Summary
Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.
Abstract
Β-amiloide (Aβ) é um peptídeo hidrofóbico com uma tendência intrínseca de auto-montagem em agregados. Entre vários agregados, oligómero Aβ é amplamente aceita como a neurotoxina principal no progresso da doença de Alzheimer (AD) e é considerado o evento crucial na patogênese da AD. Portanto, inibidores de oligómero Aβ podem impedir a neurodegeneração e têm o potencial para ser desenvolvido como doença-modificando tratamentos de AD. No entanto, protocolos de formação diferente do oligómero Aβ podem levar a oligômeros com características diferentes. Além disso, não existem muitos métodos para efetivamente tela Aβ1-42 oligómero inibidores. Um anticorpo A11 pode reagir com um subconjunto de tóxico oligómero de1-42 de Aβ com estruturas de β-folha antiparalelos. Neste protocolo, descrevemos como preparar uma amostra de oligómero ricos A11-positivo Aβ1-42 de um sintético Aβ1-42 peptídeo em vitro e avaliar quantidades relativas de oligómero de1-42 Aβ A11-positivo em amostras por uma mancha do ponto análise usando A11 e Aβ1-42-anticorpos específicos 6E10. Usando este protocolo, inibidores de oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo podem também projectados de semi-quantitativa de resultados experimentais.
Introduction
A doença de Alzheimer (AD) é uma das doenças neurodegenerativas mais importantes que afetam as pessoas idosas no mundo1. É amplamente aceito que a agregação anormal de β-amiloide (Aβ) pode ser o principal factor patológico do anúncio. Aβ agregados são os principais componentes das placas senis, dentre os marcadores biológicos nos cérebros de pacientes. Além disso, agregados Aβ, nomeadamente oligómeros, produzem neurotoxicidade potente, que pode ser a causa da morte neuronal no decorrer AD. Portanto, a inibição da formação de oligómero Aβ pode impedir a neurodegeneração e inibidores Aβ oligómero poderiam ser desenvolvidos como doença-modificando tratamentos de AD. Muitos estudos têm usado um peptídeo sintético de Aβ para formar oligômeros em vitro, explorar morfologias e estruturas de oligômeros Aβ artificiais e investigar os inibidores do oligómero Aβ usando em vitro modelos2,3 , 4. no entanto, diferentes em vitro protocolos de formação do oligómero Aβ podem levar a oligómero com diferentes características morfológicas, o que pode causar os resultados incomparáveis entre grupos de pesquisa diferentes. Portanto, um protocolo de formação standard para oligómero Aβ é urgentemente necessária.
Até agora, não há muitos métodos têm sido relatados para detectar diretamente oligómeros Aβ. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM), não-desnaturação electroforese do gel, ensaio imunoenzimático (ELISA) e ponto de análise a mancha podem ser usados para examinar a quantidade e/ou morfologia de Aβ oligómero 5, 6. por exemplo, a morfologia e estrutura do oligómero Aβ podem ser observados na temperatura. Os montantes relativos e tamanho molecular de agregações de Aβ poderiam ser medidos pela electroforese do gel não-desnaturação. ELISA poderia ser usada para determinar oligómero Aβ em soro, plasma e excertos do tecido cerebral. Por último, ponto de análise, uma técnica utilizada para a detecção, a mancha analisando e identificando as proteínas, poderia ser usado para avaliar a concentração relativa de oligómero Aβ nas diferentes amostras com a ajuda do oligómero-Aβ específicas e de anticorpos. Além disso, um ponto do ensaio de mancha oferece economia de tempo significativo, como a electroforese do gel e os mancha procedimentos para géis não são necessários. Portanto, este ensaio é normalmente usada para tela potenciais Aβ oligómero inibidores da. O objetivo geral do presente protocolo é para descrever um método relativamente simples, confiável e reprodutível para preparar uma amostra da rica oligómero Aβ1-42 , para analisar as quantidades de oligómero Aβ1-42 por ponto de análise a mancha e para oligómero Aβ tela usando os resultados experimentais semi-quantitativa de inibidores.
