Her presenterer vi en protokoll for å generere insulin uttrykke 3D murine pancreatoids fra frittflytende e10.5 dissosiert bukspyttkjertelen progenitors og den tilknyttede mesenchyme.
Bukspyttkjertelen er en komplisert organ består av mange forskjellige celletyper som arbeider sammen for å regulere blod glukose homeostase og fordøyelse. Disse celletyper inkluderer enzym-sekresjon acinar celler, en arborized ductal system ansvarlig for transport av enzymer til gut, og hormon-produserende endokrine cellene.
Endokrine beta-cellene er den eneste celle i kroppen som produserer insulin til å senke blodsukkernivået. Diabetes, en sykdom karakterisert ved tap eller dysfunksjon av beta-cellene, har nådd epidemiske proporsjoner. Derfor er det viktig å etablere for å undersøke beta-celle utvikling som kan brukes for screening formål for å utlede stoffet, og cellen-basert therapeutics. Mens eksperimentelle etterforskningen av musen utvikling er viktig, er i vivo studier arbeidskrevende og tidkrevende. Kultivert celler gir en enklere plattform for screening; men de er ikke opprettholde mobilnettet mangfold, arkitektoniske organisasjonen og mobilnettet interaksjoner fant i vivo. Dermed er det avgjørende å utvikle nye verktøy for å undersøke bukspyttkjertelen organogenesen og fysiologi.
Bukspyttkjertelen epitelceller utvikle i nært samarbeid med mesenchyme fra utbruddet av organogenesen celler organisere og skille ut komplekse, fysiologisk kompetente voksne orgel. Bukspyttkjertelen mesenchyme gir viktig signaler for endokrine utvikling, hvorav mange ikke er godt forstått ennå, dermed vanskelig å recapitulate under i vitro kulturen. Her beskriver vi en protokoll til kultur tredimensjonale, mobilnettet komplekse musen organoids som beholder mesenchyme, kalt pancreatoids. E10.5 murint bukspyttkjertelen bud er dissekert, avstand og kultivert i en stillaset miljø. Disse flytende cellene samle selv mesenchyme innhyllende utvikle pancreatoid og en robust rekke endokrine beta-cellene utvikle den acinar og rør cellene. Dette systemet kan brukes til å studere celle skjebne besluttsomhet, strukturelle organisasjon og morphogenesis, celle-celle samhandlingene under organogenesen, eller for narkotika, små molekyl eller genetisk screening.
Det er viktig å forstå sykdom etiologien og til slutt dyrke behandlingsmetoder skildre mekanismer for normal utvikling og fysiologi. Dyrking og skille stamceller kan rask og høy gjennomstrømming analyse av utviklingen, det er begrenset av den eksisterende kroppen av kunnskap om mekanismer regulere celle skjebne og kunstig viser utviklingen i en relativt homogen, todimensjonal tilstand1,2. Ikke bare i vivo utvikling påvirket av ytre påvirkninger, med ulike celletyper i nisje og miljø gir paracrine signaler og organisatoriske å veilede organogenesen, men funksjonen til disse cellene også avhengig av deres omgivelser for veiledning3,4,5. Gitt viktigheten av disse eksterne signaler, begrensningene for differensiering protokoller og arbeidskrevende natur i vivo musen modeller, for nye systemer å undersøke eksperimentelt grunnleggende utviklingsprosesser og fysiologi.
Fremveksten av protokoller for å generere tredimensjonale, komplekse organoids gir en praktisk og sammenfallende system for å studere organogenesen, fysiologi, narkotika effekt og selv patogenesen. Etablere murine organoids for forskjellige systemer som magen6 og tarmen7 har utvidet vår forståelse av organogenesen, gir et verktøy for å studere utviklingsmessige kompleksiteten med færre begrensninger enn i vivo og i vitro modeller. På grunn av disse fremskritt i murine organoid dannelsen og utviklingen av menneskelig pluripotent stilk celler, menneskelige tarmen8, netthinnen9, nyre10,11og cerebral12 organoids har blitt produsert, og dette repertoar er bare begrenset av de eksisterende kunnskapen om mekanismer for utvikling.
Av spesiell interesse er generasjonen av bukspyttkjertelen organoids, som en rekke sykdommer plager ulike bukspyttkjertelen celletyper, inkludert acinar celler og kanaler i exocrine pancreatic mangelfull13acinar celler i pankreatitt14, og cellene i diabetes15. Få kunnskap om utviklingen av disse forskjellige celletyper kan hjelpe forstå deres patologi og kan også fungere som en plattform for personlig narkotikarelaterte screening eller transplantasjon. Tidligere utviklet Greggio et al. en metode for å opprette murine bukspyttkjertelen organoids som recapitulate i vivo morphogenesis og utvikle organisert, tredimensjonale, komplekse strukturer består av alle de store bukspyttkjertelen epithelial celle typene16,17. Dette er et stort skritt fremover innen bukspyttkjertelen, spesielt som gjør celler i vitro kan aktivere biologiske undersøkelser av beta-celle utvikling. Men en knapphet på endokrine celler dannet i denne protokollen med mindre organoids ble transplantert inn i vev, hvor nisje kan samhandle og gi opplæring stikkordene17. Mesenchyme utgjør den største delen av nisje, tungt innhyllende utvikle epitel fra tidlige stadier av organogenesen til senere stadier inkludert endokrine delaminering og differensiering3,4, 18. Samspillet av mesenchyme med utvikle bukspyttkjertelen er nok et eksempel på ytre signalisering og viktigheten av å opprettholde i vivo mobilnettet kompleksitet å studere organogenesen.
Her beskriver vi hvordan å generere tredimensjonale bukspyttkjertelen organoids, kalt pancreatoids, fra avstand e10.5 murint bukspyttkjertelen progenitors. Disse pancreatoids beholder opprinnelig mesenchyme, selv montere frittflytende forhold og generere alle store bukspyttkjertelen celletyper, inkludert en robust endokrine beta-cellene19. Denne metoden er best egnet for analyse av endokrine utvikling, som tidligere protokoller mangler robust endokrine differensiering. Imidlertid bruker protokollen for bukspyttkjertelen organoids som beskrevet av Greggio et al. passer bedre for analyse av bukspyttkjertelen epithelial forgrening og morphogenesis, som forgrening er mer begrenset i pancreatoids.
Utviklingen av celle kultur modeller er avgjørende for riktig modell utvikling, produsere klinisk relevante celletyper, test narkotika effekt eller selv transplantasjon pasienter. Men kunstig recapitulating utvikling i en rett er utfordrende som vi er fortsatt langt fra forstå mekanismene av organogenesen og fysiologi i vivo. Dermed er i vitro celler ineffektivt generert, ikke fullt funksjonell, kan ikke opprettholdes i lange perioder eller havn andre avvik fra sammenlignbare cellene i kroppen. Dette …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jolanta Chmielowiec for nyttig diskusjon om protokollen og manuskriptet. Vi takker også Benjamin Arenkiel for tilgang til AC confocal mikroskop. Dette arbeidet ble støttet av NIH (P30-DK079638 til MB) og T32HL092332-13 M.O.H. og MB McNair medisinsk grunnlaget (for MB) og AC confocal kjernen BCM intellektuelle og utviklingsmål funksjonshemminger Research Center (NIH U54 HD083092 fra Eunice Kennedy Shriver nasjonale Institutt for Child Health and Human Development).
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
Isopropanol | Fisher | a4164 | |
Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
KCl | KaryoMax | 10575090 | |
KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |