Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.
Abstract
Die Bauchspeicheldrüse ist ein komplexes Organ, bestehend aus vielen verschiedenen Zelltypen, die zusammen arbeiten, um Blut-Glukose-Homöostase und die Verdauung zu regulieren. Diese Zelltypen gehören Enzym-sezernierenden acinar Zellen, einem verzweigten ductal System für den Transport von Enzymen, die Darm- und Hormon-produzierende endokrine Zellen verantwortlich.
Endokrine Beta-Zellen sind die einzige Zelltyp im Körper, die produzieren Insulin um den Blutzuckerspiegel zu senken. Diabetes, eine Krankheit, gekennzeichnet durch einen Verlust oder Dysfunktion des Beta-Zellen, erreicht epidemische Ausmaße. Daher ist es unentbehrlich, Protokolle, um Beta-Zell-Entwicklung zu untersuchen, die zu screening-Zwecken verwendet werden können, die Droge und zellbasierte Therapie ableiten. Während die experimentelle Untersuchung der Maus Entwicklung unverzichtbar ist, sind in Vivo Studien mühsam und zeitaufwändig. Kultivierte Zellen bieten eine sehr komfortable Plattform für das Screening; Allerdings sind sie nicht in der Lage, die zellulären Vielfalt, architektonische Organisation und zellulären Interaktionen gefunden zu erhalten in-vivo. Daher ist es wichtig, die Entwicklung neuer Instrumente zur Untersuchung der Pankreas Organogenese und Physiologie.
Epitheliale Zellen der Bauchspeicheldrüse entwickeln in enger Zusammenarbeit mit Mesenchym vom Beginn der Organogenese, wie Zellen zu organisieren und in das komplexe, physiologisch zuständigen Erwachsenen Organ zu unterscheiden. Die Bauchspeicheldrüse Mesenchym bietet wichtige Signale für die endokrine Entwicklung, von die viele auch noch nicht, so schwierig, während der in-vitro- Kultur rekapitulieren verstanden sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Kultur dreidimensionale, zelluläre komplexe Maus Organellen, die Mesenchym, genannt Pancreatoids zu behalten. Die e10.5 murinen Pankreas Knospe seziert, dissoziiert und in ein Gerüst-freie Umgebung kultiviert. Dieser schwimmenden Zellen zusammensetzen selbst, mit Mesenchym umhüllt die Entwicklung Pancreatoid und eine robuste Reihe von endokrinen Beta-Zellen, die zusammen mit den acinar und die Kanal-Zellen entwickeln. Dieses System kann verwendet werden, um die Zelle Schicksal Entschlossenheit, Aufbauorganisation und Morphogenese, Zell-Zell-Interaktionen während der Organogenese, oder für die Droge, kleines Molekül oder genetisches Screening studieren.
Introduction
Abgrenzung der Mechanismen für die normale Entwicklung und die Physiologie ist ausschlaggebend für die Ätiologie der Erkrankung zu verstehen und letztlich Behandlungsmethoden zu kultivieren. Während der Kultivierung und Differenzierung von Stammzellen schnelle und Hochdurchsatz-Analyse der Entwicklung ermöglicht, es ist begrenzt durch die vorhandenen Körper des Wissens über Mechanismen reguliert Zelle Schicksal und künstlich rekapituliert Entwicklung in einem relativ homogene, zweidimensionalen Zustand1,2. Nicht nur in Vivo Entwicklung beeinflusst von äußeren Einflüssen, mit verschiedenen Zelltypen in der Nische und Milieu bietet Parakrine Signale und organisatorische Unterstützung, Organogenese führen, sondern die Funktion dieser Zellen beruht auch auf ihre Umgebung für Führung3,4,5. Angesichts der Bedeutung von diesen externen Cues, die Grenzen der Differenzierung Protokolle und die mühsame Art der in Vivo Mausmodelle, Neuanlagen werden mussten grundlegende Entwicklungsprozesse und Physiologie experimentell zu untersuchen.
Die Entstehung von Protokollen, dreidimensionale, komplexe Organellen zu generieren bietet eine bequeme und kongruente System zur Untersuchung der Organogenese, Physiologie, Wirksamkeit von Medikamenten und sogar Pathogenese. Gründung murine Organellen für verschiedene Systeme wie der Magen6 und Darm7 unser Verständnis der Organogenese ausgedehnt haben, bietet ein Werkzeug, um Entwicklungsstörungen Komplexität mit weniger Einschränkungen als in Vivo Studie und in-vitro- Modelle. Durch diese Fortschritte bei der murinen organoide Bildung und dem Aufkommen der menschlichen pluripotenten Stammzellen Zellen, menschlichen Darm8, retinale9, renal10,11, und zerebralen12 Organellen hergestellt wurden, und dies Repertoire ist nur durch das vorhandene Wissen über die Mechanismen der Entwicklung begrenzt.
Von besonderem Interesse ist die Generation der pankreatischen Organellen, wie eine Vielzahl von Krankheiten verschiedener Pankreas Zelltypen, einschließlich acinar Zellen und Kanälen exokrinen Pankreasinsuffizienz13acinar Zellen in Pankreatitis14, Plagen und Beta-Zellen in der Diabetes-15. Erwerb von Wissen über die Entwicklung dieser verschiedenen Zelltypen konnte helfen beim Verständnis ihrer Pathologie und fungieren darüber hinaus als Plattform für personalisierte Drogentest oder Transplantation. Zuvor, Greggio Et Al. entwickelt eine Methode zum Erstellen von murinen Pankreas Organellen, die in Vivo Morphogenese rekapitulieren und entwickeln organisierte, dreidimensionale, komplexe Strukturen bestehend aus allen wichtigen Pankreas Epithelzelle 16,17-Typen. Dies ist ein großer Schritt nach vorne im Feld Pankreas, vor allem die Zellen in Vitro können biologische Untersuchungen von Beta-Zell-Entwicklung ermöglichen. Jedoch bildeten eine Knappheit von endokrinen Zellen in diesem Protokoll, es sei denn die Organellen in Gewebe transplantiert wurden, wo die Nische könnte interagieren und didaktische Hinweise17. Das Mesenchym bildet den größten Teil der Nische, Kuvertierung stark entwickelnde Epithel von frühen Stadien der Organogenese zu späteren Phasen einschließlich endokrine Delamination und Differenzierung3,4, 18. Das Zusammenspiel von dem Mesenchym mit der entwickelnden Bauchspeicheldrüse ist noch ein weiteres Beispiel für extrinsische Signalisierung und die Bedeutung der Aufrechterhaltung der in Vivo zellulären Komplexität Organogenese zu studieren.
Hier beschreiben wir, wie dreidimensionale Pankreas Organellen, genannt Pancreatoids, von dissoziierten e10.5 murinen Pankreas Stammväter generieren. Diese Pancreatoids behalten native Mesenchym, frei schwebenden Bedingungen selbst zusammensetzen und generieren alle wichtigen Pankreas Zelltypen, einschließlich eine robuste Reihe von endokrinen Betazellen19. Dieser Ansatz eignet sich am besten für die Analyse von endokrinen Entwicklung, da frühere Protokolle robuste endokriner Differenzierung fehlt. Allerdings ist unter Verwendung des Protokolls für Bauchspeicheldrüsenkrebs Organellen wie beschrieben durch Greggio Et Al. ist besser geeignet für die Analyse der pankreatischen epithelialen Verzweigungen und Morphogenese, als Verzweigung in Pancreatoids geringer.
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Protocol
Alle Tierversuche, die in dieser Methode beschriebenen stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss des Baylor College of Medicine.
1. Vorbereitung der Maus embryonalen Tag 10.5 Pankreas Stammväter
Hinweis: Dieses Protokoll muss nicht erst in Schritt 2, unter sterilen Bedingungen einzuhalten, aber es eignet sich optimal zum Sterilisieren Dissektion Werkzeuge und sprühen Sie mit 70 % igem Ethanol vor dem Gebrauch.
- Um für die Dissektion einzurichten, füllen Sie einen Eiskübel und stellen Sie einen Behälter von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) im Eis. Reinigen Sie zwei feine Spitzen Pinzette und Schere Dissektion mit 70 % Ethanol. Legen Sie in der Nähe der Dissektion, ein Behälter mit mindestens drei Borosilikat Kapillare Rohre, eine Mund-Pipette, ein Feuerzeug und 1.000 µL Pipettenspitzen gefiltert.
- Bereiten Sie mindestens 1 mL kalte Dispase 1,25 mg/mL verdünnt in sterilisierten Wasser und Platz in den zweiten Brunnen von einem 12-well-Platte auf dem Eis. Setzen Sie PBS in die erste, dritte und vierte Platte Brunnen der 12 gut. Platz 1 mL 0,05 % Trypsin in 1,5 mL tube auf Eis. Einen schütteln Inkubator 37 oc Vorwärmen
- Einschläfern Sie e10.5 timed-schwangeren Mäusen nach IACUC Richtlinien. Sprühen Sie den Bauch mit 70 % Ethanol, das Zwerchfell Puffernummern und Reinigen der Region vor einen v-förmigen Einschnitt in den Genitalbereich der Maus mit Schere und Pinzette.
Hinweis: Darstellung eines vaginalen Steckers in dieses Protokoll zeigt Tag 0,5. Mit 5 - 6 Wochen alten Mäusen, wirkt eine Gewichtszunahme von mehr als 2 g als eine sekundäre Maßnahme der erfolgreichen Imprägnierung.- Verbrauchsteuern Sie sorgfältig die Gebärmutter durch einen Schnitt zu machen, an die obersten seitlichen Abschnitte der Gebärmutter, zieht das Organ nach oben von der Maus, und nach dieser Einschnitt bis in den Genitalbereich vor auf der gegenüberliegenden Seite wiederholen. Legen Sie sie in einer 10 cm Petrischale mit kaltem PBS.
Hinweis: Es ist möglich, Organellen aus e11.5 distanzierte Zellen zu erhalten, aber im Gegensatz zu den e10.5 Pancreatoids, diese Organellen noch nicht gekennzeichnet sind und somit nicht in der Lage weiterhin können, in alle drei großen Pankreas Linien zu unterscheiden.