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Protocol
1. preparação da solução
Nota: Consulte a Tabela de materiais para fontes de reagente.
- Prepare uma solução de 5% albumina de soro bovino (BSA) pela adição de 5 g de BSA para 100 mL de água bidestilada. Misturá-los completamente vortexing-los. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
- Prepare uma solução de A11 de anticorpo antioligómero (1:1, 000), adicionando 10 µ l de solução-mãe de anticorpo para 10 mL da solução de 5% de BSA. Misturá-los completamente vortexing-los. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
- Prepare uma solução de 6E10 de anticorpo anti-Aβ (1:1, 000), adicionando 10 µ l de solução-mãe de anticorpo a 10 mL de solução a 5% BSA. Misturá-los completamente vortexing. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
- Prepare uma solução OC de anticorpo anti-fibrillar oligómero (1:1, 000), adicionando 10 µ l de solução-mãe de anticorpo a 10 mL de solução a 5% BSA. Misturá-los completamente vortexing. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
- Prepare uma tampão Tris (TBS) estoque solução salina adicionando 24 g de base Tris e 88 g de NaCl a 1.000 mL de água bidestilada. Ajuste o pH para 7,4. Armazene a solução a 4 ° C por até 3 meses.
- Prepare uma solução de Tween-20 (TBST) e salino Tris, adicionando 1 mL de Tween-20 a 100 mL de TBS estoque água bidestilada solução e 900 mL.
- Prepare uma solução de anticorpo secundário adicionando 10 µ l do horseradish peroxidase (HRP) cabra anti-IgG de coelho (H + L) para 10 mL de solução TBST. Misturá-los completamente vortexing-los. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
- Dissolva 3,68 g da curcumina em 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) para formar uma solução stock de curcumina de 10 mM.
- Dissolva 5 mg de sintético Aβ1-42 em 2 mL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para formar uma solução de monômero Aβ 2,5 mg/mL. Coloque-o em temperatura ambiente (25 ° C) para alíquotas de 20 min. faça 100 µ l e armazenar a-20 ° C por até 6 meses.
Nota: Este procedimento deve ser executado mais rápido possível. As pontas de pipeta devem ser cortadas para garantir a pipetagem precisos. - Prepare eletroquimioluminescência (ECL) fluido misturando ECL fluida-A e B com uma relação de volume de 1:1. Esta solução deve ser preparada imediatamente antes da utilização.
2. preparação da amostra
Nota: Execute a preparação da amostra 2 dias antes do ponto de análise a mancha.
- Adicionar 900 μL de água bidestilada para um tubo de solução de monômero Aβ1-42 ; a concentração de Aβ1-42 será 0,25 mg/mL. Coloque a mistura em temperatura ambiente por 20 min.
- Evapore a solução com gás nitrogênio de alta pureza, até que seu volume é de cerca de 850 µ l. A concentração da solução de1-42 de Aβ será sobre 0,29 mg/mL.
Nota: A solução deve ser agitada de vez em quando para garantir que o HFIP é totalmente evaporado. Normalmente, após 30 min de evaporação, o volume da solução residual é de cerca de 850 µ l. - Dilua a solução-mãe de curcumina para uma solução de trabalho de curcumina (0,2 e 2 µM) com água bidestilada. Misture a solução1-42de Aβ e curcumina solução com uma relação de 1:1 do volume de trabalho. As concentrações finais de curcumina será 0,1 e 1 µM.
Nota: Potenciais inibidores oligómero podem ser misturados com a solução de1-42 de Aβ em qualquer proporção, se necessário. - Agitar a solução continuamente em um agitador magnético (ver Tabela de materiais).
- Conserte uma caixa de plástico divisor para o agitador magnético. 2 lugar magnético agitar bares nos 2 cantos da caixa e coloque os tubos de amostra no centro da caixa.
- Agite a caixa à temperatura ambiente (25 ° C) por 48 h.
Nota: A velocidade do agitador magnético é em torno de 60 rpm.
- Centrifuga os tubos por 15 min a 4 ° C e 18.000 x g. recolher o sobrenadante.
3. análise de mancha dot
Nota: Incubação do todo é executadas num agitador horizontal.
