Summary
ويصف هذا البروتوكول كيفية إعداد ليغومرات Aβ من ببتيد اصطناعية في المختبر وتقييم الكميات النسبية من Aβ oligomer بنقطة النشاف التحليل.
Abstract
اميلويد بيتا (Aβ) ببتيد مسعور مع اتجاه جوهرية لتجميع ذاتي في المجاميع. بين مجاميع مختلفة، Aβ oligomer مقبول على نطاق واسع عصبي الرائدة في التقدم لمرض الزهايمر (AD) ويعتبر أن الحدث الحاسم في الآلية المرضية للإعلان. ولذلك، قد منع نيوروديجينيريشن مثبطات oligomer Aβ ويمكن أن توضع كالمرض--تعديل علاجات للإعلان. ومع ذلك، تشكيل مختلف بروتوكولات Aβ oligomer قد تؤدي إلى ليغومرات ذات خصائص مختلفة. وعلاوة على ذلك، لا توجد العديد من الطرق لفعالية الشاشة Aβ1-42 مثبطات أوليجومير. يمكن أن يتفاعل جسم A11 مع مجموعة فرعية أوليجومير1-42 Aβ السمية مع هياكل موازية لمكافحة β-ورقة. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية إعداد نموذج Aβ A11-إيجابية غنية أوليجومير1-42 من اصطناعية Aβ1-42 ببتيد في المختبر وتقييم كميات نسبية من أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية في عينات من النشاف دوت تحليل استخدام A11 و Aβ1-42-الأجسام المضادة 6E10 محددة. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن أيضا فحص مثبطات أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية من النتائج التجريبية شبه كمي.
Introduction
مرض الزهايمر (ميلادي) واحد من أهم الأمراض الأعصاب التي تؤثر على كبار السن في جميع أنحاء العالم1. من المقبول على نطاق واسع أن التجميع غير طبيعي من بيتا-اميلويد (Aβ) قد يكون العامل المرضية الرائدة للإعلان. Aβ المجاميع هي المكونات الرئيسية من لويحات خرف، واحدة من علامات بيولوجية في أدمغة المرضى الإعلانية. وعلاوة على ذلك، تنتج المجاميع Aβ، بما في ذلك ليغومرات على وجه الخصوص، السمية العصبية القوية، التي قد يكون سبب الوفاة العصبية كما تقدم الإعلانية. ولذلك، قد منع تثبيط تشكيل oligomer Aβ نيوروديجينيريشن، ويمكن وضع مثبطات oligomer Aβ كالمرض--تعديل علاجات للإعلان. واستخدمت العديد من الدراسات ببتيد Aβ اصطناعية لتشكل ليغومرات في المختبر، واستكشاف مورفولوجيس وهياكل اصطناعية Aβ ليغومرات، والتحقيق مثبطات oligomer Aβ تستخدم في المختبر نماذج2،3 , 4-ولكن مختلفة في المختبر تكوين بروتوكولات Aβ oligomer يمكن أن يؤدي إلى أوليجومير مع الخصائص المورفولوجية المختلفة، مما قد يؤدي إلى نتائج لا تضاهي بين المجموعات البحثية المختلفة. ولذلك، ثمة حاجة ملحة بروتوكول تكوين قياسي ل Aβ oligomer.
حتى الآن، أبلغ عن أساليب كثيرة غير مباشرة الكشف عن ليغومرات Aβ. مجهر إلكتروني (TEM) غير يشوه التفريد جل والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA)، ودوت النشاف التحليل يمكن استخدامها لدراسة كمية و/أو مورفولوجية Aβ oligomer في المختبر5، 6. على سبيل المثال، يمكن ملاحظتها في مورفولوجيا وهيكل Aβ oligomer في TEM. ويمكن قياس الكميات النسبية والحجم الجزيئي لتجميعات Aβ بالتفريد جل غير يشوه. أليسا يمكن استخدامها لتحديد oligomer Aβ في المصل والبلازما، ومقتطفات من أنسجة المخ. وأخيراً، دوت النشاف التحليل، تقنية تستخدم للكشف عن، تحليل وتحديد البروتينات، يمكن استخدامها لتقييم تركيز نسبي oligomer Aβ في عينات مختلفة مع المساعدة من الأجسام المضادة أوليجومير و Aβ محددة. وعلاوة على ذلك، يوفر نقطة النشاف المقايسة قدرا كبيرا من الوقت وفورات، التفريد جل وإجراءات بلوتينج للمواد الهلامية غير مطلوبة. ولذلك، يستخدم هذا الفحص عادة مثبطات oligomer Aβ المحتملة في الشاشة. والهدف العام من هذا البروتوكول وصف طريقة بسيطة نسبيا وموثوق بها، واستنساخه لإعداد نموذج غنية أوليجومير1-42 Aβ، لتحليل كميات أوليجومير1-42 Aβ دوت النشاف التحليل، وعلى الشاشة Aβ oligomer مثبطات استخدام النتائج التجريبية شبه كمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-حل إعداد
ملاحظة: انظر الجدول للمواد لمصادر كاشف.
- تعد حلاً ألبومين مصل بقرى 5% (BSA) عن طريق إضافة 5 غ من جيش صرب البوسنة إلى 100 مل الماء المقطر مزدوجة. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج لهم. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- تعد حلاً A11 oligomer المضادة الأجسام المضادة (1:1، 000) بإضافة 10 ميليلتر من جسم حل الأسهم إلى 10 مل حل جيش صرب البوسنة 5%. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج لهم. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- تعد حلاً 6E10 الأجسام المضادة-Aβ (1:1، 000) بإضافة 10 ميليلتر من جسم حل الأسهم إلى 10 مل من محلول جيش صرب البوسنة 5%. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- تعد حلاً OC الأجسام المضادة أوليجومير المضادة فيبريلار (1:1، 000) بإضافة 10 ميليلتر من جسم حل الأسهم إلى 10 مل من محلول جيش صرب البوسنة 5%. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- إعداد تريس مخزنة مالحة (تبس) أسهم حلاً عن طريق إضافة ز 24 قاعدة تريس و 88 جرام من كلوريد الصوديوم إلى 1,000 مل من الماء المقطر مزدوجة. قم بضبط ال pH إلى 7.4. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- تعد تريس مخزنة المالحة والحل توين-20 (تبسة) عن طريق إضافة 1 مل من توين-20 إلى 100 مل TBS مخزون المياه المقطرة مزدوجة الحل و 900 مل.
- تحضير حلاً جسم ثانوية بإضافة ميليلتر 10 من الفجل البيروكسيديز (HRP) الماعز المضادة أرنب مفتش (H + L) إلى 10 مل من محلول تبست. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج لهم. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- حل ز 3.68 من الكركمين في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) أن يشكل حلاً أسهم الكركمين 10 ملم.
- حل 5 ملغ Aβ الاصطناعية1-42 في 2 مل من 1,1,1,3,3,3-هيكسافلورو-2-بروبانول (هفيب) تشكل حلاً مونومر Aβ 2.5 ملغ/مل. ووضعه في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) عن 20 دقيقة تجعل 100 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
ملاحظة: يجب تشغيل هذا الإجراء في أسرع وقت ممكن. وينبغي قطع نصائح ماصة لضمان بيبيتينج دقيقة. - تحضير السائل اليكتروتشيميلومينيسسينسي (القامة) بخلط مسافنة السوائل A و B بنسبة 1:1 حجم. وينبغي إعداد هذا الحل فقط قبل الاستخدام.
2. إعداد نموذج
ملاحظة: إجراء إعداد عينة أيام 2 قبل النقطة النشاف التحليل.
- إضافة 900 ميليلتر من الماء المقطر مزدوجة إلى أنبوب Aβ1-42 مونومر الحل؛ وسيكون تركيز Aβ1-42 0.25 مغ/مل. ضع الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- تتبخر الحل مع غاز النيتروجين عالي النقاء حتى يصل حجمه حوالي 850 ميليلتر. وسيكون تركيز الحل1-42 Aβ حول 0.29 mg/mL.
ملاحظة: الحل يجب أن تهتز من وقت لآخر لضمان كامل يتبخر في هفيب. عادة، هو حجم الحل المتبقي بعد 30 دقيقة من التبخر، حوالي 850 ميليلتر. - تمييع الحل الكركمين الأسهم لإيجاد حل عملي الكركمين (0.2 و 2 ميكرومتر) مع الماء المقطر مزدوجة. مزيج Aβ الحل1-42والكركمين يعمل الحل مع حجم نسبة 1:1. وسيكون النهائي تركيزات الكركمين 0.1 و 1 ميكرومتر.
ملاحظة: يمكن أن تكون مختلطة مثبطات أوليجومير المحتملة مع الحل1-42 Aβ في أي نسبة إذا لزم الأمر. - اهتز الحل باستمرار في المحرض مغناطيسي (انظر الجدول للمواد).
- إصلاح مربع مقسم بلاستيك للمحرض المغناطيسية. 2 مكان المغناطيسي يحرك الحانات في زوايا المربع 2 ووضع الأنابيب العينة في مركز المربع.
- اهتز المربع في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ح 48.
ملاحظة: سرعة المحرض المغناطيسي هو حوالي 60 لفة في الدقيقة.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية و 18,000 خ زاي جمع المادة طافية.
3-تحليل النشاف دوت
ملاحظة: تجري جميع إينكوبيشنز شاكر أفقي.
- قطع غشاء النيتروسليلوز إلى شرائح 1 سم على نطاق واسع.
ملاحظة: يمكن ضبط عرض الغشاء النيتروسليلوز وفقا للاحتياجات التجريبية. - وضع العينات 2-ميليلتر بالتساوي على شرائط 2 (قطاع 1 و 2) مع الفاصل الزمني لكل نقطة في 0.5 سم.
- ضع الشرائط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق حتى الحبرية في الفرقة الجافة.
- احتضان الشرائط مع حل جيش صرب البوسنة 5% لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف الشرائط مع حل تبست لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح الحل تبسة. 1 ح في درجة حرارة الغرفة، لاحتضان قطاع 1 مع جسم أوليجومير المضادة حل A11 وقطاع 2 مع حل 6E10 الأجسام المضادة-Aβ.
- شطف الشرائط مع حل تبسة ثلاث مرات، كل مرة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح الحل تبسة. احتضان الشرائط مع حل جسم ثانوية لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف الشرائط مع حل تبسة ثلاث مرات، كل مرة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تطبيق بالتساوي السائل مسافنة مختلطة إلى سطح الشرائط. يعرض الشرائط في تشيميلومينيسسينسي تلقائية نظام التصوير (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: عادة، 300 ميليلتر من السوائل يصدرون ما يكفي لغشاء واحد. يجب أن يبقى الغشاء رطبة خلال التعرض. ويحسب وقت التعرض تلقائياً بنظام التصوير. - القيام بتحليل درجات رمادي باستخدام إيماجيج (المعاهد الوطنية للصحة) أو برنامج معالجة الصور آخر للحصول على نتائج شبه كمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتحقيق في ما إذا كان مونومر1-42 Aβ يمكن أن تشكل أوليجومير1-42 Aβ بعد إعداد، تم استخدام تحليل ال. لا تظهر المجاميع لوحظت في العينة مونومر Aβ حل هفيب1-42 (الشكل 1أ). وعلاوة على ذلك، أساسا كروي المجاميع التي يبلغ قطرها حوالي 10-80 نانومتر وقد لوحظت في العينة1-42 Aβ بعد 48 ساعة من الهز، مما يوحي بأن أشكال Aβ1-42 ليغومرات بعد التحضير (الشكل 1ب).
الشكل 1 . تحليل ال Aβ مونومر1-42 وعينات الغنية أوليجومير1-42 Aβ. ونظرت تيم العينة مونومر Aβ حل هفيب1-42 (10 ميكرون) والعينة الغنية أوليجومير1-42 Aβ (10 ميكرون) أعدت وفقا لهذا البروتوكول. شريط المقياس = 200 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
بالإضافة إلى ذلك، استخدمت دوت النشاف التحليل لتقييم مبالغ النسبي Aβ1-42 أوليجومير في العينات. يمكن أن يتفاعل جسم A11 مع مجموعة فرعية من السمية oligomer Aβ مع هياكل موازية لمكافحة β-ورقة. جسم قائد يتفاعل مع المجاميع فيبريلار مع هياكل موازية في ورقة بيتا في السجل. باستخدام هذه الأجسام المضادة، أثبتنا أن Aβ A11-إيجابية1-42 ليغومرات، ولكن لا Aβ OC-إيجابية1-42 فيبريلار المجاميع، ظهرت أساسا في عينات الغنية أوليجومير1-42 التي أعدت وفقا البروتوكول (Aβ الشكل 2). باستخدام 6E10 الأجسام المضادة-Aβ، لاحظنا أن عدد الببتيدات1-42 Aβ مماثل في العينة مونومر Aβ حل هفيب1-42 والعينة الغنية oligomer Aβ1-42 (الشكل 2).
الشكل 2 . دوت تحليل النشاف Aβ مونومر1-42 و Aβ1-42 عينات الغنية أوليجومير. تم فحص عينة مونومر (A) Aβ حله "هفيب"1-42 (10 ميكرون) والعينة الغنية أوليجومير1-42 Aβ (10 ميكرون) أعدت وفقا لهذا البروتوكول قبل دوت النشاف التحليل باستخدام الأجسام المضادة أوليجومير المضادة A11، مكافحة فيبريلار أوليجومير جسم OC، ومكافحة Aβ جسم 6E10. (ب - د) أجرى تحليل شبه كمي لتدرج الرمادي من قبل إيماجيج. كانت البيانات، معبراً عنه بنسبة مئوية من التحكم، ± يعني SEM 3 التجارب المستقلة؛ *** ف < 0.001 مقابل مجموعة مونومر Aβ1-42 (ANOVA و t-اختبار). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
واستخدمت لمواصلة التحقيق إذا كان يمكن استخدام هذا البروتوكول لمثبطات الشاشة من1-42 Aβ ليغومرات، الكركمين، مثبط oligomer Aβ معروفة،. وجدنا أنه حضانة المشتركة مع الكركمين (0.1-1 ميكرومتر) إلى حد كبير المبالغ النسبية من أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية، كما يدل على ذلك انخفاض تلطيخ A11 في الكركمين شارك المحتضنة Aβ1-42 أوليجومير عينة مما ورد في عادي المحتضنة Aβ1-42 الغنية oligomer عينة (الشكل 3). في نفس الحالة، الكركمين (0.1-1 ميكرومتر) لم يغير عدد الببتيدات Aβ1-42 ، كما تلطيخ 6E10 كان حتى في جميع العينات (الشكل 3).
الشكل 3 . دوت تحليل النشاف من الكركمين شارك المحتضنة Aβ1-42 عينات الغنية أوليجومير. (أ) حل HFIP Aβ1-42 مونومرات (10 ميكرون) أعدت وفقا لهذا البروتوكول والمحتضنة مع أو بدون الكركمين (0، 0، 1، 1 ميكرومتر) تحت تهتز ح 48. وبحثت العينات بنقطة النشاف تحليل استخدام A11 و 6E10. (ب) تدرج الرمادي شبه كمي تحليل أجرى من قبل إيماجيج. كانت البيانات، معبراً عنه بنسبة مئوية من التحكم، ± يعني SEM 3 التجارب المستقلة؛ *** ف < 0.001 مقابل وحدة المجموعة1-42 (اختبار ANOVA وفي توكي) Aβ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
للتحقق من تكوين أوليجومير، وقد استخدمنا أيضا هلام غير يشوه. وجدنا أن أوليجومير (> 4 دينار كويتي) كان حاضرا في العينة الغنية أوليجومير1-42 Aβ، بينما معظم مونومر (4 دينار كويتي) وجد في العينة مونومر Aβ1-42 (S1 الشكل).