- Verbrauchsteuern Sie sorgfältig die Gebärmutter durch einen Schnitt zu machen, an die obersten seitlichen Abschnitte der Gebärmutter, zieht das Organ nach oben von der Maus, und nach dieser Einschnitt bis in den Genitalbereich vor auf der gegenüberliegenden Seite wiederholen. Legen Sie sie in einer 10 cm Petrischale mit kaltem PBS.
- Platzieren Sie unter dem Mikroskop leicht Dissektion der Petrischale und öffnen Sie vorsichtig des uterinen Gewebes indem zwei Pinzetten zwischen jedem Embryo und peeling Gewebe Weg von dem Dottersack. Transferieren Sie die Embryonen durch das Greifen der Dottersack sanft mit Zange und in einer 10 cm Petrischale mit frischem, kaltem PBS. Legen Sie die Petrischale auf Eis.
Hinweis: Es ist wichtig, heedfully zu entfernen Embryonen, vorzugsweise innerhalb der Dottersack beibehalten, wenn gewaltsame Entfernung der Nabelschnur, Rippen Gewebe des Embryos und die strukturelle Integrität ziehen kann. - Legen Sie mehrere PBS Tropfen auf einer 10 cm Petrischale Deckel. Verwenden Sie diese Tröpfchen auf den Embryotransfer bei Dissektion extraembryonic Gewebe entfernt werden, um die Sichtbarkeit zu gewährleisten. Transfer eines Embryos zu einem Rückgang der PBS und entfernen Sie vorsichtig aus dem Dottersack mit Pinzette, während die restlichen Embryonen mit PBS-Puffer auf dem Eis (Abb. 1A) bleiben. Entfernen Sie den Kopf vor dem Verschieben des Embryos zu einem neuen PBS mit Pinzette leicht den Embryo, keine Beschädigung des Gewebes (Abbildung 1B) schöpfen.
Hinweis: Das Gewebe müssen immer häufiger auf frischen PBS Tröpfchen übertragen werden, als hier, je nach Deckkraft der Flüssigkeit beschrieben.- Entfernen Sie in einem neuen PBS-Tropfen die vordergliedmaße Knospen mit Pinzette (Abbildung 1B). Setzen Sie Zange in die Öffnung, wo Leib Knospe anwesend war und sanft reißen nur die meisten externe Gewebe anterior (Abbildung 1B). Embryo zu drehen und in Richtung posterior, Halt an die Megalosauridae Knospe zu wiederholen. An dieser Stelle sollte der Magen-Darm-Trakt sichtbar ist (Abbildung 1B).
- Die hintere Region des Magen-Darm-Trakt hat eine leichte Biegung (Abb. 1F). Zange hinter dieser Biegung in die Öffnung zwischen den Magen-Darm-Trakt und die Wirbelsäule Region der Körperwand einfügen. Lösen Sie den Magen-Darmtrakt, langsam nach oben arbeiten, bis die meisten frontzahngebiet erreicht ist (Abbildung 1B-E), wo die kardialen Region verbindet.
OPTIONAL: Entfernen Sie das ursprüngliche Herz und die Leber Knospen aus den ventralen Regionen des Gastrointestinaltraktes, verlassen nur die kontinuierliche Darm Rohr. Die ersten paar Male dieses Protokoll erfolgt es könnte einfacher sein, das Herz und die Leber zu verlassen, wie ventrale Wahrzeichen bis der Morphologie des Magen-Darm-Trakt und der dorsalen Pankreas Knospe mehr sind vertraut (Abbildung 1C und D ). - Übertragen Sie den Magen-Darm-Trakt auf das frische PBS Tröpfchen.
- Nehmen Sie Zange und Kneifen Sie sanft das Gewebe unterhalb der überstehenden Knospe und den Darm und heben Sie das äußere Gewebe aus (Abbildung 1-D-F).
Hinweis: Die dorsale Pankreas Knospe befindet sich zwischen Magen und Darm (Abbildung 1C-G). Die Pankreatische Knospe unter sollte aussehen wie eine Runde, knorrigen Struktur (Abb. 1G). - Zange zu platzieren, wo verbindet die Knospe zum Darm und Prise nach oben um die Knospe (Abbildung 1G) zu lösen. Waschen Sie einmal in einer neuen PBS-Blase vor der Übertragung der Knospe in den ersten Brunnen 12-well-Platte in kaltem PBS auf Eis. Wiederholen Sie, bis alle Knospen sind von Embryonen aufgenommen und in die erste Bohrung 12-well-Platte.
- Legen Sie die 12 gut Gericht unter dem Mikroskop leicht Dissektion. Die Anzahl der pankreatischen Knospen erfolgreich seziert, um später das Split-Verhältnis zu berechnen.
- Ort eine gefilterte 1.000 µL PIPETTENSPITZE in die Mund-Pipette mit einem Kapillarröhrchen angebracht. Flamme der Kapillare zu sterilisieren und erstellen eine Biegung in der Röhre für die Benutzerfreundlichkeit. Verwenden Sie die Kapillare Knospen auf die zweite gut mit kaltem Dispase-Lösung für 2 min zu übertragen, bevor er auf den dritten Brunnen mit sauberem PBS (Abbildung 1G).
