Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Aβ Oligomere aus einem synthetischen Peptid in Vitro vorzubereiten und relative Mengen der Aβ Oligomer durch eine Dot-Blot-Analyse zu bewerten.
Abstract
Β-Amyloid (Aβ) ist eine hydrophobe Peptid mit innewohnende Tendenz zu Aggregaten selbst zusammenstellen. Unter den verschiedenen Aggregaten Aβ Oligomer ist weithin anerkannt als der führende Nervengift in der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit (AD) und gilt als das entscheidende Ereignis in der Pathogenese der AD. Daher könnte Aβ-Oligomer-Inhibitoren verhindern Neurodegeneration und haben das Potenzial, als Disease modifying entwickelt werden Behandlungen von AD. Jedoch führen verschiedene Bildung Protokolle von Aβ Oligomer Oligomere mit unterschiedlichen Eigenschaften. Darüber hinaus gibt es nicht viele Methoden, um effektiv Bildschirm Aβ1-42 Oligomer-Inhibitoren. Ein A11 Antikörper reagieren mit einer Teilmenge der giftige Aβ-1-42 -Oligomer mit antiparallele β-Sheet-Strukturen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zur Vorbereitung einer A11-positiven Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe aus einem synthetischen Aβ1-42 Peptid in Vitro und relative Mengen der A11-positiven Aβ1-42 Oligomer in Proben von einem Dot-Blot auswerten Analyse mit A11 und Aβ1-42-spezifischen 6E10 Antikörper. Unter Verwendung dieses Protokolls, können Inhibitoren der A11-positiven Aβ1-42 Oligomer auch von semi-quantitativen experimentellen Ergebnisse gezeigt.
Introduction
Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine der wichtigsten neurodegenerativen Erkrankungen bei älteren Menschen weltweit1. Es ist weithin anerkannt, dass die abnorme Ansammlung von β-Amyloid (Aβ) möglicherweise der führenden pathologischen Faktor von AD. Aβ-Aggregate sind die Hauptbestandteile der senilen Plaques, eines biologischen Markern in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten. Darüber hinaus produzieren Aβ-Aggregate, insbesondere Oligomere potente Neurotoxizität, die möglicherweise die Ursache des neuronalen Tod AD Fortschreiten. Daher könnte die Hemmung der Aβ Oligomer Bildung Neurodegeneration verhindern und Aβ-Oligomer-Inhibitoren entwickelt werden könnte, als krankheitsmodifizierende Therapien von AD. Viele Studien haben eine synthetische Aβ-Peptid bilden Oligomere in Vitro, Morphologien und Strukturen der künstlichen Aβ Oligomere erkunden und untersuchen die Inhibitoren von Aβ-Oligomer mit in-vitro- Modelle2,3 verwendet , 4. jedoch verschiedene in-vitro- Bildung-Protokolle von Aβ Oligomer könnte zu Oligomer mit unterschiedlichen morphologischen Eigenschaften, die die unvergleichliche Ergebnisse unter verschiedenen Forschungsgruppen verursachen könnten. Ein standard-Formation-Protokoll für Aβ Oligomer ist daher dringend erforderlich.
Bis jetzt wurden nicht viele Methoden berichtet, Aβ Oligomere direkt zu erkennen. Übertragung elektronischer Mikroskopie (TEM), nicht Denaturierung Gelelektrophorese, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) und Dot-Blot-Analyse lässt sich die Menge und/oder die Morphologie von Aβ Oligomer in-vitro-5, prüfen 6. Z. B. die Morphologie und Struktur der Aβ Oligomer in TEM beobachtet werden. Die relativen Mengen und Molekülgröße Aβ Aggregationen konnte nicht Denaturierung Gelelektrophorese gemessen werden. ELISA konnte zur Aβ Oligomer in Serum, Plasma und Auszüge aus Hirngewebe herangezogen werden. Zu guter Letzt Dot-Blot-Analyse, eine Technik zur Erfassung, Analyse und Identifizierung von Proteinen, ließe sich die relative Konzentration der Aβ Oligomer in verschiedenen Proben mit Hilfe von Oligomer-spezifische und Aβ-spezifische Antikörper zu bewerten. Darüber hinaus bietet ein Dot Blot Assay deutliche Zeitersparnis, wie Gelelektrophorese und den befleckenden Verfahren für Gele nicht erforderlich sind. Daher wird dieser Test normalerweise Bildschirm potenzielle Aβ Oligomer-Inhibitoren. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine relativ einfache, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Vorbereitung einer Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe, die Mengen von Aβ-1-42 -Oligomer von Dot-Blot-Analyse und Bildschirm Aβ Oligomer analysieren zu beschreiben Inhibitoren mit semi-quantitativen experimentellen Ergebnissen.