لقد حققت المجاميع Aβ في المادة طافية وبيليه العينة1-42 Aβ. بعد 48 ساعة حضانة، عثر Aβ oligomer1-42 ولكن لا Aβ1-42 المجاميع فيبريلار في المادة طافية العينة كما تحددها A11، قائد، والأجسام المضادة 6E10 (S2 الشكل). في نفس الحالة، عثر Aβ المجاميع فيبريلار1-42 ولكن لا Aβ1-42 ليغومرات في بيليه العينة (S2 الشكل).
وقد درسنا أيضا مورفولوجية العينة1-42 Aβ المعالجة الكركمين باستخدام ال. نموذج المعالجة الكركمين يحتوي على بقع كروية قليلة، مما يوحي بأن الكركمين يمكن أن تقلل من كمية Aβ oligomer1-42 (S3 الرقم).
الرقم S1 . يشوه عدم تحليل التفريد جل مونومر Aβ1-42 وعينات الغنية أوليجومير Aβ1-42- بحثت العينة مونومر المذاب هفيب Aβ1-42 (10 ميكرون) و Aβ1-42 الغنية oligomer العينة (5 ميكرومتر، منخفضة؛ 10 ميكرومتر، عالية) أعدت وفقا لهذا البروتوكول بالتفريد جل غير يشوه استخدام 6E10 الأجسام المضادة-Aβ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم S2 . المادة طافية لحل Aβ1-42 يتضمن أساسا أوليجومير، ولكن المجاميع لا فيبريلار. حلاً Aβ1-42 (50 ميليلتر)، بعد الهز ح 48، تم فصل في 18,000 س ز لمدة 10 دقائق. وجمعت المادة طافية وبيليه إعادة المذابة في 850 ميليلتر من الماء المقطر مزدوجة. وبحثت كذلك المادة طافية وبيليه بمقايسة وصمة عار نقطة استخدام الأجسام المضادة قائد "و" A11 "و" 6E10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم العنوان S3 . تحليل تيم الكركمين شارك المحتضنة عينات الغنية أوليجومير Aβ1-42- حل HFIP مونومرات Aβ1-42 (10 ميكرون) أعدت وفقا لهذا البروتوكول والمحتضنة مع 1 ميكرومتر الكركمين تحت تهتز ح 48. ودرست العينات بال. شريط المقياس = 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، أبلغنا طريقة لإعداد العينات التي تحتوي على أوليجومير1-42 Aβ، وتحليل كميات أوليجومير1-42 Aβ A11-الإيجابية بنقطة النشاف تحليل. على الرغم من أن لدينا أساليب لإعداد العينات الغنية أوليجومير1-42 Aβ بسيط جداً، ويمكن الاعتماد عليها، واستنساخه، لا تزال هناك بعض النقاط يمكن ملاحظتها. أولاً، يستخدم هفيب لحل الببتيد1-42 Aβ الاصطناعية. يمكن تفكيك ببتيد1-42 Aβ مجمعة في مونومر في حل هفيب. ومع ذلك، هفيب سهل لتطيير، ولزوجة هفيب منخفض جداً. ولذلك، ينبغي أن تحل الببتيد1-42 Aβ في هفيب وينبغي أن يكون الحل هفيب الكوتيد أسرع وقت ممكن للحد من الخسائر المحتملة من هفيب أثناء العملية. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن قطع ماصة نصائح لضمان بيبيتينج دقيقة في هذا الإجراء. ثانيا، يتم استخدام غاز النيتروجين عالي النقاء تتبخر HFIP من الحل. أثناء هذا الإجراء، يجب أن تهتز الحل1-42 Aβ من وقت لآخر التأكد من أن هفيب يمكن أن تكون تبخرت تماما. في نهاية هذا الإجراء، يجب عدم اكتشافها رائحة هبيف في الحل. عادة، و 30 دقيقة من التبخر يقلل من تركيز هفيب إلى أقل من 0.1%. هذا التركيز، عند ذكر هفيب لا يغير انتقال تكيف Aβ1-427. ثالثا، عند إعداد العينات التي تحتوي على أوليجومير1-42 Aβ، ينبغي أن يكون حجم الحد الأدنى للسائل أكبر من 50 ميليلتر. خلاف ذلك، من المرجح أن مبعثر إلى قطيرات صغيرة، تعلق على الجدار من الأنابيب العينات. أيضا، لا يمكن أن تشكل Aβ1-42 مونومر أوليجومير دون خلط دقيق.