Hinweis: Beim Übertragen von Knospen aus Dispase, PBS, berühren Sie das Gewebe an der Spitze des kapillarröhrchens. Wenn das Gewebe an der Spitze der Röhre stecken, pipette rauf und runter oder schütteln in die saubere PBS-Lösung bis gelockert. - Pipette Knospen rauf und runter, und auf der vierten Brunnen mit sauberem PBS übertragen. Schließlich verwenden die Kapillare Gerät Transfer Knospen an der 1,5 mL Tube mit 0,05 % Trypsin. Legen Sie das Rohr in den vorgewärmten 37 oC-Shaker und schütteln Sie bei 1.500 u/min für 4 Minuten.
- Wirbel für ca. 10 s sofort legen Sie dann den Schlauch in eine Zentrifuge und Spin für 5 min bei 200 g. entfernen alle aber etwa 50 µL der Lösung vorsichtig, nicht zentrifugiert Zellen (Abbildung 1G) stören.
- Ort eine gefilterte 1.000 µL PIPETTENSPITZE in die Mund-Pipette mit einem Kapillarröhrchen angebracht. Flamme der Kapillare zu sterilisieren und erstellen eine Biegung in der Röhre für die Benutzerfreundlichkeit. Verwenden Sie die Kapillare Knospen auf die zweite gut mit kaltem Dispase-Lösung für 2 min zu übertragen, bevor er auf den dritten Brunnen mit sauberem PBS (Abbildung 1G).
2. Kultivierung dissoziierte Vorfahren um Pancreatoids zu bilden
Hinweis: Die folgenden sollte in einer sterilen Atmosphäre in einem standard Gewebekultur Haube, mit sterilen Standardverfahren durchgeführt werden.
- Fügen Sie für jede Knospe gesammelt 400 µL Organogenese Medien16,17 (Tabelle 1 hinzu) zu zentrifugiert Zellen. Pulse Wirbel dreimal und Platte 100 µL pro Bohrloch einer niedrigen Anlage 96 Platte gut, Aufteilung Knospen im Verhältnis 1:4 (Abbildung 1G).
- Überprüfen Sie unter dem Mikroskop zu visualisieren Zellen frei schwebend (Abbildung 1H) getrennt. Legen Sie die Kulturschale in einem Inkubator 37 oC mit 5 % CO2 auf einer Wippe bei mittlerer Geschwindigkeit.
- Überwachen Sie den Fortschritt der Pancreatoids täglich. Ersetzen Sie mit 100 µL frische Medien alle 3 Tage sorgfältig pipettieren unter mikroskopischer Kontrolle in der Kapuze, wobei den Pancreatoid in den Brunnen zu entfernen. Alternativ können frische 100 µL der Medien einen neuen Brunnen und Pancreatoid mit übertragen hinzugefügt werden, dass das Borosilikatglas Kapillarrohr befestigt Mund Pipette und 1000 µL PIPETTENSPITZE gefiltert.
3. Verarbeitung Pancreatoids für Immunofluorescent Imaging
- Um Pancreatoids für immunofluorescent Bilder bearbeiten zu können, bereiten Sie zuerst 4 % Paraformaldehyd/PBS, pH7.4 (PFA) Lösung. Platz 50 µL 4 % PFA in Vertiefungen der 96 gut Platte.
- Mit dem Kapillarröhrchen Borosilikat und Mund Pipette mit der gefilterten PIPETTENSPITZE 1.000 µL, transfer Pancreatoids vom Nährmedium unter Medien so wenig wie möglich in den frischen Brunnen mit 4 % PFA. Legen Sie auf die Wippe bei Raumtemperatur 15 Minuten.
- Übertragen Sie Pancreatoids von 4 % PFA in einen Brunnen mit 100 µL frische PBS rock bei Raumtemperatur für 5-10 min. Wiederholung für eine Gesamtmenge von drei frische PBS wäscht.
Hinweis: Das Protokoll kann hier mit Pancreatoids gespeichert in 100 µL PBS bei 4 oC für bis zu eine Woche pausiert werden.
- Für die Wholemount Bildgebung (empfohlen, wenn Antikörper geeignet, alternativer Ansatz in Abschnitt 3.3 sind. und Mikroskopie in 3.4.), übertragen von PBS in 50 µL 5 % Esel Serum mit 1 X PBS-Puffer mit 0,1 % nichtionische Reinigungsmittel (PBST) zu blockieren. Rock über Nacht bei 4 oC oder alternativ für 4 h bei Raumtemperatur.
- Pancreatoids zu übertragen, um einen neuen Brunnen mit primären Antikörper in 50 µL 5 % Esel Serum in 1 verdünnt X PBST. Optimal, Rock für 24 h bei 4 oC (mindestens 12 h aber bis zu 36 h).
Hinweis: Antikörper aufgeführt in der Tabelle der Materialien gegen Chga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) und Pdx1 (1: 100) eignen sich für Wholemount Färbung; andere Antikörper können Optimierung erfordern. - Übertragen Sie Pancreatoids zu einem Brunnen mit 100 µL frisches PBST waschen und rock für 30 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von drei frisches PBST wäscht.