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Protocol
1. Vorbereitung der Lösung
Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Reagenz Quellen.
- Bereiten Sie eine 5 % Rinderserumalbumin (BSA) Lösung durch Zugabe von 5 g BSA zu 100 mL bidestilliertem Wasser. Mischen Sie sie vollständig durch Vortexen sie. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
- Bereiten Sie eine Anti-Oligomer Antikörperlösung A11 (1:1 000) durch Zugabe von 10 µL der Stammlösung Antikörper zu 10 mL der Lösung 5 % BSA. Mischen Sie sie vollständig durch Vortexen sie. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
- Bereiten Sie eine Anti-Aβ Antikörper 6E10 Lösung (1:1 000) durch Zugabe von 10 µL der Stammlösung Antikörper bis 10 mL einer 5 % BSA Lösung. Mischen Sie sie vollständig durch aufschütteln. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
- Bereiten Sie eine Anti-Fibrillären Oligomer Antikörperlösung OC (1:1 000) durch Zugabe von 10 µL der Stammlösung Antikörper bis 10 mL einer 5 % BSA Lösung. Mischen Sie sie vollständig durch aufschütteln. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
- Bereiten Sie eine Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) Stammlösung 1.000 mL bidestilliertem Wasser 24 g Tris-Base und 88 g NaCl hinzu. Den pH-Wert 7,4 einstellen. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 3 Monaten.
- Bereiten Sie ein Tris gepufferte Kochsalzlösung und Tween-20 (TBST) Lösung durch Zugabe von 1 mL Tween-20 bis 100 mL von TBS Lager Lösung und 900 mL bidestilliertem Wasser.
- Bereiten Sie eine sekundäre Antikörper-Lösung durch Hinzufügen von 10 µL Meerrettich Peroxidase (HRP) Ziege Anti-Kaninchen IgG (H + L) auf 10 mL TBST Lösung. Mischen Sie sie vollständig durch Vortexen sie. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
- Lösen Sie 3,68 g von Curcumin in 1 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO), eine 10-mM-Curcumin-Stammlösung zu bilden.
- 5 mg von synthetischen Aβ-1-42 in 2 mL 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) zu einer 2,5-mg/mL Aβ Monomer Lösung zu lösen. Legen Sie sie bei Raumtemperatur (25 ° C) für 20 min. machen 100 µL Aliquots und bei-20 ° C für bis zu 6 Monate aufbewahren.
Hinweis: Dieses Verfahren sollte so schnell wie möglich ausgeführt werden. Die Pipettenspitzen sollten abgeschnitten werden, um genaues pipettieren zu gewährleisten. - Bereiten Sie Electrochemiluminescence (ECL) Flüssigkeit durch ECL Flüssigkeit A und B mit einem Volumenverhältnis von 1:1 mischen. Diese Lösung sollte kurz vor dem Einsatz vorbereitet werden.
2. die Probenvorbereitung
Hinweis: Führen Sie die Probenvorbereitung 2 Tage vor dem Dot-Blot-Analyse.
- Ein Rohr von Aβ-1-42 -Monomer-Lösung 900 µL bidestilliertem Wasser hinzufügen; die Konzentration von Aβ-1-42 werden 0,25 mg/mL. Legen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 min.
- Verdampfen Sie die Lösung mit hochreinen Stickstoffgas, bis sein Volumen ungefähr 850 µL ist. Die Konzentration der Aβ-1-42 -Lösung werden 0,29 mg/mL.
Hinweis: Die Lösung muss von Zeit zu Zeit geschüttelt werden, um sicherzustellen, dass die HFIP vollständig verdunstet ist. Normalerweise ist das Volumen der verbleibende Lösung nach 30 min der Verdunstung, ca. 850 µL. - Verdünnen Sie Curcumin-Stammlösung zu einer Curcumin Lösung (0,2 und 2 µM) mit bidestilliertem Wasser. Mischen Sie die Aβ-1-42-Lösung und Curcumin arbeiten Lösung mit einem Volumenverhältnis von 1:1. Die Endkonzentrationen von Curcumin werden 0,1 bis 1 µM.
Hinweis: Mögliche Oligomer-Hemmer können mit der Aβ-1-42 -Lösung in jedem Verhältnis bei Bedarf gemischt werden. - Schütteln Sie die Lösung kontinuierlich in einen magnetischen Quirl (siehe Tabelle der Materialien).
- Eine Kunststoff-Teiler-Feld, um die magnetischen Rührer zu beheben. Platz 2 magnetische verrühren Bars an 2 Ecken der Box und die Probenröhrchen in der Mitte des Feldes.
- Schütteln Sie die Box bei Raumtemperatur (25 ° C) für 48 h.
Hinweis: Die Geschwindigkeit des magnetischen Rührwerks ist rund 60 Umdrehungen pro Minute.
- Die Rohre für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert und 18.000 x g. sammeln überstand.
(3) Dot Blot Analyse
Hinweis: Auf einem horizontalen Shaker sind alle Inkubationen durchgeführt.
- Schneiden Sie Nitrozellulose-Membran in 1 cm breite Streifen.
Hinweis: Die Breite der Nitrozellulose-Membran kann experimentelle Bedürfnissen angepasst werden. - Legen Sie 2 µL Proben gleichmäßig auf 2 Streifen (Band 1 und 2) mit jedem punktintervall 0,5 cm.
- Legen Sie die Streifen bei Raumtemperatur für 5 min, bis die Tropfen auf dem Band trocken ist.
- Inkubieren Sie die Streifen mit 5 % BSA-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Streifen mit einer TBST Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie TBST Lösung. Inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur Streifen 1 mit einem Anti-Oligomer Antikörper A11 Lösung und Streifen Sie 2 mit einer Anti-Aβ-Antikörper-6E10-Lösung.
- Spülen Sie die Streifen mit einer TBST Lösung drei Mal, jedes Mal für 5 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie TBST Lösung. Inkubieren Sie die Streifen mit einer sekundären Antikörperlösung für 40 min bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Streifen mit einer TBST Lösung drei Mal, jedes Mal für 5 min bei Raumtemperatur.
- Gleichmäßig auftragen der gemischten ECL Flüssigkeit an der Oberfläche der Streifen. Setzen Sie die Streifen in eine automatische Chemilumineszenz imaging-System (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Im Normalfall reicht 300 µL der ECL Flüssigkeit einer Membran. Die Membran muss während der Belichtung feucht gehalten werden. Die Belichtungszeit wird automatisch durch das Abbildungssystem berechnet. - Machen Sie eine Graustufen-Analyse mit ImageJ (National Institutes of Health) oder einer anderen Bildverarbeitungs-Software, um semi-quantitativen Ergebnisse zu erzielen.
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Representative Results
Um zu untersuchen, ob eine Aβ-1-42 -Monomer eine Aβ-1-42 -Oligomer nach der Zubereitung bilden kann, wurde TEM Analyse verwendet. Keine sichtbaren Aggregate wurden in der HFIP aufgelöst Aβ1-42 Monomer Probe (Abb. 1A) beobachtet. Darüber hinaus vor allem kugelige Aggregate mit einem Durchmesser von rund 10-80 nm beobachtet in der Aβ-1-42 -Probe nach 48 h schütteln, was darauf hindeutet, dass Aβ1-42 Oligomere nach der Zubereitung (Abbildung 1B) bildet.