البروتوكول لإعداد نموذج غنية أوليجومير1-42 Aβ كما هو موضح هنا يختلف قليلاً عن بعض البروتوكولات المستخدمة في المجموعات الأخرى. على سبيل المثال، في بعض الدراسات، قد تبخرت هفيب قبل إضافة الماء المقطر مزدوجة إلى8،الحل9. ومع ذلك، في مثل هذه حالة، قد تشكل الببتيد1-42 Aβ الأوراق الصغيرة، التي من الصعب أن يذوب في الحل. لذلك، اخترنا لإضافة الماء المقطر مزدوجة أولاً ومن ثم تتبخر في هفيب بغاز النيتروجين. الأهم من ذلك، تؤكدها الأشكال oligomeric المجاميع التي أعدت بموجب هذا البروتوكول تيم. وعلاوة على ذلك، أوليجومير1-42 Aβ التي شكلت بموجب هذا البروتوكول يمكن حمل السمية العصبية في ش-SY5Y الخلايا والخلايا العصبية هيبوكامبال الأولية وتقليل الأداء المعرفي بعد الحقن في منطقة هيبوكامبال من الفئران، مما يوحي بأن Aβ1-42 أوليجومير أعد هو سامة جداً5،10. وتتسق هذه النتائج مع الدراسات السابقة11.
هذا البروتوكول لتقييم Aβ A11-إيجابية1-42 أوليجومير بتحليل blotting دوت لا تزال لديه بعض أوجه القصور. أولاً، باستخدام العينات اليدوي، ليس من السهل أن تبقى القطرات موحدة في الحجم. ثانيا، هو نقطة النشاف التحليل الكمي شبه لكن الأسلوب لا الكمية لقياس كميات أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية، مما يوحي بأساليب أخرى، مثل أليسا، مطلوبة إذا كان تقييم كميات من Aβ1-42 دقيقة أوليجومير ضروري. وثالثاً، قد تتفاعل بعض الأدوية للأجسام المضادة، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة.
بشكل عام، وقد قدمنا بروتوكول يمكن الاعتماد عليها لإعداد العينات التي تحتوي على أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية وتحليل كميات أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية باستخدام نقطة النشاف المقايسة. باستخدام هذا البروتوكول، أوليجومير1-42 Aβ المحتملة قد فحص مثبطات مع القدرة على التعامل مع الإعلانات فعلياً.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من "الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين" (U1503223، 81673407، 21475131)، تطبيق مشروع البحث المتعلق بالتكنولوجيا غير ربحية لمقاطعة تشجيانغ (2016 ج 37110)، نينغبوه الدولي للعلم والتكنولوجيا مشروع التعاون (10019 د 2014)، فريق الابتكار بلدية نينغبو لعلوم الحياة والصحة (2015 ج 110026)، علوم نينغبو & مشروع التكنولوجيا للثروة المشتركة (ج 2017 50042)، مجموع داك لي ييب صندوق التنمية الصيدلانية البيولوجية البحرية كينيث لي تشين ييو والصندوق ك جيم وونغ ماجنا في نينغبو جامعة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All - automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
References
- Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
- De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
- Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
- Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
- Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256 (2015).
- Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
- Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
- Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
- Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
- Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).
- Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).