- Pancreatoids zu übertragen, um einen neuen Brunnen, sekundäre Antikörper in 50 µL 5 % Esel Serum in 1 verdünnt enthält X PBST. Schützen Sie die Platte vor Licht und in 4 oC, optimal 24 Stunden (mindestens 12 h aber bis zu 36 h) rocken.
Hinweis: Alle Sekundärantikörper aufgeführt in der Tabelle der Werkstoffe und DAPI nuklearen gegenfärbung eignen sich für Wholemount Färbung. - Pancreatoids zu übertragen, um einen neuen Brunnen mit 100 µL 1 x PBST und Rock bei Raumtemperatur für 30 min. Wiederholung für eine Gesamtmenge von drei Wäschen in 1 X PBST. In der dritten und letzten Wäsche hinzufügen 300 nM DAPI.
- Schließlich stecken Sie in 100 µL von reinen PBS und bei 4 oC lichtgeschützt für bis zu einer Woche vor Bildgebung durch konfokale Mikroskopie, obwohl beste Ergebnisse aus Bildgebung unmittelbar nach der Färbung kommen. Um zu verhindern, dass Bewegung der Pancreatoids während der Aufnahme aber Austrocknen zu verhindern, legen Sie jede Pancreatoid in ein Tröpfchen 20 µL PBS. Wenn Pancreatoids nicht noch bleiben, reduzieren Sie PBS-Lautstärke.
- Pancreatoids zu übertragen, um einen neuen Brunnen mit primären Antikörper in 50 µL 5 % Esel Serum in 1 verdünnt X PBST. Optimal, Rock für 24 h bei 4 oC (mindestens 12 h aber bis zu 36 h).
- Übertragen Sie für Gefrierschnitte Pancreatoids von PBS in 30 % Saccharoselösung über Nacht bei 4 oC.
- Einbetten von Medien in einer Blase unter dem Mikroskop Dissektion hinzufügen. Mit Pinzette unter mikroskopischer Kontrolle, Einweichen Sie Pancreatoids indem sanft durch das Einbetten von Medien mehrmals auf Rest Saccharose zu entfernen, bevor Sie auf eine Gewebe-Block mit gefrorenen Einbetten von Medien übertragen.
- Legen Sie das Gewebe Block auf Trockeneis bis gefroren und Abschnitt auf Kryostaten bei 8 µm.
Hinweis: Abschnitte können bei-80 oC oder Immunostained sofort gespeichert werden. - Lassen Sie Abschnitte von-80 oC auftauen bei Raumtemperatur ca. 5 Minuten trocknen. Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere mit dem hydrophoben PAP-Stift auf das Gewebe und den Block mit 5 % Esel Serum verdünnt in 1 X PBST für 30 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie Medien zu und ersetzen Sie sofort mit Primärantikörper verdünnt in 5 % Esel Serum verdünnt 1 X PBST Übernachtung im 4 oC.
- Die primäre Lösung entfernen und waschen Gewebe dreimal mit 1 X PBST für 10 Minuten. Im Anschluss daran fügen Sekundärantikörper Lösung verdünnt in 5 % Esel Serum verdünnt in 1 X PBST für 1 h bei Raumtemperatur und Folien vor Licht schützen.
- Die sekundäre Lösung entfernen und waschen Folien dreimal in 1 X PBST für 10 Minuten. In der letzten Wäsche hinzufügen 300 nM DAPI.
- Entfernen von Medien und Montage Medien und einem deckgläschen hinzufügen. Store gleitet lichtgeschützt in 4 oC bis bereit zum Bild.
4. Isolierung von RNA aus Pancreatoids für die Protokoll-Analyse
- Sammeln Sie Pancreatoids mit Borosilikat-Kapillare mit einer Mund-Pipette mit einem gefilterten 1.000 µL PIPETTENSPITZE für Sterilität und Ort in 500 µL Säure Guanidinium Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Lösung in einem 1,5 mL Röhrchen verbunden. Bei-80 oC lagern Sie oder gehen Sie sofort zur RNA-Isolierung.
- Tauen Sie für RNA-Isolierung Proben auf Eis auf, wenn nötig und 100 µL Chloroform. Vortex gut und Platz in 4 oC für 15 min. Vorkühlen eine Zentrifuge, 4 oC.
- Legen Sie Rohre in Zentrifuge und Spin für 20 min bei 12.000 g bei 4 oC.
- Entfernen Sie vorsichtig die Rohre, um die Trennung der Schichten nicht zu stören. Mit einer 200 µL Pipette, sammeln Sie die klare wässrige Lösung und setzen Sie eine neue 1,5 mL Tube, hinterlässt eine kleine Menge an Puffer aus den weißen Protein Layer und Rosa DNA-Layer. Berühren Sie nicht die Spitze der Pipette an nichts in diesem Prozess, und berühren Sie nicht die Wände der 1,5 mL Tube.
- Die neue Röhre mit der wässrigen Schicht und Vortex fügen Sie 500 µL 100 % Isopropanol hinzu. Lassen Sie sich bei Raumtemperatur für 20 min, länger auf dem Eis oder für maximale Niederschläge lassen über Nacht bei-20 oC.
- Zentrifugieren Sie bei 12.000 g für 15 min bei 4 oC, pellet-RNA. Entfernen Sie das Isopropanol ohne zu stören das Pellet.
Hinweis: Da Pancreatoids klein sind, ist es wahrscheinlich das Pellet nicht angezeigt werden. - Fügen Sie kalt, 75 % Ethanol und invertieren Sie das Rohr mehrmals. In der Zentrifuge und drehen Sie sich mit 9.000 x g für 10 min bei 4 oC. Remove Ethanol und Spin für 2 min bei 9.000 x g.
- Verwenden Sie 200 µL Pipette, um alle restlichen Ethanol in das Rohr zu entfernen, ohne Kontakt mit der Region, in dem, der das Pellet in befindet. Lassen Sie die Kappe auf dem Rohr für 5-10 min bei Raumtemperatur zur Verdunstung von restlichen Ethanol zu gewährleisten geöffnet.
- Aufschwemmen Sie Pellet durch Vortexen in 20 µL Nuklease-freies Wasser.
Optional: Die RNA Wärmeregelung 65 oC für 3 min und sofort zurück aufs Eis. RNA kann bei-80 oC gelagert oder sofort für reverse Transkription und qPCR verwendet werden.
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Representative Results
Sorgfältige Dissektion von mäuseembryonen am e10.5 aus dem uterinen Horn sollte unbeschädigte Embryonen mit PBS-Puffer für weitere Dissektion (Abb. 1A) ergeben. Der Magen-Darm-Trakt kann der Embryo (Abbildung 1B), schönem Unterscheidung der dorsalen Pankreas Knospe an der Kreuzung der Darm und Magen (Abbildung 1C-F) effizient entfernt werden. Die e10.5 pankreatischen Knospe war zuvor geprägt; Stammväter soll ausdrücken, Pdx1, Sox9, Ptf1a, und Hes120,21,22,23. Nach Gewebe Verarbeitungsschritte können dissoziierten Zellen der Bauchspeicheldrüse einzelne oder kleine Gruppen von Zellen durch Lichtmikroskopie (Abbildung 1-G-H) visualisiert werden.
In Organogenese Medien diese frei schwebenden, Gerüst-freie Zellen selbst zusammensetzen und organisieren in dreidimensionale Pancreatoids, die wachsen und bleiben für mindestens zehn Tage in Kultur (Abb. 2A). Die Pancreatoids haben morphologische Ähnlichkeiten mit der Bauchspeicheldrüse in Vivo mit verzweigten Morphogenese auftreten. Mit Hilfe von transgenen Mäusen, können verschiedene Zelltypen oder Prozesse in Echtzeit überwacht werden. Beispielsweise können mit Hilfe von Ins1-eGFP24 Mäusen um die Bildung von endokrinen Beta-Zellen zu markieren, Pancreatoids in täglichen Beta-Zell-Entwicklung (Abbildung 2B) zu visualisieren abgebildet werden. Weiter, durch verändern Kulturbedingungen, Hinzufügen von kleinen Molekülen, Drogen oder Manipulation des Genoms, nicht nur die Zelle Schicksal Bestimmung beurteilt werden kann sondern auch Veränderungen in Struktur und Morphologie untersucht werden können. Hier zeigen wir die Anwendung von Protein-Kinase C Aktivator Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) in hohen Konzentrationen (160 nM), die ändert sich der Morphologie der Entwicklung von Pancreatoids, was zu lose verbundenen Epithelzellen und erhöhte Verzweigung 19 (Abbildung 2C).
Um die Vereinigung von Pankreas Mesenchym Gewebe mit epithelialen Zellen der Bauchspeicheldrüse zu beurteilen, kann Immunostaining für Marker für jedes Gewebe durchgeführt werden. Immunostaining Rohr Marker, DBA25,26, mit Chga27, Kerne von DAPI geprägt und eine endokrine Marker zeigen Multi-Linie Bildung in Pancreatoids(Abbildung 3). Mesenchym Marker, Vimentin, Co gebeizt mit einem Pankreas Stammvater Marker (von e9.0 bis ca. e15.5) Pdx1, zeigt, dass das Mesenchym der Pancreatoid (Abb. 3B) umhüllt. Immunostaining kann auch verwendet werden, zu prüfen, Morphologie, mit Pdx1 aufschlussreiche verzweigte Strukturen sowie verschiedene Marker Zelltypen von Interesse. In Abbildung 3C, visualisieren wir Beta-Zell-Entwicklung durch Färbung der epitheliale Marker Pdx1 und den Beta-Zellen Marker VG Using qPCR Analyse, Abschriften der Stammväter und Differenzierung der Zellen eine beurteilt werden, wie z. B. Stammvater Gene Pdx1 und Hes1, und differenzierte Marker Prss1, Nkx6-1, Prss3, Hnf6, Isl1 und Ins1 (Abbildung 4).