Abbildung 1 . Analyse von Aβ-1-42 -Monomer und Aβ1-42 Oligomer-reiche Proben TEM. Die HFIP aufgelöst Aβ1-42 Monomer Probe (10 µM) und Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe (10 µM) zubereitet nach diesem Protokoll wurden durch TEM untersucht. Die Maßstabsleiste = 200 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Darüber hinaus war Dot-Blot-Analyse verwendet, um die relativen Mengen von Aβ-1-42 -Oligomer in den Proben zu bewerten. Antikörpers A11 könnte mit einer Teilmenge der giftige Aβ Oligomer mit antiparallele β-Sheet-Strukturen reagieren. Ein OC-Antikörper reagiert mit Fibrillären Aggregate mit in-Register β-Sheet Parallelstrukturen. Durch die Verwendung dieser Antikörper, wir unter Beweis gestellt, dass A11-positiven Aβ-1-42 Oligomere, aber nicht OC-positiven Aβ1-42 Fibrillären Aggregate, vor allem in den Aβ1-42 Oligomer-reiche Proben, die bereit waren, nach dem Protokoll (auftrat ( Abbildung 2). Durch die Verwendung der Anti-Aβ-Antikörper-6E10, beobachteten wir, dass die Zahl der Aβ-1-42 -Peptide in HFIP aufgelöst Aβ1-42 Monomer Probe und Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe (Abbildung 2) ähnlich war.
Abbildung 2 . Dot Blot Analyse von Aβ-1-42 -Monomer und Aβ1-42 Oligomer-reiche Proben. (A) die HFIP aufgelöst Aβ1-42 -Monomer-Probe (10 µM) und der Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe (10 µM) zubereitet nach diesem Protokoll wurden von Dot-Blot-Analyse mit Hilfe des Antikörpers Anti-Oligomer A11, Anti-Fibrillären geprüft Oligomer-OC-Antikörper und Anti-Aβ-Antikörper-6E10. (B - D) wurde die semi-quantitative Analyse von Graustufen von ImageJ durchgeführt. Die Daten, ausgedrückt als Prozentsatz der Kontrolle, wurden der Mittelwert ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten; *** p < 0,001 vs. die Aβ-1-42 -Monomer-Gruppe (ANOVA und t-test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Um weiter zu untersuchen, ob dieses Protokoll könnte verwendet werden, um Bildschirm-Inhibitoren von Aβ1-42 Oligomere, Curcumin, wurde ein bekannter Aβ-Oligomer-Hemmer, verwendet. Wir fanden, dass eine Co Inkubation mit Curcumin (0,1 - 1 µM) deutlich reduziert die relativen Mengen der A11-positiven Aβ1-42 Oligomer, was durch die verminderte Färbung der A11 in der Curcumin Co inkubierten Aβ1-42 Oligomer Probe als in der normale inkubierten Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe (Abbildung 3). Unter der gleichen Bedingung, Curcumin (0,1 - 1 µM) nicht ändern, die Anzahl der Aβ-1-42 -Peptide, wie die Färbung des 6E10 auch in allen Proben (Abbildung 3 war).
Abbildung 3 . Dot Blot Analyse von Curcumin Co inkubierten Aβ-1-42 Oligomer-reiche Proben. (A) HFIP aufgelöst Aβ1-42 Monomere (10 µM) wurden nach diesem Protokoll vorbereitet und inkubiert, mit oder ohne Curcumin (0, 0.1, 1 µM) unter Schütteln für 48 h. Die Proben wurden mit einem Punkt Blot-Analyse mit A11 und 6E10 untersucht. (B) Graustufen semi-quantitative Analyse wurde von ImageJ durchgeführt. Die Daten, ausgedrückt als Prozentsatz der Kontrolle, wurden der Mittelwert ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten; *** p < 0,001 vs. Aβ1-42 allein Gruppe (ANOVA und Tukey Test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Um Oligomer Bildung zu überprüfen, haben wir auch eine nicht-Denaturierung Gel verwendet. Wir fanden, dass Oligomer (> 4 KD) wurde in der Probe Aβ1-42 Oligomer-Reich, während die meisten Monomer (4 KD) fand in der Aβ1-42 Monomer Probe (Abbildung S1).