- Corte a membrana de nitrocelulose em tiras de largura de 1 cm.
Nota: A largura da membrana de nitrocelulose pode ser ajustada de acordo com necessidades experimentais. - Coloca as amostras de 2 µ l uniformemente sobre 2 tiras (tira 1 e 2) com cada intervalo ponto a 0,5 cm.
- Coloque as tiras em temperatura ambiente por 5 min até a gota na banda é seca.
- Incube as tiras com uma solução de BSA de 5% durante 30 min à temperatura ambiente.
- Enxague as tiras com uma solução TBST por 5 min à temperatura ambiente.
- Aspire a solução TBST. Por 1h à temperatura ambiente, incubar a tira 1 com um anticorpo antioligómero A11 solução e tira 2 com uma solução de 6E10 de anticorpo anti-Aβ.
- Enxague as tiras com uma solução TBST três vezes, cada vez por 5 min à temperatura ambiente.
- Aspire a solução TBST. Incube as tiras com uma solução de anticorpo secundário por 40 min à temperatura ambiente.
- Enxague as tiras com uma solução TBST três vezes, cada vez por 5 min à temperatura ambiente.
- Aplica uniformemente o fluido ECL misto na superfície das tiras. Expor as tiras em uma quimioluminescência automática, sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais).
Nota: Normalmente, 300 µ l de fluido ECL é suficiente para uma membrana. A membrana deve ser mantida úmida durante a exposição. O tempo de exposição é calculado automaticamente pelo sistema da imagem latente. - Fazer uma análise de tons de cinza usando o ImageJ (National Institutes of Health) ou outro software de processamento de imagem para obter resultados semi-quantitativa.
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Representative Results
Para investigar se um monômero de1-42 de Aβ pode formar um oligómero de1-42 de Aβ após preparação, utilizou-se análise de temperatura. Não agregados visíveis foram observados na amostra de monômero de1-42 de Aβ HFIP-dissolvido (Figura 1A). Além disso, principalmente globulares agregados com um diâmetro de ao redor 10-80 nm foram observados na amostra1-42 Aβ após 48 h de tremer, sugerindo que Aβ1-42 formas oligómeros após preparação (Figura 1B).
Figura 1 . Análise de temperatura de monômero de1-42 de Aβ e amostras de ricos oligómero Aβ1-42 . A amostra de monômero HFIP-dissolvido Aβ1-42 (10 µM) e Aβ1-42 oligómero rica amostra (10 µM) preparado de acordo com este protocolo foram examinados pela TEM. Barra de escala = 200 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Além disso, ponto de análise a mancha foi utilizado para avaliar a quantidade relativa de oligómero de1-42 Aβ nas amostras. Um anticorpo A11 poderia reagir com um subconjunto dos tóxico oligómero Aβ com estruturas de β-folha antiparalelos. Um anticorpo OC reage com fibrillar agregados com estruturas paralelas de β-folha de registro. Usando estes anticorpos, demonstrámos que A11-positivo Aβ1-42 oligómeros, mas não OC-positivo Aβ1-42 fibrillar agregados, principalmente apareceram nas amostras ricas oligómero Aβ1-42 que foram preparadas de acordo com o protocolo ( A Figura 2). Usando o 6E10 de anticorpo anti-Aβ, observamos que o número de peptídeos Aβ1-42 foi similar na amostra de monômero HFIP-dissolvido Aβ1-42 e a amostra de ricos oligómero Aβ1-42 (Figura 2).
