β1-42のソリューションの潜在的なオリゴマー阻害剤に混在できます。 - 磁気攪拌機でソリューションを継続的に振る (材料の表を参照してください)。
- 磁気攪拌機にプラスティック ボックスを修正します。場所 2 磁気は 2 ボックスのコーナーでバーをかき混ぜるし、ボックスの中央にサンプル チューブを置きます。
- 48 時間室温 (25 ° C) でボックスを振る。
注: 磁気攪拌機の速度は約 60 rpm です。
- 4 ° C で 15 分間チューブを遠心し、18,000 x g. 収集上清。
3. ドットのしみが付く分析
注: すべての孵化は水平シェーカーで行われます。
- 硝酸セルロースの膜は、1 cm 幅の短冊状にカットします。
注: 硝酸セルロースの膜の幅は、実験のニーズに応じて調整できます。 - 2 ストリップ (ストリップ 1 と 2) 各ポイント間隔 0.5 cm に 2 μ L のサンプルを均等に配置します。
- バンドに液滴が乾くまで、5 分間室温でストリップを配置します。
- 室温で 30 分間 5 %bsa 溶液によるストリップを孵化させなさい。
- 室温で 5 分間 TBST ソリューションとストリップをすすいでください。
- TBST ソリューションを吸い出しなさい。室温で 1 時間インキュベート ストリップ 1 反オリゴマー抗体 A11 ソリューションとストリップ抗 a β 抗体 6E10 ソリューションと 2。
- 3 回部屋の温度で 5 分間ずつ TBST ソリューションとストリップをすすいでください。
- TBST ソリューションを吸い出しなさい。室温で 40 分間二次抗体溶液でストリップを孵化させなさい。
- 3 回部屋の温度で 5 分間ずつ TBST ソリューションとストリップをすすいでください。
- ストリップの表面に混合の ECL 流体を均等に適用されます。イメージング システム自動発光でストリップを公開 (材料の表を参照してください)。
注: 通常、300 μ L の ECL 流体膜 1 つのための十分です。膜は、露光中に湿った保たれなければなりません。露出時間は、イメージング システムによって自動的に計算されます。 - 半定量的な結果を取得する ImageJ (健康の国民の協会) または別の画像処理ソフトウェアを使用してグレースケール分析を行います。
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Representative Results
A β1-42の単量体が準備の後 a β1-42オリゴマーを形成できるかどうかを調べるには、TEM 分析を使用しました。HFIP 溶解 a β1-42モノマー サンプル (図 1A) で表示される集計は認められなかった。また、周りの直径を持つ主に球状骨材 10 80 nm で観察された a β1-42サンプルの振動、48 時間後 a β1-42の準備 (図 1B) 後オリゴマーを形成することを示唆しています。
図 1.A β1-42のモノマーと a β1-42オリゴマーの豊富なサンプルの TEM 分析します。HFIP 溶解 a β1-42モノマー サンプル (10 μ M)、この議定書に基づき a β1-42オリゴマーの豊富なサンプル (10 μ M) は、TEM により調べた.スケール バー = 200 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
さらに、点のしみの分析はサンプルに a β1-42のオリゴマーの相対量を評価する使用されました。A11 抗体が逆平行 β シート構造を持つ有毒の a β オリゴマーのサブセットと反応できます。パラレル レジスタの β シート構造を有する繊維骨材を OC 抗体が反応します。これらの抗体を使用して、我々 はその A11 正 a β1-42を実証オリゴマー、しかしない OC 正 a β1-42維凝集体、主に作製したプロトコル (a β1-42のオリゴマーの豊富なサンプルで登場図 2)。抗 a β 抗体 6E10 を用いた a β1-42ペプチド数 HFIP 溶解 a β1-42モノマー サンプル、および a β1-42のオリゴマーの豊富なサンプル (図 2) で類似していたことがわかった。
