Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין oligomers Aβ פפטיד סינתטי במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של אוליגומר Aβ על ידי נקודה סופג ניתוח.
Abstract
Β-עמילואיד (Aβ) הוא פפטיד הידרופוביות עם נטייה מהותי בעצמם לתוך אגרגטים. בין אגרגטים שונים, Aβ אוליגומר מקובל כמו עצבי מוביל בההתקדמות של מחלת אלצהיימר (AD), נחשבת לאירוע מכריע בפתוגנזה של המודעה. לכן, Aβ אוליגומר מעכבי יכול למנוע הקשורים ניוון מוחיים ו יש את הפוטנציאל להיות מפותח כמו מחלות שינוי טיפולי של AD. עם זאת, צורה שונה הפרוטוקולים של Aβ אוליגומר עלול להוביל oligomers עם מאפיינים שונים. יתר על כן, אין שיטות רבות מעכבי אוליגומר מסך ביעילות1-42 Aβ. נוגדן A11 יכולה להגיב עם ערכת משנה של רעילים אוליגומר1-42 Aβ במבנים β-גיליון אנטי-מקביל. ב פרוטוקול זה, אנו מסבירים כיצד להכין דוגמה אוליגומר עשיר A11-חיוביות Aβ1-42 סינתטי Aβ1-42 פפטיד במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של A11-חיוביות Aβ1-42 אוליגומר בדגימות מאת סופג נקודה ניתוח באמצעות A11 ו Aβ1-42-נוגדנים ספציפיים 6E10. באמצעות פרוטוקול זה, מעכבי של A11-חיוביות Aβ1-42 אוליגומר יכולים גם להיות מוקרן מתוצאות הניסוי הכמותיים למחצה.
Introduction
מחלת אלצהיימר (AD) היא אחת ממחלות ניווניות החשוב ביותר המשפיעים על קשישים ברחבי העולם1. מקובל כי הצבירה חריגה של β-עמילואיד (Aβ) עשוי להיות הגורם המוביל פתולוגי של AD. Aβ אגרגטים הם המרכיבים העיקריים של הפלאק סנילי, אחד סמנים ביולוגיים במוחם של חולי אלצהיימר. יתר על כן, אגרגטים Aβ, כולל oligomers בפרט, לייצר neurotoxicity חזק, אשר עשוי להיות הגורם למוות עצביים התקדמות לספירה. לכן, עיכוב של היווצרות אוליגומר Aβ עשוי למנוע הקשורים ניוון מוחיים, Aβ אוליגומר מעכבי יכול להתפתח כמו מחלות שינוי טיפולי של AD. מחקרים רבים השתמשו פפטיד Aβ סינתטי כדי ליצור oligomers חוץ גופית בתוך, מורפולוגיות ו מבנים של oligomers Aβ מלאכותיים, ולחקור את מעכבי של Aβ אוליגומר באמצעות במבחנה מודלים2,3 , 4. עם זאת, שונה במבחנה היווצרות הפרוטוקולים של Aβ אוליגומר עלול להוביל אוליגומר עם מאפיינים מורפולוגיים שונים, אשר עלול לגרום התוצאות למחפשי בקרב קבוצות מחקר שונות. לכן, עבור Aβ אוליגומר פרוטוקול סטנדרטי היווצרות דרוש בדחיפות.