Figura 2 . Ponto mancha análise de monômero de1-42 de Aβ e Aβ1-42 amostras ricas oligómero. Amostra de monômero (A) The HFIP-dissolvido Aβ1-42 (10 µM) e Aβ1-42 oligómero rica amostra (10 µM) preparado de acordo com este protocolo foram examinados por ponto mancha análise usando o anticorpo antioligómero A11, anti-fibrillar oligómero 6E10 anticorpo anticorpo OC e anti-Aβ. (B - D) a análise semi-quantitativa de tons de cinza foi realizada pelo ImageJ. Os dados, expressados em percentagem de controle, foram a média ± SEM de 3 experimentos independentes; *** p < 0,001 versus o grupo de monômero Aβ1-42 (ANOVA e t-teste). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para investigar se esse protocolo poderia ser usado para inibidores de tela de oligômeros Aβ1-42 , a curcumina, um conhecido inibidor de oligómero Aβ, foi usado. Descobrimos que uma incubação co com curcumina (0.1 - 1 µM) reduziu significativamente os montantes relativos do oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo, como evidenciado pela diminuição da coloração da A11 da curcumina co incubadas Aβ1-42 oligómero amostra do que na normal incubadas Aβ1-42 oligómero rica amostra (Figura 3). Na mesma condição, a curcumina (0.1 - 1 µM) não alterou o número de peptídeos Aβ1-42 , como a coloração de 6E10 era mesmo em todas as amostras (Figura 3).
Figura 3 . Ponto mancha análise de curcumina co incubadas Aβ1-42 amostras ricas oligómero. Monômeros (A) HFIP-dissolvido Aβ1-42 (10 µM) foram elaborados de acordo com este protocolo e incubados com ou sem a curcumina (0, 0,1, 1 µM) sob agitação por 48 h. As amostras foram examinadas por um ponto de análise usando A11 e 6E10 a mancha. (B) em tons de cinza semianálise foi realizada pelo ImageJ. Os dados, expressados em percentagem de controle, foram a média ± SEM de 3 experimentos independentes; *** p < 0,001 vs grupo sozinho de Aβ1-42 (teste ANOVA e Tukey). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para verificar a formação oligómero, nós também usamos um gel não-desnaturação. Encontramos esse oligómero (> 4 KD) esteve presente na amostra Aβ1-42 oligómero-ricos, enquanto a maioria dos monômero (4 KD) foi encontrado na amostra de monômero de Aβ1-42 (Figura S1).
Temos investigado Aβ agregados no sobrenadante e sedimento da amostra Aβ1-42 . Após 48 h de incubação, oligómero Aβ1-42 mas não Aβ1-42 fibrillar agregados foram encontrados no sobrenadante da amostra conforme determinado pela A11, OC e anticorpos 6E10 (Figura S2). Na mesma condição, agregados fibrillar de Aβ1-42 , mas não os oligómeros de1-42 Aβ foram encontrados na pelota da amostra (Figura S2).
Também examinamos a morfologia da amostra tratada com curcumina Aβ1-42 usando TEM. A amostra tratada com curcumina contém alguns pontos esféricos, sugerindo que a curcumina poderia reduzir a quantidade de oligómero Aβ1-42 (S3 figura).
Figura S1 . Non-desnaturação análise de eletroforese de gel de monômero Aβ1-42 e Aβ1-42 amostras de ricos oligómero. A amostra de monômero dissolvido-HFIP Aβ1-42 (10 µM) e Aβ1-42 oligómero rica amostra (5 µM, baixo; 10 µM, alta) preparado de acordo com este protocolo foram examinados por eletroforese em gel não-desnaturação usando o 6E10 de anticorpo anti-Aβ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura S2 . O sobrenadante da solução Aβ1-42 contém principalmente oligómero, mas agregados não fibrillar. Uma solução Aβ1-42 (50 µ l), após agitação por 48 h, foi centrifugada a 18.000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante foi coletado e o sedimento foi re-dissolvido em 850 µ l de água bidestilada. O líquido sobrenadante e sedimento mais foram examinados por um ensaio de mancha de ponto usando anticorpos OC, A11 e 6E10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura S3 . Análise de temperatura de curcumina co incubadas Aβ1-42 amostras de ricos oligómero. Monômeros de Aβ1-42 HFIP-dissolvido (10 µM) foram elaborados de acordo com este protocolo e incubados com 1 µM curcumina sob agitação por 48 h. As amostras foram examinadas pela TEM. Barra de escala = 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, registramos um método para preparar amostras contendo oligómero Aβ1-42 e analisar as quantidades de oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo por um ponto de análise a mancha. Embora