Wir haben Aβ-Aggregate in den überstand und Pellet der Aβ-1-42 -Probe untersucht. Nach 48 h Inkubation fanden Aβ1-42 Oligomer aber nicht Aβ1-42 Fibrillären Aggregate in der Überstand der Probe durch A11, OC und 6E10 Antikörper (Abbildung S2) bestimmt. Unter der gleichen Bedingung fanden Aβ1-42 Fibrillären Aggregate aber nicht Aβ1-42 Oligomere in das Pellet der Probe (Abbildung S2).
Wir haben auch die Morphologie der Curcumin-behandelten Aβ1-42 Probe untersucht, mit TEM. Die Curcumin-behandelten Probe enthält ein paar kugelförmige Flecken, hindeutet, dass Curcumin Aβ1-42 Oligomer (Abbildung S3) reduzieren konnte.
Abbildung S1 . Non-Denaturierung Gel-Elektrophorese Analyse der Aβ1-42 Monomer- und Aβ1-42 Oligomer-reiche Proben. HFIP aufgelöst Aβ1-42-Monomer-Probe (10 µM) und der Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe (5 µM, Low; 10 µM, hohe) zubereitet nach diesem Protokoll wurden durch nicht Denaturierung Gelelektrophorese mit Anti-Aβ-Antikörper-6E10 untersucht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung S2 . Der Überstand des Aβ1-42-Lösung enthält vor allem Oligomer, aber nicht Fibrillären Aggregate. Eine Aβ1-42-Lösung (50 µL), wurde nach dem Schütteln für 48 h bei 18.000 x g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und das Pellet wurde in 850 µL bidestilliertem Wasser wieder gelöst. Der überstand und Pellets wurden weiter durch ein Dot-Blot Assay mit OC, A11 und 6E10 Antikörper untersucht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung S3 . TEM Analyse von Curcumin Co Aβ1-42 Oligomer-reiche Proben inkubiert. HFIP aufgelöst Aβ1-42 Monomere (10 µM) wurden nach diesem Protokoll zubereitet und mit 1 µM Curcumin unter Schütteln für 48 h inkubiert. Die Proben wurden durch TEM untersucht. Maßstabsleiste = 100 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In diesem Protokoll haben wir eine Methode zur Vorbereitung von Proben mit Aβ1-42 Oligomer und die Beträge der A11-positiven Aβ1-42 Oligomer durch einen Punkt Blot Analyse analysieren berichtet. Obwohl unsere Methoden für die Erstellung von Aβ1-42 Oligomer-reiche Proben ganz einfach, zuverlässig und reproduzierbar sind, gibt es noch einige Punkte zu beachten. Erstens wird HFIP verwendet, um synthetische Aβ-1-42 -Peptid auflösen. Eine aggregierte Aβ-1-42 -Peptid kann in Monomer in HFIP Lösung zerlegen. Allerdings HFIP ist einfach zu verdampfen, und die Viskosität des HFIP ist sehr gering. Daher sollte das Aβ-Peptid1-42 in HFIP aufgelöst werden und die HFIP Lösung sollte so schnell wie möglich um den möglichen Verlust von HFIP während der Operation zu reduzieren regelmäñig. Darüber hinaus sollte die Pipettenspitzen abgeschnitten werden, um genaue pipettieren in diesem Verfahren zu gewährleisten. Zweitens dient die hochreinen Stickstoffgas HFIP aus der Lösung zu verdampfen. Während dieses Vorgangs sollte die Aβ-1-42 -Lösung von Zeit zu Zeit geschüttelt werden, um sicherzustellen, dass die HFIP vollständig verdampft werden kann. Am Ende dieses Verfahrens sollte der Geruch von HPIF nicht in der Lösung erkannt werden. In der Regel reduziert 30 min von Verdunstung die Konzentration von HFIP auf weniger als 0,1 %. Bei dieser Konzentration wird HFIP berichtet, nicht zu ändern, die Konformation Übergang von Aβ-1-42-7. Drittens, wenn Proben mit Aβ1-42 Oligomer vorbereiten, das minimale Volumen der Flüssigkeit sollte größer sein als 50 µL. andernfalls dürften die Proben in kleinen Tröpfchen, Befestigung an der Wand der Rohre zu streuen. Auch kann nicht Aβ-1-42 -Monomer Oligomer ohne eine gründliche Durchmischung bilden.