עד עכשיו, שיטות רבות לא דווחו ישירות לאתר Aβ oligomers. שידור מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM) שאינם denaturing בג'ל, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), נקודה סופג ניתוח יכול לשמש כדי לבחון את כמות ו/או המורפולוגיה של Aβ אוליגומר במבחנה5, 6. לדוגמה, המורפולוגיה ואת המבנה של Aβ אוליגומר יכול להיות שנצפו ב- TEM. כמויות יחסיות והגודל המולקולרי של הסיכומים Aβ יכול להימדד על-ידי-denaturing בג'ל. אליסה יכול לשמש כדי לקבוע Aβ אוליגומר סרום, פלזמה, תמציות של רקמת המוח. לבסוף, נקודה סופג ניתוח, טכניקה המשמשת לזיהוי, ניתוח וזיהוי של חלבונים, ניתן להשתמש כדי להעריך את הריכוז היחסי של Aβ אוליגומר בדגימות שונות בעזרת נוגדנים אוליגומר וספציפיות Aβ. יתר על כן, נקודה סופג assay מציעה חיסכון משמעותי בזמן, בג'ל וההליכים blotting ג'לים אינם נדרשים. לכן, assay זה משמש בדרך כלל כדי מסך פוטנציאלי Aβ אוליגומר מעכבי. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה יחסית פשוטה, אמינים ובעלי לשחזור להכין דוגמה אוליגומר עשיר1-42 . Aβ, כדי לנתח את הכמויות של Aβ1-42 אוליגומר על ידי dot סופג ניתוח, וכדי מסך Aβ אוליגומר מעכבי באמצעות תוצאות ניסויי למחצה כמותית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פתרון הכנה
הערה: ראה טבלה של חומרים עבור ריאגנט מקורות.
- להכין פתרון 5% אלבומין שור (BSA) על-ידי הוספת 5 g של BSA 100 מ של מים מזוקק פעמיים. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
- להכין פתרון A11 נוגדן אנטי אוליגומר (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של הפתרון BSA 5%. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
- להכין פתרון 6E10 נוגדן anti-Aβ (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של 5% BSA פתרון. מערבבים אותם לחלוטין על-ידי vortexing. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
- להכין פתרון OC נוגדן anti-fibrillar אוליגומר (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של 5% BSA פתרון. מערבבים אותם לחלוטין על-ידי vortexing. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
- להכין באגירה טריס מלוחים (TBS) מניות פתרון על-ידי הוספת 24 גרם של טריס בסיס ו- g 88 של NaCl 1,000 מיליליטר מים מזוקק פעמיים. להתאים את ה-pH ל 7.4. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד 3 חודשים.
- להכין תמיסת מלח באגירה טריס והפתרון Tween-20 (TBST) על-ידי הוספת 1 מ"ל של רצף-20 100 מ של TBS מניות פתרון ו- 900 מל מזוקק פעמיים מים.
- להכין פתרון נוגדנים משניים על-ידי הוספת 10 µL של חזרת peroxidase (HRP) העז נגד הארנב IgG (H + L) עד 10 מ"ל של פתרון TBST. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
- להמיס 3.68 g של כורכומין ב 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כדי ליצור פתרון מניות כורכומין 10 מ מ.
- להמיס 5 מ"ג של Aβ סינתטי1-42 ב- 2 מ של 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-פרופנול (HFIP) כדי ליצור פתרון מונומר Aβ 2.5-מ"ג/מ"ל. מקום זה בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 20 דקות להפוך 100 µL aliquots ולאחסן ב-20 ° C עד 6 חודשים.
הערה: הליך זה אמורה לפעול מהר ככל האפשר. אמור לנתק את הטיפים פיפטה כדי להבטיח pipetting מדויק. - להכנת נוזל electrochemiluminescence (ECL) על ידי ערבוב ECL נוזל A ו- B עם יחס נפח של 1:1. הפתרון צריך להיות מוכן רק לפני השימוש.
2. הכנת הדוגמא
הערה: בצע את הכנת הדוגמא 2 ימים לפני הנקודה סופג ניתוח.
- להוסיף µL 900 של מים מזוקק פעמיים שפופרת של Aβ1-42 מונומר פתרון; הריכוז של Aβ1-42 תהיה 0.25 מ"ג/מ"ל. מניחים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
- להתנדף הפתרון עם גז חנקן טוהר גבוהה עד הנפח שלה µL עם-850. הריכוז של הפתרון1-42 Aβ יהיה על 0.29 מ"ג/מ"ל.