nossos métodos para a preparação de amostras de ricos oligómero Aβ1-42 são bastante simples, confiáveis e reprodutíveis, existem ainda alguns pontos para ser notado. Em primeiro lugar, HFIP é usado para dissolver o péptido sintético de1-42 de Aβ. Um peptídeo de1-42 de Aβ agregado pode desmontar em monômero na solução HFIP. No entanto, HFIP é fácil volatilize, e da viscosidade do HFIP é muito baixa. Portanto, o peptídeo de1-42 de Aβ deve ser dissolvido em HFIP e a solução HFIP deve ser aliquotada tão rapidamente quanto possível para reduzir a perda potencial de HFIP durante a operação. Além disso, as pontas de pipeta devem ser cortadas para garantir a pipetagem precisos neste procedimento. Em segundo lugar, o gás nitrogênio de alta pureza é usado para evaporar o HFIP da solução. Durante este procedimento, a solução de1-42 de Aβ deve ser agitada de vez em quando para garantir que o HFIP pode ser totalmente evaporada. No final deste procedimento, o cheiro de HPIF não deve ser detectado na solução. Normalmente, 30 min de evaporação reduz a concentração de HFIP para menos de 0,1%. Nessa concentração, HFIP é relatado para não alterar a transição de conformação de Aβ1-427. Em terceiro lugar, ao preparar as amostras que contêm oligómero Aβ1-42 , o volume mínimo do líquido deve ser maior que 50 µ l. caso contrário, as amostras são susceptíveis de dispersão em pequenas gotículas, anexar à parede dos tubos. Além disso, monômero Aβ1-42 não pode formar oligómero sem uma mistura completa.
O protocolo para preparar uma amostra de ricos oligómero Aβ1-42 , conforme descrito aqui é um pouco diferente de alguns protocolos utilizados em outros grupos. Por exemplo, em alguns estudos, HFIP foi evaporado antes de adicionar água bidestilada para a solução de8,9. No entanto, em tal condição, o peptídeo de1-42 de Aβ pode formar pequenas folhas, que são difíceis de dissolver-se a solução. Portanto, nós decidimos adicionar água bidestilada primeiro e então evaporar o HFIP pelo gás nitrogênio. Mais importante ainda, oligoméricas formas de agregados preparados pelo presente protocolo são confirmadas pela TEM. Além disso, oligómero de1-42 de Aβ formado pelo presente protocolo poderia induzir neurotoxicidade em SH-SY5Y células e neurônios hippocampal preliminares e reduzir o desempenho cognitivo após a injeção para a região do hipocampo de ratos, sugerindo que o Aβ1-42 oligómero preparado é bastante tóxico5,10. Estes resultados são consistentes com anteriores estudos11.
Este protocolo para avaliar oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo por uma análise de mancha ponto ainda tem algumas deficiências. Em primeiro lugar, por meio de amostragem manual, não é fácil manter as gotículas de dimensões uniformes. Em segundo lugar, um ponto de análise a mancha é um semi quantitativa, mas método não quantitativo para medir as quantidades de oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo, sugerindo que outros métodos, tais como ELISA, são necessários se a avaliação exata das quantidades de Aβ1-42 oligómero é necessário. Em terceiro lugar, algumas drogas podem reagir aos anticorpos, levando a resultados falso-positivos.
Em geral, nós fornecemos um protocolo confiável para preparar amostras contendo oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo e analisar as quantidades de oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo usando um ponto do ensaio de mancha. Usando este protocolo, oligómero de1-42 de Aβ potencial inibidores com o potencial para tratar a AD podem efetivamente projectados.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (U1503223, 81673407, 21475131), o projeto de pesquisa aplicada na tecnologia sem fins lucrativos de Zhejiang província (2016C 37110), Ningbo Internacional de ciência e tecnologia Projecto de cooperação (2014D 10019), a equipe de inovação Municipal de Ningbo da ciência da vida e saúde (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech projeto riqueza comum 2017C 50042, Li Dak soma Yip Chin Yio Kenneth Li Marine biofarmacêutica fundo de desenvolvimento, e o fundo de K. C. Wong Magna na Universidade de Ningbo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All - automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
References
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