図 2.オリゴマーの豊富なサンプル a β1-42のモノマーと a β1-42のしみが付く分析をドットします。ドット反オリゴマー抗体抗維、A11 を用いたしみが付くことによって、HFIP 溶解 a β1-42 (A) モノマー サンプル (10 μ M)、この議定書に基づき a β1-42オリゴマーの豊富なサンプル (10 μ M) を調べたオリゴマーの OC、抗体と抗 a β 抗体の 6E10。(B ・ D) ImageJ でグレースケールの半定量的な解析を行った。コントロールの割合として表される、データが 3 の独立した実験の平均 ± SEM***p < 0.001対a β1-42のモノマー グループ (分散分析とt-テスト)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
さらに a β1-42オリゴマー、クルクミン、画面阻害剤にこのプロトコルを使用することができる場合を調査するため知られている a β オリゴマー阻害剤が使用されました。クルクミンと共同の孵化を分かった (0.1 - 1 μ M) クルクミン共同培養 a β1-42オリゴマーのサンプルより A11 の減らされた染色によって証明されるよう A11 正 a β1-42のオリゴマーの相対量を大幅に削減、通常孵化 a β1-42オリゴマーの豊富なサンプル (図 3)。同じ条件、クルクミンで (0.1 - 1 μ M) すべてのサンプル (図 3) にもいた 6E10 の染色として a β1-42ペプチド数変わりませんでした。
図 3.オリゴマーの豊富なサンプル クルクミン共同培養 a β1-42のしみが付く分析をドットします。HFIP 溶解 a β1-42 (A) モノマー (10 μ M) をこのプロトコルに従って調製し、クルクミンの有無を培養 (0、0.1、1 μ M) 48 h の揺れの下。A11 と 6E10 を用いた解析をしみが付くことのドットでサンプルを調べた。(B) 半定量的なグレースケールの分析は、ImageJ によって行われました。コントロールの割合として表される、データが 3 の独立した実験の平均 ± SEM***p < 0.001対a β1-42単独群 (ANOVA および Tukey のテスト)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
オリゴマー形成を確認するには、我々 はまた非変化のゲルを使用しています。そのオリゴマーを見つけました (> 4 KD) a β1-42のオリゴマーの豊富なサンプルのほとんど単量体中に存在していた (4 KD) a β1-42モノマー サンプル (図 S1) で発見されました。
上澄みと a β1-42サンプルのペレットで a β の集計を行った。培養 48 時間後 a β1-42のオリゴマーがない a β1-42維集計は、A11、OC、6E10 抗体 (図 S2) によって決定されるサンプルの上澄みで発見されました。同じ条件で a β1-42維集計ですがない a β1-42のオリゴマーは、サンプル (図 S2) のペレットで発見されました。
断面 TEM による a β1-42のクルクミン処理サンプルの形態を検討するも.クルクミン処理サンプルには、そのクルクミンが a β1-42オリゴマー (図 S3) の量を減らすことができることを示唆いくつかの球形スポットが含まれています。
図 S1.Aβ1 42 モノマー、Aβ1 42 オリゴマーの豊富なサンプルのゲルの電気泳動分析の非変性します。HFIP 溶解 Aβ1 42 モノマー サンプル (10 μ M) と Aβ1 42 オリゴマーの豊富なサンプル (5 μ M、低; 10 μ M、高) にこのプロトコルにしたがって調製された非変性ゲル電気泳動による抗 a β 抗体 6E10 を使用して検討しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 S2.Aβ1 42 溶液の上澄みが含まれて主にオリゴマー、ないない繊維集合体。Aβ1 42 ソリューション (50 μ L)、48 h の揺れの後、10 分間 18,000 × g で遠心分離だった。上澄みを採取され二重蒸留水の 850 μ L で再溶解したペレット。上澄みとペレットさらに OC、A11、6E10 抗体を用いたドット プロット法によって検討しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 S3.クルクミンの TEM 分析は、共同 Aβ1 42 オリゴマーの豊富なサンプルをインキュベートします。HFIP 溶解 Aβ1 42 モノマー (10 μ M) この議定書に基づき、48 h の揺れで 1 μ M クルクミンと孵化させます。サンプルは、TEM により調べた.スケールバー = 100 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは a β1-42のオリゴマーを含む試料を準備する分析をしみが付くことのドットで A11 正 a β1-42のオリゴマーの量を分析する方法を報告しています。