הערה: הפתרון צריך מנערים מפעם לפעם כדי להבטיח ש-HFIP הוא התאדה במלואו. בדרך כלל, לאחר 30 דקות של אידוי, אמצעי האחסון של הפתרון שיורית נמצא µL עם-850. - את הפתרון מניות כורכומין הפתרון עובד כורכומין (0.2 ו- 2 מיקרומטר) מדולל עם מים מזוקק פעמיים. מערבבים את פתרון1-42Aβ וכורכומין עובד פתרון עם יחס נפח של 1:1. הריכוזים הסופי של כורכומין יהיה 0.1 1 מיקרומטר.
הערה: מעכבי אוליגומר פוטנציאלי יכול להיות מעורב עם הפתרון1-42 Aβ כל יחס במידת הצורך. - לנער את הפתרון באופן רציף ב מסית מגנטי (ראה טבלה של חומרים).
- לתקן תיבה מפריד פלסטיק התועמלן מגנטי. מניחים 2 מגנטי מערבבים ברים ב 2 פינות של תיבת ולמקם הצינורות מדגם במרכז תיבת.
- לנער את תיבת בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 48 שעות.
הערה: המהירות של התועמלן מגנטי הוא בסביבות 60 סל ד.
- Centrifuge הצינורות במשך 15 דקות ב 4 ° C ו- g x 18,000 לאסוף תגובת שיקוע.
3. נקודה סופג ניתוח
הערה: כל incubations המבוצעות מטרף אופקי.
- חתוך ניטרוצלולוזה ממברנה לרצועות רחב 1 ס"מ.
הערה: הרוחב של קרום ניטרוצלולוזה ניתן להתאים בהתאם לצרכים ניסיוני. - במקום 2-µL דגימות באופן שווה על 2 רצועות (רצועת 1 ו- 2) עם כל מרווח נקודת-0.5 ס מ.
- מניחים את הרצועות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות עד ה-droplet על הלהקה יבש.
- דגירה את הרצועות עם פתרון BSA 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- האחות הפתרון TBST. עבור h 1 בטמפרטורת החדר, דגירה רצועת 1 עם נוגדן אנטי אוליגומר A11 פתרון ולהפשיט 2 עם פתרון 6E10 של נוגדן anti-Aβ.
- לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST שלוש פעמים, כל פעם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- האחות הפתרון TBST. דגירה את הרצועות עם פתרון נוגדנים משניים עבור 40 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST שלוש פעמים, כל פעם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- באופן שווה להחיל את הנוזלים ECL מעורב השטח של הרצועות. לחשוף את הרצועות ב chemiluminescence אוטומטית מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים).
הערה: בדרך כלל, µL 300 של נוזל ECL מספיקה ממברנה אחת. הקרום חייב להישמר לח במהלך החשיפה. זמן החשיפה מחושבת באופן אוטומטי על ידי מערכת הדמיה. - לעשות ניתוח גווני אפור באמצעות ImageJ (המכון הלאומי לבריאות) או תוכנות עיבוד תמונה אחרת כדי להשיג תוצאות כמותיות למחצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לבדוק אם מונומר1-42 Aβ יכול ליצור אוליגומר1-42 של Aβ לאחר הכנה, שימש ניתוח TEM. אין אגרגטים גלוי נצפו במדגם מומס HFIP Aβ1-42 מונומר (איור 1א'). יתר על כן, אגרגטים בעיקר הכדוריים בקוטר של סביב 10-80 ננומטר נצפו במדגם1-42 Aβ לאחר 48 שעות של טלטולים, רומז כי Aβ1-42 טפסים oligomers לאחר הכנה (איור 1B).