Das Protokoll eine Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe vorbereiten, wie hier beschrieben ist etwas anders als einige Protokolle in anderen Gruppen genutzt. Beispielsweise wurde in einigen Studien HFIP verdampft, bevor Sie hinzufügen bidestilliertem Wasser in die Lösung8,9. Jedoch kann die Aβ-Peptid1-42 in einem solchen Zustand, kleine Blätter bilden, die schwer in die Lösung löslich sind. Daher entschieden wir uns zuerst bidestilliertem Wasser hinzufügen und dann verdunsten die HFIP von Stickstoffgas. Am wichtigsten ist, bestätigt die TEM Oligomere Formen der Aggregate durch dieses Protokoll vorbereitet. Darüber hinaus Aβ-1-42 -Oligomere gebildet durch dieses Protokoll könnte Neurotoxizität in SH-SY5Y Zellen und primären hippocampal Neuronen zu induzieren und kognitive Leistungsfähigkeit nach Injektion in den hippocampal Region von Mäusen, die darauf hindeutet, dass die Aβ-1-42 Oligomer vorbereitet ist ziemlich giftig5,10. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Studien11.
Dieses Protokoll auszuwertende A11-positiven Aβ1-42 Oligomer durch eine Dot-Blot-Analyse hat noch einige Mängel. Erstens ist es mithilfe von manuellen Probennahme nicht einfach die Tröpfchen einheitlich groß zu halten. Zweitens ein Dot-Blot-Analyse ist eine semi-quantitative aber nicht quantitative Methode zur Messung der Mengen von A11-positiven Aβ1-42 Oligomer, was darauf hindeutet, dass andere Methoden wie ELISA, sind erforderlich, wenn die genaue Bewertung der Mengen von Aβ1-42 Oligomer ist notwendig. Drittens können einige Medikamente, die Antikörper, was zu falsch positiven Ergebnissen reagieren.
Im Allgemeinen haben wir ein zuverlässiges Protokoll, Proben, die A11-positiven Aβ1-42 Oligomer vorzubereiten und die Beträge der A11-positiven Aβ1-42 Oligomer analysieren mit einem Dot Blot Assay zur Verfügung gestellt. Mithilfe dieses Protokolls, potenzielle Aβ-1-42 -Oligomer möglicherweise Inhibitoren mit dem Potenzial zur Behandlung von AD effektiv abgeschirmt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (U1503223, 81673407, 21475131), das angewandte Forschungsprojekt auf Non-Profit-Technologie der Provinz Zhejiang (2016 C 37110), die Ningbo International Science and Technology Kooperationsprojekt (2014D 10019), Ningbo Municipal Innovationsteams der Life Science und Gesundheit (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech-Projekt für Common Wealth (2017C 50042), die Li Dak Summe Yip Yio Kinn Kenneth Li Marine biopharmazeutische Entwicklungsfonds, und K. C. Wong Magna Fonds an Ningbo University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All - automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
References
- Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
- De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
- Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
- Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
- Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256 (2015).
- Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
- Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
- Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
- Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
- Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).
- Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).