A β1-42オリゴマーの豊富なサンプルの準備のための私たちの方法はかなりシンプルで、信頼性と再現性のある、まだ気づかれるべきいくつかのポイントがあります。まず、HFIP、合成 a β1-42ペプチドを溶解するために使用されます。集計の a β1-42ペプチドを HFIP ソリューション中のモノマーに分解することができます。しかし、HFIP は揮発しやすい、HFIP の粘度が非常に低い。したがって、HFIP に a β1-42ペプチドを溶解する必要があります、HFIP ソリューションは検体操作中に HFIP の潜在的な損失を減らすためにできるだけ早くする必要があります。また、ピペット チップをこの手順で正確な分注を確実に遮断。第二に、純度の高い窒素ガスを使用して、ソリューションから HFIP を蒸発します。この中に、a β1-42のソリューションは、HFIP が完全に蒸発することができるように随時動揺する必要があります。この手順の最後に、HPIF の香りをソリューションで検出されない必要があります。通常、30 分蒸発量の 0.1% 未満に HFIP の濃度が低下しました。この濃度で HFIP は a β1-427の構造遷移を変更しないことにされます。第三に、a β1-42のオリゴマーを含むサンプルを準備しているとき液体の最低量は 50 μ L より大きいする必要がありますそれ以外の場合、サンプルがチューブの壁に取り付け、小さな水滴に散布する可能性が高い。また、a β1-42のモノマーは、徹底した混合せずオリゴマーを形成できません。
ここで説明した a β1-42のオリゴマーの豊富なサンプルを準備するためのプロトコルが他のグループで使用されるいくつかのプロトコルから異なっています。たとえば、いくつかの研究で HFIP だったソリューション8,9に二重蒸留水を追加する前に蒸発させた。しかし、このような条件で a β1-42ペプチドは溶液に溶解しにくい小さなシートをフォームがあります。したがって、まず、二重蒸留水を追加し、窒素ガスによる、HFIP を蒸発しました。最も重要なは、このプロトコルにより作製した集合体のオリゴマーの図形は、TEM によって確認しています。さらに、このプロトコルによって形成された a β1-42オリゴマーを SH SY5Y 細胞と一次海馬ニューロンの神経毒性を誘発するでき、示唆マウスの海馬領域に注入後認知パフォーマンスが低下 a β1-42オリゴマーの準備はかなり有毒な5,10です。これらの結果は、以前の研究11と一致しています。
まだ、A11 正 a β1-42のオリゴマーをドットのしみが付く分析評価するこのプロトコルには、いくつかの欠点があります。まず、手動のサンプリングを使用して、サイズの均一液滴を維持する簡単はありません。第二に、ブロッティング解析ドットは半定量的なしかし、A11 正 a β1-42のオリゴマー、ELISA などその他の方法を示唆しているの量を測定するない定量法が必要な場合 a β 1-42の量の正確な評価オリゴマーが必要です。第三に、いくつかの薬は、偽陽性の結果につながる抗体に反応するかもしれません。
一般的には、A11 正 a β1-42のオリゴマーを含む試料を準備してアッセイを吸い取りドットを使用して A11 正 a β1-42のオリゴマーの量を分析する信頼性の高いプロトコルを提供しています。このプロトコルは、潜在的な a β1-42のオリゴマーを用いた広告を扱う可能性を秘めた阻害剤は効果的に上映される可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、国家自然科学基金、中国の (U1503223、81673407、21475131)、浙江省の非営利技術 (2016 C 37110)、寧波国際科学技術に関する応用研究プロジェクトからの補助金によって支えられました。協力プロジェクト (2014 D 10019)、生命科学と健康 (2015 C 110026)、寧波科学技術プロジェクト共通の富 (2017 C 50042) オフイオチューカンあご・ ケネス ・李海洋バイオ医薬品開発基金李 Dak 合計イップ ・寧波市革新チーム・寧波大学 k. c. ウォン マグナ基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All - automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
References
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