איור 1 . TEM ניתוח של Aβ1-42 מונומר ודוגמאות אוליגומר עשיר Aβ1-42 - המדגם מונומר1-42 מומס-HFIP Aβ (10 מיקרומטר) ו- Aβ1-42 אוליגומר עשיר המדגם (10 מיקרומטר) המוכנים לפי פרוטוקול זה נבדקו על-ידי TEM. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
בנוסף, נקודה סופג ניתוח היה להשתמש כדי להעריך את הכמויות יחסית של Aβ1-42 אוליגומר הדגימות. נוגדן A11 יכולה להגיב עם ערכת משנה של אוליגומר רעילים Aβ במבנים β-גיליון אנטי-מקביל. נוגדן OC מגיב עם אגרגטים fibrillar במבנים β-גיליון מקבילים ב- register. באמצעות נוגדנים אלה, להדגים את A11-חיוביות Aβ1-42 oligomers, אבל לא Aβ OC-חיובי1-42 fibrillar אגרגטים, בעיקר הופיע הדגימות אוליגומר עשיר של Aβ1-42 שהוכנו על פי (פרוטוקול איור 2). באמצעות את 6E10 נוגדן anti-Aβ, הבחנו כי המספר של Aβ1-42 פפטידים היה דומה המדגם מונומר מומס HFIP Aβ1-42 , המדגם אוליגומר עשיר1-42 Aβ (איור 2).
איור 2 . נקודה סופג ניתוח של מונומר1-42 Aβ ו- Aβ1-42 אוליגומר עשיר דוגמאות. (א) מומס-HFIP Aβ1-42 מונומר מדגם (10 מיקרומטר) ו- Aβ1-42 אוליגומר עשיר המדגם (10 מיקרומטר) המוכנים לפי פרוטוקול זה נבחנו על ידי dot סופג ניתוח באמצעות נוגדן אנטי אוליגומר A11, anti-fibrillar אוליגומר נוגדן OC, anti-Aβ נוגדן 6E10. (B - D) ניתוח כמותי למחצה של גווני אפור בוצע על ידי ImageJ. הנתונים, המבוטא באחוזים של שליטה, היו זאת אומרת ± SEM של 3 ניסויים עצמאית; *** p < 0.001 מול הקבוצה מונומר Aβ1-42 (ANOVA ו- t-מבחן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
להמשיך לחקור אם פרוטוקול זה יכול לשמש כדי מעכבי מסך של Aβ1-42 oligomers, כורכומין, מעכב אוליגומר Aβ הידוע, היה בשימוש. מצאנו כי על דגירה שיתוף עם כורכומין (0.1 - 1 מיקרומטר) הקטינה באופן משמעותי את הכמויות היחסי של אוליגומר1-42 A11-חיובית Aβ, כפי שמעידים ההכתמה ירידה של A11 במדגם כורכומין משותפת incubated Aβ1-42 אוליגומר מאשר נורמלי מודגרות Aβ1-42 אוליגומר עשיר מדגם (איור 3). -באותו המצב, כורכומין (0.1 - 1 מיקרומטר) לא תשנה את המספר של Aβ1-42 פפטידים, כפי ההכתמה של 6E10 היה אפילו כל דוגמאות (איור 3).
איור 3 . נקודה סופג ניתוח של Aβ בשיתוף הדגירה של כורכומין1-42 אוליגומר עשיר דוגמאות. (א) Aβ HFIP-מומס1-42 מונומרים (10 מיקרומטר) היו המוכנים לפי פרוטוקול זה, מודגרות עם או בלי כורכומין (0, 0.1, 1 מיקרומטר) תחת רועד במשך 48 שעות. הדגימות נבדקו על-ידי נקודה סופג ניתוח באמצעות A11 ו 6E10. ניתוח כמותי למחצה בגווני אפור (B) בוצע על ידי ImageJ. הנתונים, המבוטא באחוזים של שליטה, היו זאת אומרת ± SEM של 3 ניסויים עצמאית; *** p < 0.001 מול קבוצה לבד1-42 (מבחן ANOVA, של Tukey) Aβ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
כדי לוודא אוליגומר היווצרות, גם השתמשנו ג'ל ללא denaturing. . מצאנו את אוליגומר (> 4 KD) היה נוכח בדוגמת עשיר אוליגומר1-42 Aβ, בעוד רוב מונומר (4 KD) נמצאה במדגם Aβ1-42 מונומר (איור S1).
. חקרנו Aβ אגרגטים תגובת שיקוע, גלולה המדגם1-42 Aβ לאחר 48 שעות של דגירה, אוליגומר1-42 Aβ אבל לא Aβ1-42 fibrillar אגרגטים נמצאו את תגובת שיקוע של המדגם כפי שנקבע על ידי A11 OC, 6E10 נוגדנים (איור S2). -באותו המצב, אגרגטים fibrillar Aβ1-42 אבל לא Aβ1-42 oligomers נמצאו בגדר של המדגם (איור S2).
בדקנו גם המורפולוגיה של המדגם1-42 Aβ כורכומין שטופלו באמצעות TEM. המדגם שטופלו כורכומין מכיל כמה נקודות כדורית, רומז שכי כורכומין יכול להפחית את כמות Aβ1-42 אוליגומר (איור S3).
איור S1 . Denaturing-ללא ג'ל אלקטרופורזה ניתוח של Aβ1-42 מונומר ודוגמאות אוליגומר עשיר Aβ1-42- המדגם מונומר מומס-HFIP Aβ1-42 (10 מיקרומטר) ו- Aβ1-42 אוליגומר עשיר המדגם (5 מיקרומטר, נמוך; 10 מיקרומטר, גבוה) המוכנים לפי פרוטוקול זה נבדקו על-ידי-denaturing אלקטרופורזה בג'ל באמצעות את 6E10 נוגדן anti-Aβ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור S2 . תגובת שיקוע של Aβ1-42 פתרון מכיל בעיקר אוליגומר, אך אגרגטים לא fibrillar. פתרון Aβ1-42 (50 µL), לאחר רועד במשך 48 שעות, היה centrifuged-g x 18,000 עבור 10 דקות. תגובת שיקוע נאסף, בגדר מחדש מומס ב µL 850 מים מזוקק פעמיים. תגובת שיקוע של גלולה נבדקו עוד יותר על-ידי assay כתם נקודה באמצעות נוגדנים OC, A11 ו- 6E10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור S3 . ניתוח TEM של כורכומין משותפת מודגרות דגימות אוליגומר עשיר Aβ1-42- מונומרים מומס-HFIP Aβ1-42 (10 מיקרומטר) המוכנים לפי פרוטוקול זה, מודגרות עם כורכומין 1 מיקרומטר תחת רועד במשך 48 שעות. הדגימות נבדקו על-ידי TEM. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה, אנחנו דיווחו שיטה להכין דגימות המכיל Aβ1-42 אוליגומר, וכדי לנתח כמויות A11-חיוביות Aβ1-42 אוליגומר ידי נקודה סופג ניתוח. למרות השיטות שלנו עבור הכנת Aβ1-42 אוליגומר עשיר דגימות די פשוטה, אמינים ובעלי לשחזור, ישנם עדיין כמה נקודות כדי שישימו לב אלינו. ראשית, HFIP משמש כדי להמיס את פפטיד1-42 Aβ סינתטי. פפטיד1-42 Aβ צבור יכול לפרק לתוך מונומר בפתרון HFIP. עם זאת, HFIP קל התנדפות, צמיגות של HFIP הוא נמוך מאוד. לכן, צריך להיות מומס פפטיד1-42 Aβ לתוך HFIP, הפתרון HFIP צריך להיות aliquoted מהר ככל האפשר כדי להפחית את אובדן פוטנציאלי של HFIP במהלך המבצע. יתר על כן, העצות פיפטה צריך ייחתך כדי להבטיח pipetting מדויק בהליך זה. שנית, גז חנקן טוהר גבוהה משמש מתמוססות את HFIP מהפתרון. במהלך הליך זה, צריך מנערים את הפתרון1-42 של Aβ מעת לעת על מנת להבטיח כי יכול להיות התאדו לגמרי HFIP. בסופו של הליך זה, הריח של HPIF לא שיזוהו בפתרון. בדרך כלל, 30 דקות של אידוי מפחית את ריכוז HFIP פחות מ- 0.1%. בריכוז זה, HFIP הוא דיווח לא לשנות את המעבר קונפורמציה של Aβ1-427. שלישית, בעת הכנת דוגמאות המכיל Aβ1-42 אוליגומר, נפח מינימלי של הנוזל צריך להיות גדול מ- 50 µL. אחרת, הדגימות נוטים פיזור לתוך הטיפות הקטנות, חיבור לקיר של הצינורות. כמו כן, Aβ1-42 מונומר יכול להוות אוליגומר ללא ערבוב יסודי.