Abbildung 1: Gliederung der Dissektion, Dissoziation, und Beschichtung von e10.5 Pankreas Vorfahren für die Pancreatoid-Generation. (A) das Hellfeld-Bild der e10.5 Embryo. (B) schematische Darstellung der Dissektion Verfahren, beginnend oben links. Die rote gestrichelte Linien zeigen Regionen zu schneiden, während die grüne Region den Magen-Darm-Trakt. Der Kopf ist zuerst, gefolgt von der Entfernung der vordergliedmaße Knospen und die Öffnung an der Seite des Organismus entfernt. (C) der Magen-Darm-Trakt wird sorgfältig entfernt, mit Herz und Leber Knospen ragen aus der ventrale Region des Traktes. Dorsalen Pankreas Knospe, Magen und Darm können visualisiert werden, wie im Hellfeld Bild gezeigt. (D) Entfernung des Herzens und der Leber Knospen. Schaltplan ist auf der linken Seite und das Hellfeld-Bild ist auf der rechten Seite. (E) Kneifen des Gewebes um die dorsalen Pankreas Knospe, Keim für Dissektion verfügbar zu machen. Schaltplan ist auf der linken Seite und das Hellfeld-Bild ist auf der rechten Seite. (F) den Magen-Darmtrakt mit der dorsalen Pankreas Knospe unter Brightfield Mikroskopie. Im Bild auf der linken Seite ist die Biegung im Darm sichtbar, wo Pinzette platziert werden können, wenn den Magen-Darmtrakt aus der Wirbelsäule Region abnehmen. Auf der rechten Seite zeigt die hohe Vergrößerung Hellfeld Bild der dorsalen und ventralen Pankreas Knospen. (G) Entfernung des dorsalen Pankreas Knospe und Verarbeitung des Gewebes vor Dissoziation, Wiederfreisetzung Organogenese Medien und Plattieren. (H) das Hellfeld-Bild zeigt dissoziierte Zellen unmittelbar nach dem Plattieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Überwachung der Pancreatoids im Laufe der Zeit. (A) Hellfeld-Bilder von Pancreatoids an Tag 1, Tag 2 und Tag 3. Skalieren von Balken = 100 Umm. (B) Manipulation der Kulturbedingungen zu untersuchen, Pankreas Morphogenese. Hier führt der Zusatz von hohen PMA gelösten epithelialen Struktur und erhöhte Verzweigung, wie am Tag 1 und 2 von Hellfeld Mikroskopieren visualisiert. Skalieren von Balken = 100 µm. (C) Ins1-eGFP Maus Pancreatoids am Tag 4, Tag 5, Tag 6, Tag 7 und Tag 9, mit der Entwicklung der Beta-Zellen durch eGFP in grün angezeigt. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Immunostaining Pancreatoids. (A) Immunostaining Pancreatoid am 5.Tag anlässlich der Kanäle von DBA in rot, endokrine Zellen durch Chga in grün und die Kerne von DAPI blau markiert. (B) Immunostaining Pancreatoid am 7.Tag Mesenchym von Vimentin in rot und Pankreas Stammväter von Pdx1 in grün markiert. (B) Immunostaining Pancreatoid an Tag 7 Beta-Zellen durch Insulin in rot und Pankreas Stammväter von Pdx1 in grün markiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Protokoll Analyse. Quantitative PCR von Tag 7 Pancreatoids für Marker der Stammväter und differenzierenden Zellen. Im Vergleich zu in Vivo murinen Gewebe zeigt Scavuzzo Et al. (2017). Ergebnisse sind auf Gapdhnormalisiert. N = 2, Maßstabsleisten sind SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| Komponente | Abkürzung | Endkonzentration |
| Penicillin-Streptomycin | P/S | 1 % |
| FBS-freie Medien ergänzen | 10 % | |
| Beta-Mercaptoethanol | bME | 0,1 mM |
| Phorbol Myristate-12 13-Acetat | PMA | 16 nM |
| Y-27632 oder ROCK-inhibitor | RI | 10 Umm |
| Epidermalen Wachstumsfaktor | EGF | 25 ng/mL |
| R-Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 | aFGF, FGF1 | 25 Ug/mL |
| Heparin-Natrium-Salz | Heparin | 2 U/mL |
| Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10 | FGF10 | 100 ng/mL |
| Dulbeccos geändert Eagle Medium/Nährstoff-Mischung f-12 | DMEM/F12 | bis 5 mL |
Tabelle 1. Organogenese Medien.
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Discussion
Produzieren Sie das Fortschreiten der Kultur zellmodelle ist entscheidend für richtig Modellentwicklung, klinisch relevante Zelltypen, Wirksamkeit von Medikamenten oder sogar Transplantation Patienten. Jedoch künstlich Rekapitulation Entwicklung in einer Petrischale ist eine Herausforderung, da sind wir noch weit davon entfernt, das Verständnis der Mechanismen der Organogenese und Physiologie in-vivo. So sind in-vitro- Zellen ineffizient erzeugt, nicht voll funktionsfähig, nicht für längere Zeit beibehalten werden, oder andere Anomalien von vergleichbarer Zellen im Körper beherbergen. Und zwar deshalb, weil viele verschiedene Zelltypen interagieren, während komplexe morphogenetische Veränderungen auftreten, um Entwicklung und Physiologie beeinflussen. Ein besseres Verständnis von, wie die Entwicklung verläuft durch die Kombination der Bequemlichkeit der in-vitro- würde Systeme unter Beibehaltung der Komplexität der in Vivo Entwicklung ein wertvolles Werkzeug für die biomedizinische Forschung vermitteln.