פרוטוקול להכין דוגמה אוליגומר עשיר Aβ1-42 כפי שמתואר כאן שונה מעט פרוטוקולים מסוימים להשתמש בקבוצות אחרות. לדוגמה, במחקרים מסוימים, HFIP היה התאדו לפני הוספת המים מזוקק פעמיים לתוך פתרון8,9. עם זאת, במצב כזה, פפטיד1-42 Aβ עשויים בצורת יריעות קטנות, אשר קשה לפזר את הפתרון. לכן, בחרנו להוסיף מים מזוקק פעמיים קודם ולאחר מכן להתאדות של HFIP על ידי גז חנקן. והכי חשוב, צורות oligomeric של אגרגטים שהוכנו על ידי פרוטוקול זה מאושרות על-ידי TEM. יתר על כן, Aβ1-42 אוליגומר הנוצרת על-ידי פרוטוקול זה יכול לגרום neurotoxicity SH-SY5Y תאים ו נוירונים בהיפוקמפוס העיקרי ולהפחית ביצועים קוגניטיביים לאחר ההזרקה לאזור בהיפוקמפוס של עכברים, רומז Aβ1-42 אוליגומר מוכן הוא די רעיל5,10. תוצאות אלו הם עקביים עם מחקרים קודמים11.
פרוטוקול זה להעריך אוליגומר1-42 A11-חיוביות Aβ על ידי ניתוח blotting נקודה יש עדיין כמה חסרונות. ראשית, באמצעות דגימה ידנית, לא קל להשאיר את טיפות אחידים בגודלם. שנית, נקודה סופג ניתוח כמותי למחצה אך שיטה לא כמותית למדוד את הכמויות של אוליגומר1-42 A11-חיובית Aβ, מציעה שיטות אחרים, כגון, אליסה, נדרשות אם הערכה מדויקת של כמויות של Aβ1-42 אוליגומר הכרחי. שלישית, כמה תרופות עשוי להגיב הנוגדנים, מובילים לתוצאות חיוביות כוזבות.
באופן כללי, סיפקנו פרוטוקול אמין כדי להכין דגימות המכיל A11-חיוביות Aβ1-42 אוליגומר וכדי לנתח כמויות A11-חיוביות Aβ1-42 אוליגומר באמצעות נקודה סופג וזמינותו. באמצעות פרוטוקול זה, פוטנציאל Aβ1-42 אוליגומר מעכבי עם פוטנציאל לטיפול AD יכול להיות מוקרן ביעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (U1503223, 81673407, 21475131), פרויקט המחקר מיושם על טכנולוגיה ללא מטרות רווח של פרובינציית Zhejiang (2016C 37110), Ningbo הבינלאומי המדע והטכנולוגיה פרויקט (2014D 10019), הקבוצה חדשנות עירונית Ningbo של מדעי החיים ואת הבריאות (2015C 110026), Ningbo Sci & טק לפרויקט משותף עושר (ג 2017 50042), Li Dak סכום ייפ Yio הסנטר קנת Li ימית ביולוגיות פיתוח הקרן, וקרן ק ג וונג מגנה באוניברסיטת Ningbo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All - automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
References
- Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
- De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
- Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
- Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
- Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256 (2015).
- Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
- Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
- Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
- Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
- Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).
- Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).