Die Entwicklung der Organellen ist eine vielversprechende Möglichkeit zur Modellierung der Komplexität der Entwicklung. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man Bauchspeicheldrüsenkrebs Organellen, genannt Pancreatoids, die native Mesenchym zu behalten und robust endokrine Zellen zu generieren, wenn auch Pancreatoids Glukose Reaktionsfähigkeit nicht ausstellen. Dieses Tool kann verwendet werden, um Mechanismen der Entwicklung sowie Funktionalität in ein Kultursystem zu untersuchen, die die Heterogenität des Gewebes gefunden in Vivounterhält. Darüber hinaus kann dies für genetische Bildschirmen oder Bildschirm kleine Moleküle oder Drogen verwendet werden. Dies ist besonders interessant, da Tests Kandidat Drogen in relativ homogenen Zellkultursysteme Auswirkungen dieser Verbindungen auf anderen eng verwandten Zelltypen umgehen können.
Es gibt mehrere wichtige Schritte während dieses Protokolls. Erstens ist die sorgfältige Entfernung von Embryonen aus der Gebärmutter wichtig als die Embryonen gewaltsam herausziehen kann rip der Bauchregion und machen es schwierig zu erkennen, den Magen-Darmtrakt um die pankreatischen Knospe (Schritt 1.3) zu erhalten. Zweite, saubere Dissektion der pankreatischen Knospe aus dem Magen-Darm-Trakt ist kritisch, da überschüssiges Gewebe unter Differenzierung von anderen Zelltypen (Schritt 1.4.4) führen kann. Um dies zu tun, ist es wichtig zu kneifen unterhalb der pankreatischen Knospe und heben Sie das überstehende Gewebe vor die Pankreatische Knospe zu isolieren. Schließlich wenn Knospen bewegen aus der Dispase zurück in die PBS waschen, es ist zwingend notwendig eine Borosilikat Kapillarrohr verwenden und nicht das Gewebe der öffnungskante Rohr berühren zu lassen, sonst, das Gewebe wird an der Spitze des Rohres (Schritt 1.5.1) kleben. Um dies zu vermeiden, vor der Knospe, so dass die Knospe in die Röhre und nicht auf der Außenseite gehen in Richtung begonnen Sie Mund pipettieren Lösung werden.
Diese Methode ermöglicht die Bildung von endokrinen Zellen in ein 3D Pancreatoid, die epithelialen Verzweigung ist jedoch geringer als anderen vorhandenen Protokolle16,17. Weiter, während Insulin-produzierenden endokrinen Form Zellen, sie nicht Glukose Reaktionsfähigkeit aufweisen. So wird weitere Untersuchung der Reifung dieser Zellen wertvolle sowohl in der Generation der funktionalen Pancreatoids sowie auf dem Gebiet der Beta Zellgeneration im allgemeinen informieren.
Die Generation der Pancreatoids entwickeln, die endokrine Zellen, und in der Zukunft das Glukose Reaktionsfähigkeit zu erhalten, hat mögliche Auswirkungen für die Behandlung von Diabetes. Diabetes ist ein heißer Kandidat für regenerative Therapie wie pankreatischen Betazellen verloren oder dysfunktional sind und ersetzen diese Zellen potenziell Erkrankung Komplikationen lindern kann. Fortschritte wurden bei der Unterscheidung von hPSCs in Beta-Zellen, jedoch bei Diabetes, gibt es häufig Störungen auf andere Zellen in der Bauchspeicheldrüse zusammen mit Beta-Zellen, einschließlich alpha-Zellen oder acinar Zellen28,29, 30,31,32. Generierung von neuen Bauchspeicheldrüsen-Gewebe für Transplantationen kann so voll des betroffenen Gewebes ersetzen. Die zusätzliche Untersuchung der murinen Pancreatoid Bildung und Arbeitsweise kann die Entwicklungsstörungen Flugbahn nachgeahmt werden, um menschliche Pancreatoids aus hPSCs zu generieren. Diese menschlichen Pancreatoids kann für die personalisierte Medizin zum Bildschirm für die Reaktionsfähigkeit auf Drogen in einem Patienten-spezifischen Kontext und für regenerative Therapie verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Jolanta Chmielowiec für hilfreiche Diskussion über das Protokoll und das Manuskript. Wir danken auch Benjamin Arenkiel für den Zugriff auf confocal Mikroskop. Diese Arbeit wurde unterstützt von der NIH (P30-DK079638, m.b.) und T32HL092332-13, Buchdrucker und m.b., der McNair Medical Foundation (m.b.) und der konfokalen Kern auf das BCM geistigen and Developmental Disabilities Research Center (NIH U54 HD083092 aus dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
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